電針對不同階段SAMP8小鼠學(xué)習(xí)記憶能力及海馬區(qū)突觸素和突觸后致密物-95表達(dá)的影響

趙恩聰　鄭家勇　郭婉清　洪苗苗　林嵐　王豐　董衛(wèi)國

摘要：目的??觀察電針對不同階段SAMP8小鼠學(xué)習(xí)記憶能力及海馬區(qū)突觸素（SYN）和突觸后致密物-95（PSD-95）表達(dá)的影響，探討電針治療阿爾茨海默病的最佳時(shí)機(jī)。方法??SAMP8小鼠48只隨機(jī)分成模型組、3月齡電針組、6月齡電針組和9月齡電針組，每組12只，同齡正常老化SAMR1小鼠12只為對照組。電針組均選取“百會(huì)”“大椎”“腎俞”，電針頻率為2?Hz，每日1次，8?d為1個(gè)療程，每個(gè)療程間隔2?d，共3個(gè)療程。運(yùn)用Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)檢測小鼠學(xué)習(xí)記憶能力，免疫組化和Western?blot檢測海馬突觸相關(guān)蛋白SYN和PSD-95的表達(dá)。結(jié)果??與對照組比較，模型組小鼠逃避潛伏期明顯延長，原平臺(tái)象限停留時(shí)間明顯縮短，跨越原平臺(tái)次數(shù)明顯減少，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05，P<0.01），海馬區(qū)SYN和PSD-95蛋白表達(dá)明顯下降（P<0.01）;與模型組比較，各電針組小鼠逃避潛伏期明顯縮短，原平臺(tái)象限停留時(shí)間明顯延長，跨越原平臺(tái)次數(shù)明顯增加，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05，P<0.01），海馬區(qū)SYN和PSD-95蛋白表達(dá)均明顯升高（P<0.01），且均以3月齡電針組最顯著（P<0.05，P<0.01）。結(jié)論??電針能提高SAMP8小鼠學(xué)習(xí)記憶能力，促進(jìn)海馬區(qū)SYN、PSD-95蛋白的表達(dá)，改善突觸功能。

關(guān)鍵詞：阿爾茨海默病;電針;學(xué)習(xí)記憶;突觸素;突觸后致密物-95;SAMP8小鼠

中圖分類號：R245????文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A????文章編號：1005-5304（2020）03-0048-05

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.201908294

Effects?of?Electroacupuncture?on?Learning?and?Memory?Ability?and?Expressions?of?Hippocampal?Synaptophysin?and?PSD-95?in?SAMP8?Mice?at?Different?Stages

ZHAO?Encong1，?ZHENG?Jiayong2，?GUO?Wanqing3，?HONG?Miaomiao1，?LIN?Lan4，?WANG?Feng4，?DONG?Weiguo4

1.?College?of?Acupuncture?and?Moxibustion，?Fujian?University?of?Traditional?Chinese?Medicine，?Fuzhou?350122，?China;?2.?College?of?Traditional?Chinese?Medicine，?Fujian?University?of?Traditional?Chinese?Medicine，?Fuzhou?350122，?China;?3.?The?Third?Peoples?Hospital?of?Fujian?Province，?Fuzhou?350108，?China;?4.?College?of?Integrated?Chinese?and?Western?Medicine，?Fujian?University?of?Traditional?Chinese?Medicine，?Fuzhou?350122，?China

Abstract：?Objective?To?observe?the?effects?of?electroacupuncture?on?learning?and?memory?ability?and?expressions?of?synaptophysin?（SYN）?and?postsynaptic?density-95?（PSD-95）?in?the?hippocampus?of?SAMP8?mice?at?different?stages;?To?explore?the?optimal?time?of?electroacupuncture?in?the?treatment?of?Alzheimer?disease?（AD）.?Methods?Totally?48?SAMP8?mice?were?randomly?divided?into?model?group，?3-month-old?electroacupuncture?group，?6-month-old?electroacupuncture?group?and?9-month-old?electroacupuncture?group，?with?12?mice?in?each?group.?12?SAMR1?mice?of?the?same?age?and?normal?aging?were?set?as?control?group.?In?the?electroacupuncture?group，?Baihui?（GV20），?Dazhui?（GV14）?and?Shenshu?（BL23）?acupoints?were?selected.?The?electroacupuncture?frequency?was?2?Hz，?once?a?day，?and?8?days?was?a?course?of?treatment，?with?a?course?interval?of?2?days.?There?were?3?courses?of?treatment?in?total.?Morris?water?maze?experiment?was?used?to?test?the?learning?and?memory?ability?of?mice?in?each?group，?and?the?expression?of?hippocampal?synapse?related?proteins?SYN?and?PSD-95?was?measured?by?immunohistochemistry

and?Western?blot.?Results?Compared?with?the?control?group，?the?escape?latency?of?the?model?group?was?significantly?prolonged，?the?residence?time?of?the?original?platform?quadrant?was?significantly?shortened，?and?the?number?of?crossing?the?original?platform?was?significantly?reduced，?with?statistical?significance?（P<0.05，?P<0.01）.?The?expression?of?SYN?and?PSD-95?protein?in?hippocampus?of?model?group?significantly?decreased?（P<0.01）.?Compared?with?the?model?group，?the?escape?latency?of?the?mice?in?each?electroacupuncture?group?was?significantly?shortened，?the?residence?time?of?the?original?platform?quadrant?was?significantly?prolonged，?and?the?number?of?crossing?the?original?platform?significantly?increased，?with?statistical?significance?（P<0.05，?P<0.01）.?The?expressions?of?SYN?and?PSD-95?protein?in?hippocampus?of?mice?in?each?electroacupuncture?group?significantly?increased?（P<0.05，?P<0.01），?and?were?most?significant?in?the?3-month-old?electroacupuncture?group?（P<0.01）.?Conclusion?Electroacupuncture?can?improve?the?learning?and?memory?ability?of?SAMP8?mice，?promote?the?expressions?of?SYN?and?PSD-95?in?the?hippocampus，?and?improve?the?synaptic?function.

Keywords：?Alzheimer?disease;?electroacupuncture;?learning?and?memory;?synaptophysin;?postsynaptic?density-95;?SAMP8?mice

阿爾茨海默病（Alzheimer?disease，AD）是一種起病隱匿且與年齡相關(guān)的退行性神經(jīng)系統(tǒng)疾病，主要表現(xiàn)為進(jìn)行性認(rèn)知功能退化、記憶喪失和行為障礙等。其早期突出的病理特征為神經(jīng)元的丟失與突觸損傷[1-2]。近年來，突觸功能在AD防治中備受重視，保持突觸的穩(wěn)態(tài)平衡可能是AD治療的新策略[3]。研究表明，電針能增強(qiáng)SAMP8小鼠突觸功能[4-5]，但目前關(guān)于電針治療AD時(shí)機(jī)的研究報(bào)道較少。故本實(shí)驗(yàn)對3、6、9個(gè)月不同月齡SAMP8小鼠進(jìn)行電針治療，運(yùn)用Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)檢測小鼠學(xué)習(xí)記憶能力，免疫組化和Western?blot檢測與突觸可塑性密切相關(guān)的突觸素（synaptophysin，SYN）和突觸后致密物-95（postsynaptic?density-95，PSD-95）的表達(dá)，從突觸可塑性角度探討電針治療AD的時(shí)機(jī)。

1??實(shí)驗(yàn)材料

1.1??動(dòng)物

SAMP8小鼠48只及SAMR小鼠12只，3月齡，雄性，體質(zhì)量20～25?g，北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部（實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)部），動(dòng)物許可證號SCXK（京）2011-0012。飼養(yǎng)于福建中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心SPF級動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室，小鼠購入后均適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，溫度22～24?℃，相對濕度50%～60%，明暗周期12?h，自由攝食飲水。實(shí)驗(yàn)過程嚴(yán)格按國際動(dòng)物保護(hù)及使用指南進(jìn)行，按實(shí)驗(yàn)動(dòng)物3R原則給予人道關(guān)懷。

1.2??主要試劑與儀器

兔單克隆抗體SYN（批號ab32127），Abcam公司;兔多克隆抗體PSD-95（批號18258），Abcam;β-actin（批號20536-1-AP），Proteintech公司;生物素標(biāo)記的羊抗兔IgG、DAB試劑盒，福州邁新生物工程有限公司;Motic?Med?6.0數(shù)碼醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)，Bio-Rad圖像分析系統(tǒng)。G6805-Ⅰ電針治療儀，青島鑫升實(shí)業(yè)有限公司;0.25?mm×15?mm華佗牌無菌針灸針，蘇州醫(yī)療用品廠有限公司。

2??實(shí)驗(yàn)方法

2.1??分組及干預(yù)

將48只SAMP8小鼠隨機(jī)分為模型組、3月齡電針組、6月齡電針組和9月齡電針組，每組12只，另取12只SAMR1小鼠作為對照組。電針組采用自制網(wǎng)兜固定小鼠，選取“百會(huì)”“大椎”“腎俞”，參照《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》[6]取穴。“百會(huì)”位于小鼠頂骨正中，“大椎”位于背部第7頸椎與第1胸椎間，“腎俞”位于第2腰椎下兩旁。操作方法：“百會(huì)”向前斜刺2?mm，“大椎”向下斜刺2～3?mm，“腎俞”稍向內(nèi)斜刺3～4?mm，其中“大椎”“腎俞”給予電針刺激，“腎俞”雙側(cè)隔日交替。連續(xù)波，頻率2?Hz，電流強(qiáng)度以引起小鼠后肢肌肉輕微顫動(dòng)而不嘶叫為宜。每次20?min，每日1次，8?d為1個(gè)療程，每個(gè)療程間隔2?d，共3個(gè)療程。全部小鼠由3月齡飼養(yǎng)至9月齡，模型組和對照組除不進(jìn)行電針治療，其余抓取和固定方式相同，水迷宮實(shí)驗(yàn)后統(tǒng)一取材。

2.2??Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)

治療結(jié)束后，均在10月齡運(yùn)用Morris水迷宮視頻分析系統(tǒng)檢測小鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力。定位航行實(shí)驗(yàn)：將平臺(tái)置于第三象限中間，水面高于平臺(tái)約1?cm，分別從4個(gè)象限筒壁中點(diǎn)放入小鼠，記錄小鼠90?s內(nèi)找到平臺(tái)時(shí)間，即為逃避潛伏期，連續(xù)記錄5?d?？臻g探索實(shí)驗(yàn)：第6日撤掉平臺(tái)，將小鼠從第一象限放入，記錄90?s內(nèi)小鼠跨越原平臺(tái)時(shí)間及次數(shù)。

2.3??免疫組化檢測突觸素和突觸后致密物-95蛋白表達(dá)

每組取6只小鼠，麻醉后灌流固定。取全腦修塊后放入4%多聚甲醛內(nèi)，固定24～48?h。將腦組織石蠟包埋，切片，制片。分別加入SYN抗體（1∶700）和PSD-95抗體（1∶200），濕盒孵育過夜。加入生物素標(biāo)記的羊抗兔IgG二抗，DAB顯色，封片。用PBS代替一抗作陰性對照。鏡下觀察每張玻片海馬CA1區(qū)3個(gè)陽性染色區(qū)域，以棕黃色作為陽性判斷標(biāo)準(zhǔn)，在同一光源、光圈、色彩飽和度和對比度等相同條件下，拍照采集圖片。用Motic?Med?6.0數(shù)碼醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)對海馬CA1區(qū)SYN及PSD-95圖片進(jìn)行分析，計(jì)算SYN及PSD-95的平均光密度（MOD）值。

2.4??Western?blot檢測突觸素和突觸后致密物-95蛋白表達(dá)

每組取6只小鼠進(jìn)行麻醉，灌注后快速斷頭取腦，分離出完整海馬，-80?℃保存，稱海馬濕重，裂解后取上清液，BCA法測上清液濃度。蛋白樣品用10%SDS-PAGE進(jìn)行電泳，300?mA轉(zhuǎn)蛋白質(zhì)至PVDF膜上。封閉2?h后，加入SYN抗體（1∶8000）、PSD-95抗體（1∶1000）、抗小鼠β-actin（1∶1000），4?℃孵育過夜，TBST洗滌;加入二抗（山羊抗兔IgG，1∶10?000），室溫孵育2?h，TBST洗滌。配制顯色液并覆PVDF膜1?min后進(jìn)行圖像掃描，Bio-Rad圖像分析系統(tǒng)分析。以β-actin為內(nèi)參，計(jì)算目的蛋白相對灰度。

3??統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以x（—）±s表示，水迷宮定位航行空間探索結(jié)果采用重復(fù)測量方差分析，其他結(jié)果采用方差分析，組間比較采用LSD法。P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

4??結(jié)果

4.1??Morris?水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果

與對照組比較，模型組小鼠逃避潛伏期明顯延長，原平臺(tái)象限停留時(shí)間明顯縮短，跨越原平臺(tái)次數(shù)明顯減少，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05，P<0.01）;與模型組比較，各電針組逃避潛伏期縮短，原平臺(tái)象限停留時(shí)間延長，跨越原平臺(tái)次數(shù)增加，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05，P<0.01）;與9月齡電針組比較，6月齡電針組逃避潛伏期縮短，原平臺(tái)象限停留時(shí)間延長，跨越原平臺(tái)次數(shù)增加（P<0.05）;與6月齡電針組比較，3月齡電針組逃避潛伏期明顯縮短，原平臺(tái)象限停留時(shí)間明顯延長，跨越原平臺(tái)次數(shù)明顯增加（P<0.05，P<0.01）。結(jié)果見圖1、表1和表2。

4.2??免疫組化染色結(jié)果

SYN主要表達(dá)于海馬CA1區(qū)神經(jīng)元細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)，PSD-95主要表達(dá)于神經(jīng)元細(xì)胞膜。與對照組比較，模型組小鼠SYN和PSD-95陽性表達(dá)均明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）;與模型組比較，各電針組MOD值均明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05，P<0.01），且3月齡電針組MOD值明顯高于6月齡和9月齡電針組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。結(jié)果見圖2～圖4。

4.3??Western?blot檢測結(jié)果

與對照組比較，模型組小鼠SYN和PSD-95蛋白表達(dá)顯著降低（P<0.01）;與模型組比較，各電針組小鼠SYN和PSD-95蛋白表達(dá)均明顯升高（P<0.05，P<0.01），且3月齡電針組SYN與PSD-95表達(dá)量明顯高于6月齡和9月齡電針組（P<0.01）。結(jié)果見圖5。

5??討論

AD屬中醫(yī)學(xué)“癡呆”“呆證”范疇，其病機(jī)為腎精虧虛、髓海不足、腦失所養(yǎng)，治療以補(bǔ)腎益髓、開竅醒腦為主?！夺t(yī)經(jīng)精義》云：“事物之所以不忘，賴此記性，記在何處，則在腎精。益腎生精化為髓而之于腦中。”《醫(yī)林改錯(cuò)·腦髓說》述：“小兒無記性者，腦髓未滿;年高無記性者，腦髓漸空。”均明確指出腎精化髓、髓上輸腦是記憶的物質(zhì)基礎(chǔ)?！峨s病源流犀燭》有“督脈為精氣升降之道路”，故督脈是腎氣精微輸布于腦的關(guān)鍵通道，具有調(diào)節(jié)機(jī)體意志精神和增強(qiáng)思維活動(dòng)的重要作用。百會(huì)屬督脈，深處為腦，有益智健腦、開竅醒神之功。大椎為督脈要穴，又與手足六陽經(jīng)交會(huì)，具有通督開竅、振陽升清、調(diào)神醒腦的功效。腎俞屬足太陽膀胱經(jīng)，相表里于足少陰腎經(jīng)，可補(bǔ)腎益髓、益氣調(diào)督。百會(huì)、大椎、腎俞三穴配伍，以達(dá)醒腦開竅、益腎調(diào)督之效。研究表明，針刺“百會(huì)”“腎俞”能有效減少AD模型老年斑聚集，益腎調(diào)督法可調(diào)節(jié)炎癥因子失衡狀態(tài)，有效改善AD炎癥反應(yīng)[7-8]。上述文獻(xiàn)與課題組前期研究[4-5，9]均證實(shí)益腎調(diào)督法對AD有良好療效。

研究表明，AD早期出現(xiàn)的認(rèn)知障礙與突觸功能受損及突觸丟失密切相關(guān)[2，10]。SYN是一種特異性存在于突觸囊泡膜上的鈣結(jié)合糖蛋白，可反映突觸的分布和密度，SYN磷酸化可影響突觸功能，SYN通過調(diào)節(jié)軸突和樹突的分化及生長，影響突觸結(jié)構(gòu)，是研究突觸可塑性的重要指標(biāo)。PSD-95是突觸后膜致密區(qū)上一種支架蛋白。PSD-95可簇集谷氨酸受體和NMDA受體，影響遞質(zhì)傳遞，同時(shí)還參與突觸的連接和維持，進(jìn)而影響突觸可塑性。突觸是信息傳遞的樞紐及功能蛋白的密集之地。突觸可塑性是神經(jīng)可塑性最主要的形式，是學(xué)習(xí)和記憶的神經(jīng)生物學(xué)基礎(chǔ)。姚柏春等[10]發(fā)現(xiàn)，Aβ可誘導(dǎo)大鼠海馬SYN含量減少，隨之突觸密度和突觸聯(lián)系也出現(xiàn)下降，進(jìn)而導(dǎo)致遞質(zhì)傳遞發(fā)生障礙。Migaud等[11]研究顯示，小鼠PSD-95基因被敲除后，其大腦神經(jīng)元突觸長時(shí)程增強(qiáng)作用發(fā)生變化，小鼠學(xué)習(xí)記憶出現(xiàn)功能性障礙。可見，海馬SYN、PSD-95蛋白表達(dá)水平與突觸可塑性關(guān)系密切。

本研究以快速老化模型小鼠亞系SAMP8小鼠為AD模型，設(shè)計(jì)3月齡、6月齡、9月齡電針組，分別代表AD早期、中期、晚期3個(gè)階段。SAMP8模型廣泛用于AD研究，其特點(diǎn)是4～5月齡開始出現(xiàn)認(rèn)知損害及行為異常，6月齡SAMP8小鼠腦內(nèi)海馬區(qū)即有大量Aβ異常沉積，并隨月齡增加損傷進(jìn)一步加重[12]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，各電針組均能上調(diào)SYN和PSD-95蛋白的表達(dá)，提示電針能增強(qiáng)突觸功能，這可能是改善SAMP8小鼠學(xué)習(xí)記憶能力的機(jī)制。且電針治療越早，海馬SYN、PSD-95表達(dá)水平越高，提示電針對AD的改善程度與治療時(shí)機(jī)相關(guān)，早期療效優(yōu)于中期和晚期。

中醫(yī)“治未病”思想源于《黃帝內(nèi)經(jīng)》，形成于《傷寒雜病論》。對AD診治的指導(dǎo)思想是“疾病未生、疾病未發(fā)”之時(shí)，本質(zhì)與現(xiàn)代醫(yī)學(xué)“早預(yù)防、早診斷、早治療”的原則相統(tǒng)一。2011年提出的NIA-AA標(biāo)準(zhǔn)，將AD分為3個(gè)階段，即無癥狀臨床前AD階段、癡呆前有癥狀階段及癡呆階段[13]。臨床事實(shí)證明，一旦AD進(jìn)入輕度認(rèn)知損害階段，就會(huì)發(fā)生不可逆轉(zhuǎn)的認(rèn)知損害，只有早于輕度認(rèn)知損害階段疾病干預(yù)才有價(jià)值[14]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，3月齡即早期電針組治療AD療效最優(yōu)，此結(jié)果契合中醫(yī)“治未病”理論。

綜上所述，AD早期電針介入能明顯改善SAMP8小鼠學(xué)習(xí)記憶能力，提高海馬SYN、PSD-95蛋白的表達(dá)水平，改善突觸功能，其療效優(yōu)于AD中、晚期電針治療。這一結(jié)果為電針治療AD時(shí)機(jī)的選擇提供了思路，而關(guān)于早期介入電針療效優(yōu)于中、晚期的作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

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（收稿日期：2019-08-20）

（修回日期：2019-09-20;編輯：華強(qiáng)）