基因功能的研究方法

王雪穎 米麗娜 楊錚 陳琪 劉陶迪 周好樂(lè)

·綜述·

基因功能的研究方法

王雪穎 米麗娜 楊錚 陳琪 劉陶迪 周好樂(lè)

隨著后基因組時(shí)代的到來(lái)，如何確定新基因的功能和已知基因的新功能已經(jīng)成為了一個(gè)主要研究方向。現(xiàn)今的研究方法包括生物信息學(xué)預(yù)測(cè)、基因轉(zhuǎn)導(dǎo)、反義技術(shù)等方法，而一些新技術(shù)的涌現(xiàn)，也為研究提供了新思路和新見(jiàn)解。

基因功能；生物信息學(xué)；反義技術(shù)

1986年，美國(guó)諾貝爾獎(jiǎng)獲得者Renato Dulbecco在《Science》上發(fā)表的一篇名為“癌癥研究的轉(zhuǎn)折點(diǎn)——測(cè)定人類(lèi)基因組序列”的短文中首次提出人類(lèi)基因組計(jì)劃(human genome project，HGP)，此后生命科學(xué)逐漸進(jìn)入后基因組時(shí)代。怎樣確定遺傳信息和基因的功能，將是現(xiàn)在乃至未來(lái)研究重點(diǎn)和方向。本文介紹了研究基因功能常用的一些方法以及一些新思路。

1 基因功能的預(yù)測(cè)

結(jié)構(gòu)決定功能是眾所周知的，對(duì)基因功能的研究可以從結(jié)構(gòu)上進(jìn)行合理地預(yù)測(cè)或運(yùn)用生物信息學(xué)方法，再通過(guò)實(shí)驗(yàn)學(xué)方法進(jìn)行驗(yàn)證加以確定。

1.1 從結(jié)構(gòu)方面預(yù)測(cè)基因的功能 核苷酸的排列順序決定了基因的功能，利用DNA或蛋白質(zhì)序列之間的相似性來(lái)推斷基因的功能是第一種進(jìn)行測(cè)試的方法也是迄今為止使用最廣泛的方法。通過(guò)對(duì)蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)進(jìn)行推導(dǎo)和探索，可以推測(cè)該蛋白質(zhì)的功能，為預(yù)測(cè)其基因的功能提供了有價(jià)值的信息以供參考。

1.2 運(yùn)用生物信息學(xué)預(yù)測(cè)基因的功能 生物信息學(xué)(Bioinformatics)是以DNA和蛋白質(zhì)為研究對(duì)象，計(jì)算機(jī)為主要工具，對(duì)DNA和蛋白質(zhì)的序列和結(jié)構(gòu)進(jìn)行提取、加工、分析等。生物信息學(xué)分析是確定在體內(nèi)的DNA和蛋白質(zhì)之間的相互作用的有效途徑，已成為近年來(lái)非常受歡迎的方法[1]。研究人員已用微陣列表達(dá)數(shù)據(jù)、蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域、蛋白-蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)、系統(tǒng)發(fā)生譜來(lái)預(yù)測(cè)基因的功能[2]。孫澤強(qiáng)等[3]利用現(xiàn)有的生物醫(yī)學(xué)文獻(xiàn)和基因組信息來(lái)確定基因之間的功能關(guān)系，開(kāi)發(fā)了一個(gè)基于web的生物信息學(xué)的軟件——基因功能關(guān)系助手(GFRA)。GFRA可發(fā)現(xiàn)基因之間的功能聯(lián)系并將其分類(lèi)。實(shí)現(xiàn)了從文本流和文本庫(kù)中挖掘知識(shí)，鑒定新基因之間的功能關(guān)系，對(duì)于驗(yàn)證和分析由微陣列實(shí)驗(yàn)提出的基因關(guān)聯(lián)有很大幫助。

2 基因的時(shí)空表達(dá)譜分析

基因的時(shí)空表達(dá)譜包括蛋白質(zhì)和mRNA兩個(gè)水平，基因在個(gè)體的不同組織和細(xì)胞中以及不同的發(fā)育階段表達(dá)均不相同，所以在研究基因功能之前，要分析基因的時(shí)空表達(dá)譜[4]。常用的方法有原位雜交、免疫組織化學(xué)、蛋白印跡技術(shù)、實(shí)時(shí)PCR技術(shù)等。

3 基因功能的實(shí)驗(yàn)學(xué)方法

基因功能的實(shí)驗(yàn)學(xué)方法既可以研究基因功能，也可以對(duì)預(yù)測(cè)后的基因加以驗(yàn)證。

3.1 基因轉(zhuǎn)導(dǎo) 要了解一個(gè)基因有何功能，可以通過(guò)基因轉(zhuǎn)導(dǎo)(gene transduction)方法把目的基因有效安全地導(dǎo)入到靶細(xì)胞中，繼而觀察這個(gè)基因在細(xì)胞中的表達(dá)，此方法可分為利用非病毒的轉(zhuǎn)導(dǎo)方法和利用病毒的轉(zhuǎn)導(dǎo)方法。非病毒基因轉(zhuǎn)導(dǎo)要比病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)方法安全，但其在組織中的表達(dá)是暫時(shí)的?？梢酝ㄟ^(guò)DNA直接注射、脂質(zhì)體介導(dǎo)DNA或受體介導(dǎo)，將目的基因轉(zhuǎn)入到細(xì)胞中。而在病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)方法中多種病毒對(duì)哺乳動(dòng)物細(xì)胞具有很強(qiáng)的感染能力，并能在宿主細(xì)胞內(nèi)復(fù)制表達(dá)。利用這一特性，選擇某些對(duì)人體無(wú)害的病毒，通過(guò)DNA重組技術(shù)，構(gòu)建病毒載體。病毒方法導(dǎo)入基因的效率一般高于非病毒方法。

3.2 人工染色體的轉(zhuǎn)導(dǎo) 在常用的酵母人工染色體(YACs)、細(xì)菌人工染色體(BACs)等基礎(chǔ)上研究出一種全新的載體系統(tǒng)——人類(lèi)人工染色體(human artificial chromosomes，HACs)。HACs由著絲粒、端粒和復(fù)制起點(diǎn)組成，其作為載體則可以攜帶基因的所有外顯子或多個(gè)基因以及完整基因和附近調(diào)控區(qū)的大片段DNA，從而將目的基因調(diào)控序列一并導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)，避免了整合到人其他染色體的可能及位置效應(yīng)，大大提高了基因治療的有效性和安全性，不存在大小上限的DNA克隆到HAC——整個(gè)基因組座位與所有調(diào)節(jié)元件都可以使用[5]。HACs對(duì)于功能基因組學(xué)，基因治療和合成生物學(xué)其代表了一個(gè)新的有前景的游離基因系統(tǒng)[6]。

3.3 基因編輯新技術(shù) 基因編輯新技術(shù)是指經(jīng)過(guò)人工改造的核酸酶介導(dǎo)的基因組編輯技術(shù)(genome editing with engineered nucleases)，也稱(chēng)RNA引導(dǎo)性基因編輯技術(shù)[7]。其主要有類(lèi)轉(zhuǎn)錄激活因子效應(yīng)物核酸酶(transcription activator-like effector nuclease，TALEN)、鋅指核酸內(nèi)切酶(zinc finger endonuclease，ZFN)和RNA引導(dǎo)的CRISPR-Cas9核酸酶技術(shù)(CRISPR-Cas9 RGNs)。

3.3.1 TALEN TALE來(lái)自于植物黃單胞菌(Xanthomonas)，是具有轉(zhuǎn)錄激活功能的蛋白。宿主基因啟動(dòng)子區(qū)的相應(yīng)核苷酸序列與其DNA結(jié)構(gòu)域進(jìn)行特異性結(jié)合，從而激活基因表達(dá)。TALEN技術(shù)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于細(xì)胞、酵母、斑馬魚(yú)與大鼠等各類(lèi)研究對(duì)象[8]。

3.3.2 ZFN ZFN有與TALEN截然不同的DNA識(shí)別和結(jié)合域。ZFN由鋅指蛋白(zinc finger protein，ZFP)和FokⅠ核酸內(nèi)切酶組成，ZFN與相應(yīng)的FokⅠ域形成異源二聚體，從而使FokⅠ域激活，催化DNA雙鏈在特定位點(diǎn)斷裂，再根據(jù)模板決定采用同源重組機(jī)制來(lái)修復(fù)斷裂或非同源末端連接的方法。迄今為止，ZFN已被用于靶向許多基因在不同的生物體，例如大鼠、小鼠、斑馬魚(yú)、果蠅、玉米等生物的細(xì)胞在人體外培養(yǎng)細(xì)胞系中成功地實(shí)現(xiàn)了內(nèi)源基因的定點(diǎn)突變[9]。

3.3.3 CRISPR-Cas9 RGNs 通過(guò)一段短的引導(dǎo)RNA(guide RNA)來(lái)識(shí)別特定的DNA序列，改變這段引導(dǎo)RNA序列即可使Cas9定位到新的DNA序列上。使DNA結(jié)構(gòu)域與不同轉(zhuǎn)錄調(diào)控蛋白結(jié)合，從而對(duì)特定基因的轉(zhuǎn)錄激活或抑制[10-11]。此方法具有操作簡(jiǎn)單、特異性高的特點(diǎn)，已成為當(dāng)下的研究熱點(diǎn)。

3.4 反義技術(shù) 反義技術(shù)(antisense techniques)是根據(jù)堿基互補(bǔ)原理，干擾DNA雙鏈的解螺旋、復(fù)制、轉(zhuǎn)錄以及mRNA的剪接加工和翻譯等各個(gè)階段。包括反義寡核苷酸(Antisense oligonucleotides，ASON)技術(shù)、核酶(Ribozyme)技術(shù)和小RNA干擾(small interfering，siRNA)技術(shù)。

3.4.1 反義寡核苷酸技術(shù) 利用基因重組技術(shù)，遵循堿基互補(bǔ)配對(duì)原則，通過(guò)構(gòu)建人工表達(dá)載體，對(duì)基因表達(dá)的多個(gè)環(huán)節(jié)進(jìn)行干擾，從而調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長(zhǎng)分化過(guò)程。與其他基因或蛋白抑制劑相比，反義寡核苷酸具有特異性高、抑制基因范圍廣以及抑制靶基因程度可調(diào)控等獨(dú)特的優(yōu)點(diǎn)。

3.4.2 核酶技術(shù) 核酶是具有催化功能的小分子RNA，又稱(chēng)催化性RNA。具有酶的活性，可催化特定的RNA降解。核酶技術(shù)就是利用核酶特有的催化活性，通過(guò)堿基配對(duì)原則，滅活特異性靶RNA分子。其空間結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，所以催化效率比反義寡核苷酸高[12]。常見(jiàn)的核酶形態(tài)有三種：錘頭狀、發(fā)夾狀和斧頭狀。

3.4.3 小RNA干擾技術(shù) siRNA是細(xì)胞內(nèi)一類(lèi)雙鏈RNA在特定情況下通過(guò)一定酶切機(jī)制，轉(zhuǎn)變?yōu)榫哂刑囟ㄐ蛄械男∑蜶NA。siRNA與一些蛋白質(zhì)RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合物(RNA-Induced silencing complex，RISC)，與特異性靶mRNA結(jié)合使其降解，阻斷翻譯過(guò)程。siRNA能夠通過(guò)RNA干擾(RNAi)途徑催化沉默特定的基因，是有吸引力的備選治療方法，適用于大多數(shù)疾病，包括遺傳疾病和癌癥[13]。它可以用來(lái)抑制體外和體內(nèi)特定基因的表達(dá)，具有特異、高效、穩(wěn)定性強(qiáng)、操作簡(jiǎn)便等特點(diǎn)[14]。Beronja等[15]開(kāi)發(fā)了用于皮膚RNAi介導(dǎo)的基因功能分析的方法，它采用超聲引導(dǎo)在9只胚胎期小鼠子宮羊膜腔微量注射慢病毒載體，使其快速、有效和穩(wěn)定的轉(zhuǎn)導(dǎo)到小鼠皮膚上。這個(gè)技術(shù)不需要?jiǎng)游锝慌?，在操作和和表型分析之間可能只需要短短幾天的時(shí)間，用最簡(jiǎn)單的形式，比如說(shuō)通過(guò)shRNA介導(dǎo)的基因敲除的單基因功能分析。他們的技術(shù)極大地?cái)U(kuò)展了在表皮生物學(xué)中存在的突出問(wèn)題的全面功能檢查。

3.5 微陣列分析 微陣列(microarray)是近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的一項(xiàng)研究基因功能的新技術(shù)。指的是由許多DNA樣品或寡核苷酸，密集排列于玻片、硅片或尼龍膜等固相支持物上與模板進(jìn)行雜交，通過(guò)計(jì)算機(jī)獲取圖像信息從而進(jìn)行分析處理。采用微陣列技術(shù)，可以對(duì)生物體在不同的生長(zhǎng)發(fā)育階段或不同的生理狀態(tài)下DNA或RNA表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè)，隨著分子生物學(xué)的進(jìn)步，微陣列已成為探查人類(lèi)復(fù)雜疾病的重要資源，可用于快速檢測(cè)大規(guī)模DNA序列多態(tài)性、基因組表達(dá)譜、基因差異表達(dá)、疾病相關(guān)基因[16-17]。

3.6 單倍體胚胎干細(xì)胞研究 單倍體胚胎干細(xì)胞(Haploid embryonic stem cells，haESCs)是一種對(duì)胚胎干細(xì)胞新的應(yīng)用方式。由于單倍體細(xì)胞僅含有單套染色體，適合于基因分析，且haESC擁有在體外無(wú)限增殖，并可以分化成多種功能細(xì)胞、組織以及器官的細(xì)胞類(lèi)群的特性[18-19]。研究人員通過(guò)對(duì)單倍體胚胎干細(xì)胞中的某些基因進(jìn)行修飾，從而研究特定基因在受精過(guò)程中的功能[20]。這些單倍體胚胎干細(xì)胞的明顯特征使自己不僅成為了在細(xì)胞水平上對(duì)基因篩查的有價(jià)值的工具，而且也作為一種研究哺乳動(dòng)物基因功能新的理想工具[21]。

HaESC可分為孤雄單倍體胚胎干細(xì)胞(androgenetic haploid mbrvonic stem cell，AG-haESC)和孤雌單倍體胚胎干細(xì)胞(parthenogenetic haploid embryonic stem cell，PG-haESC)。在幾年前Elling U等[22]和Leeb M等[23]用不同的方法建立了小鼠孤雌胚胎源單倍體胚胎干細(xì)胞系；而Yang H等[24]建立了孤雄單倍體干細(xì)胞系，采用了去除受精卵中的雌原核和向去核的卵母細(xì)胞中注射成熟精子的頭部2種不同的方法，從此開(kāi)啟了關(guān)于多種細(xì)胞及發(fā)育過(guò)程基因有效功能學(xué)篩選的相關(guān)研究。隨著haESC的研究?jī)r(jià)值逐步提高，涌現(xiàn)了越來(lái)越多關(guān)于它的研究成果，比如，利用基因修飾獲得的haESC的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。Monfort A等[25]利用單倍體小鼠胚胎干細(xì)胞(ESCs)使X染色體失活，從而識(shí)別出哪些基因的表達(dá)是需要X染色體抑制的。進(jìn)一步證明了haESC不僅在遺傳篩查中發(fā)揮作用，更說(shuō)明了其在基因功能研究方面的價(jià)值。

4 展望

基因功能的研究方法是我們研究疾病的重要途徑之一。本文所介紹的方法各有優(yōu)良，但相輔相成。隨著研究的不斷發(fā)展和深入，我們不僅要完善現(xiàn)有的方法，而且要繼續(xù)發(fā)展、探索一些新技術(shù)?；蜃鳛槿祟?lèi)傳承的根本，是人類(lèi)生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中不可缺少的一部分，更在人類(lèi)的疾病、衰老和死亡過(guò)程中發(fā)揮著功能。但人體中的基因數(shù)以千萬(wàn)，大多數(shù)基因的功能尚未發(fā)現(xiàn)，如何揭開(kāi)它的神秘面紗，就需要更多更新的方法來(lái)幫助研究人員全面了解基因如何在體內(nèi)發(fā)揮功能以及相互協(xié)調(diào)，進(jìn)而探索出人類(lèi)生老病死的奧秘。

[1]Conley AB，Jordan IK.Identification of Transcription Factor Binding Sites Derived from Transposable Element Sequences Using ChIP-seq[J].Methods Mol Biol，2010(674)：225-240.

[2]Phuong T，Nhung N.Predicting gene function using similarity learning[J].BMC Genomics，2013，14(Suppl 4)：S4.

[3]孫澤強(qiáng)，謝紅薇，郝曉燕.NMF模型在挖掘基因功能關(guān)系中的研究與應(yīng)用[J].計(jì)算機(jī)工程與設(shè)計(jì)，2014，35(4)：1471-1475.

[4]杜玉梅，左正宏.基因功能研究方法的新進(jìn)展[J].生命科學(xué)，2008，20(4)：589-592.

[5]Kim JH，Kononenko A，Erliandri I，et al.Human artificial chromosome(HAC)vector with a conditional centromere for correction of genetic deficiencies in human cells[J].Proc Natl Acad Sci USA，2011，108(50)：20048-20053.

[6]Kouprina N，Samoshkin A，Erliandri I，et al.Organization of synthetic alphoid DNA array in human artificial chromosome(HAC)with a conditional centromere[J].ACS Synth Biol，2012，1(12)：590-601.

[7]劉蓓，尉瑋，王麗華.基因編輯新技術(shù)研究進(jìn)展[J].亞熱帶農(nóng)業(yè)研究，2013，9(4)：262-269.

[8]Qiu Z，Liu M，Chen Z，et al.High-efficiency and heritable gene targeting in mouse by transcription activator-like effector nucleases[J].Nucleic Acids Res，2013，41(11)：e120.

[9]Carroll D.Genome engineering with zinc-finger nucleases[J].Genetics，2011，188(4)：773-782.

[10]Konermann S，Brigham MD，Trevino AE，et al.Optical control of mammalian endogenous transcription and epigenetic states[J].Nature，2013，500(7463)：472-476.

[11]Mendenhall EM，Williamson KE，Reyon D，et al.Locus-specific editing of histone modifications at endogenous enhancers[J].Nat Biotechnol，2013，31(12)：1133-1136.

[12]Gilles AF，Averof M.Functional genetics for all：engineered nucleases，CRISPR and the gene editing revolution[J].Evodevo，2014(5)：43.

[13]鄭小梅，張曉立，于建東，等.CRISPR-Cas9介導(dǎo)的基因組編輯技術(shù)的研究進(jìn)展[J].生物技術(shù)進(jìn)展，2015，5(1)：1-9.

[14]Gooding M，Adigbli D，Edith Chan AW，et al.A Bifurcated Proteoglycan Binding Small Molecule Carrier for siRNA Delivery[J].Chem Biol Drug Des，2014，84(1)：24-35.

[15]Beronja S，F(xiàn)uchs E.RNAi-mediated gene function analysis in skin[J].Methods Mol Biol，2013(961)：351-361.

[16]Liu YJ，Zhang JY.Time-series microarray data simulation modeled with a case-control label[J].Genet Mol Res，2016，15(2)：91.

[17]Huggins CE，Domenighetti AA，Ritchie ME，et al．Functional and metabolic remodeling in GLUT4-deficient hearts confers hyper-responsiveness to substrate intervention[J].J Mol Cell Cardiol，2008，44(2)：270-280.

[18]羅小梅，張玉，師少軍.基因生物學(xué)功能分析與應(yīng)用研究進(jìn)展[J].中國(guó)藥師，2014，17(8)：1343-1347.

[19]Horii T，Morita S，Kimura M，et al.Genome engineering of mammalian haploid embryonic stem cells using the Cas9/RNA system[J].Peer J，2013，1(1)：230.

[20]趙海龍，趙永聚，楊麗群，等.哺乳動(dòng)物單倍體胚胎干細(xì)胞研究進(jìn)展與展望[J].畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2013，44(9)：1342-1348.

[21]Shuai L，Zhou Q.Haploid embryonic stem cells serve as a new tool for mammalian genetic study[J].Stem Cell Res The，2014，5(1)：20.

[22]Elling U，Taubenschmid J，Wirnsberger G，et al.Forward and reverse genetics through derivation of haploid mouse embryonic stem cells[J].Cell Stem Cell，2011，9(6)：563-574.

[23]Leeb M，Wutz A.Derivation of haploid embryonic stem cells from mouse embryos[J].Nature，2011，479(7371)：131-134.

[24]Yang H，Shi L，Wang BA，et al.Generation of genetically modified mice by oocyte injection of androgenetic haploid embryonic stem cells[J].Cell，2012，149(3)：605-617.

[25]Monfort A，Di Minin G，Postlmayr A，et al.Identification of Spen as a Crucial Factor for Xist Function through Forward Genetic Screening in Haploid Embryonic Stem Cells[J].Cell Rep，2015，12(4)：554-561.

With the advent of the post-genomic era，it has become a major research direction to determine the unknown functions of the new genes and the new functions of the known genes.The current research methods include bioinformatics prediction，gene transduction，antisense technology，and so on.Meanwhile，the emergence of other new technologies provides some new ideas and insights for the related studies.

Gene function；Bioinformatics；Antisense technology

2016-07-06)

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(81260111)；內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)中青年人才團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目(NYTD-2015003)

1005-619X(2017)02-0131-03

10.13517/j.cnki.ccm.2017.02.007

010100 內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)心身醫(yī)學(xué)研究室

劉陶迪，周好樂(lè)