下頜前導(dǎo)后大鼠髁突軟骨Runx2的表達(dá)研究

秦波 王小玲 徐衛(wèi)華

(貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院口腔正畸科，貴州 貴陽 550004)

?

下頜前導(dǎo)后大鼠髁突軟骨Runx2的表達(dá)研究

秦波 王小玲 徐衛(wèi)華△

(貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院口腔正畸科，貴州 貴陽 550004)

目的 觀察大鼠下頜持續(xù)功能前導(dǎo)后髁突軟骨中Runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2(Runx2)的表達(dá)，探討Runx2在大鼠下頜前導(dǎo)后髁突軟骨不同部位改建中可能發(fā)揮的作用。方法 40只35 D齡雄性SD大鼠隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組和對照組，各為20只，實(shí)驗(yàn)組大鼠24 h戴自制功能性矯治器引導(dǎo)下頜前伸，對照組不做處理，在試驗(yàn)后第3、7、14、28天時(shí)每組處死大鼠5只，采用免疫組化方法觀察髁突軟骨中Runx2的表達(dá)情況。結(jié)果 實(shí)驗(yàn)組Runx2的表達(dá)在實(shí)驗(yàn)后第7、14、28天與對照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；實(shí)驗(yàn)組髁突后部區(qū)域Runx2的表達(dá)與前部和中部比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論 Runx2可能參與了下頜骨髁狀突骨改建過程；下頜前導(dǎo)后髁突軟骨不同部位軟骨的改建可能不同。

髁突軟骨； 下頜前導(dǎo)； Runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2

髁突軟骨在髁突表面，是一種特殊形式的結(jié)締組織，不包含神經(jīng)纖維、血管和淋巴管，是整個(gè)下頜骨的生長和發(fā)育的中心。髁突的生長改建直接影響下頜的形態(tài)和功能。Runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2(runt-related transcription factor 2，Runx2)又稱核心結(jié)合因子α1(core-binding factorα1．CBFA1),Runt相關(guān)基因Runx家族蛋白由Runx1、Runx2和 Runx3組成，其共同特點(diǎn)是在他們的分子中含有一個(gè)相似的高度保守序列——Runt結(jié)構(gòu)域[1],該結(jié)構(gòu)域與果蠅的成對控制基因Runt序列同源。Runx2是成骨細(xì)胞分化和軟骨內(nèi)成骨的主要調(diào)節(jié)因子，在成骨細(xì)胞分化、軟骨細(xì)胞成熟及骨基質(zhì)蛋白的產(chǎn)生等過程中均發(fā)揮著重要作用。本研究通過模擬臨床功能矯治器，建立大鼠下頜持續(xù)前導(dǎo)的動(dòng)物模型，通過檢測大鼠髁突軟骨前部、中部和后部中Runx2的表達(dá)并對其進(jìn)行定量分析，探討大鼠下頜前伸后髁突軟骨的骨改建及Runx2對髁突不同部位軟骨骨改建的影響。報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 選擇健康雄性35 d齡SD大鼠(貴州醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供)40只，隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組和對照組，各為20只。大鼠咬合前導(dǎo)裝置的制作參照Rabie等[2]，實(shí)驗(yàn)組模擬臨床功能矯治器引導(dǎo)下頜前伸；對照組不做處理。分別在試驗(yàn)后第3、7、14及28天全麻下處死實(shí)驗(yàn)組及對照組每時(shí)間段動(dòng)物各5只。所有動(dòng)物都以自由飲水、飲食，同環(huán)境下飼養(yǎng)直至實(shí)驗(yàn)結(jié)束。

1.2 主要實(shí)驗(yàn)材料 實(shí)驗(yàn)材料有：Rabbit Anti-CBFA10.1 mL(200 ug/mL，武漢博士德生物工程有限公司)，增強(qiáng)型(Polink-1)檢測試劑盒，PV-6001 兔兩步法檢測試劑6mL(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)，濃縮型DAB試劑盒(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)。

1.3 組織處理 分別于安裝前導(dǎo)裝置后的第3、7、14、28天，處死實(shí)驗(yàn)組和對照組動(dòng)物各5只。0.3%戊巴比妥鈉1 mL/100 g腹腔注射，組織分離，整塊取下髁狀突。10%福爾馬林溶液固定24 h,EDTA液脫鈣4周，常規(guī)脫水，石蠟包埋。

1.4 免疫組織化學(xué)染色 石蠟縱向切片，脫水，抗原修復(fù)，去離子水孵育10 min，阻斷內(nèi)源性過氧化物酶。PBS液洗3次，每次3 min，滴加一抗4 ℃冰箱過夜，PBS液洗3次，每次2 min，加入兔IgG抗體-HRP多聚體工作液37 ℃溫箱孵育30 min，PBS液洗3次，每次2 min，DAB顯色，自來水終止顯色，蘇木素染色30 s，自來水沖洗，酸酒精處理10 s,氨酒精1 min脫水透明，樹膠封片。以PBS代替一抗作為陰性對照，大鼠氣管軟骨組織作為陽性對照，以細(xì)胞胞漿為特異黃色或棕黃色為染色陽性。

1.5 圖像分析 在矢狀切片上通過髁狀突前后面最突點(diǎn)作一直線，選取該直線中點(diǎn)以60°為標(biāo)準(zhǔn)將髁狀突上部分為前部、中部和后部。OlympusCX31型光學(xué)顯微鏡下應(yīng)用Pixera PVC100 C系統(tǒng)采圖，各組織采集100×圖像，Photoshop 8.0軟件選取髁突軟骨前中后部進(jìn)行觀測，每部分選擇連續(xù)3個(gè)100px×100px大小的區(qū)域，計(jì)數(shù)各區(qū)域棕色深染的陽性細(xì)胞數(shù)。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，實(shí)驗(yàn)組與對照組之間比較用方差分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 Runx2在髁突軟骨前部的表達(dá) 對照組中的表達(dá)隨著觀測時(shí)間點(diǎn)的向后推移，Runx2的陽性細(xì)胞沒有顯著變化趨勢。實(shí)驗(yàn)組中Runx2的表達(dá)隨著觀測點(diǎn)的向后推移，Runx2的陽性細(xì)胞逐漸增加，實(shí)驗(yàn)后第3、7天與對照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),第14和28天與對照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。實(shí)驗(yàn)組內(nèi)Runx2的表達(dá)第3天與第7天比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，第3天與14、28天比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見表1。

n3d7d14d28d對照組513.20±1.4713.60±1.7113.60±1.6513.40±1.42實(shí)驗(yàn)組513.80±1.4114.70±1.6415.80±1.54*15.90±0.99*F0.8712.1569.47020.604P0.3630.1590.006*0.000*

*注：與對照組相比，*P<0.01。

2.2 Runx2在髁突軟骨中部的表達(dá) 下頜前伸導(dǎo)致了實(shí)驗(yàn)組髁突軟骨中部Runx2的表達(dá)增強(qiáng)，實(shí)驗(yàn)后第3天與對照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，實(shí)驗(yàn)后第7、14和28天與對照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。實(shí)驗(yàn)組內(nèi)Runx2的表達(dá)第3天與第7、14、28天比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見表2。

3d7d14d28d對照組(n=5)14.10±1.2013.90±1.1913.20±1.2913.10±1.52實(shí)驗(yàn)組(n=5)14.40±1.1715.80±1.23*16.50±1.64*16.90±1.67*F0.32012.26025.72428.376P0.5780.003*0.000*0.000*

*注：與對照組相比，*P<0.01。

2.3 Runx2在髁突軟骨后部的表達(dá) 實(shí)驗(yàn)組內(nèi)Runx2的表達(dá)實(shí)驗(yàn)后第3天與第7、14、28天比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。同一觀測時(shí)間點(diǎn)內(nèi)髁突軟骨后部Runx2的表達(dá)與中部和前部比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。下頜前伸后髁突軟骨后部第3天與對照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);實(shí)驗(yàn)后第7、14和28天表達(dá)與對照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見表3。

n3d7d14d28d對照組515.90±1.2015.40±1.2615.00±1.3314.70±1.70實(shí)驗(yàn)組516.40±1.1717.80±1.03*18.60±1.71*18.80±1.81*F0.88921.60027.50927.162P0.3580.000*0.000*0.000*

*注：與對照組相比，*P<0.01。

3 討 論

髁突軟骨是直接接觸關(guān)節(jié)盤的部位，因而其改建直接反映了外力對髁突的影響，髁突生長改建直接影響下頜的形態(tài)和功能。覆蓋于下頜髁突關(guān)節(jié)表面的纖維軟骨，是髁突改建能力的基礎(chǔ)，研究[3]表明顳頜關(guān)節(jié)具有終身改建能力,尤其是在幼年期及青少年改建能力較強(qiáng)。髁突的改建易受環(huán)境因素影響，張紅梅等[4]通過升高后牙咬合，增加了垂直向的距離，改變了下頜的位置，從而改變了髁突的位置及負(fù)荷，髁突進(jìn)行了適應(yīng)性改建。

Runx蛋白在多種細(xì)胞譜系中發(fā)揮著十分重要的作用，Runx1參與造血干細(xì)胞的分化，而Runx2在成骨細(xì)胞分化、軟骨細(xì)胞成熟及骨基質(zhì)蛋白的產(chǎn)生中發(fā)揮重要作用，Runx3在胃上皮細(xì)胞調(diào)控中發(fā)揮重要作用。Runx2是首個(gè)被證實(shí)的成骨細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)錄因子，其能激活與啟動(dòng)骨髓間質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞系分化，還能調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞的成熟[5-6]。

Inada等[7]利用原位雜交技術(shù)對Runx2在軟骨細(xì)胞中的表達(dá)進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)隨軟骨細(xì)胞的成熟，Runx2的表達(dá)增加明顯，在終末肥大軟骨細(xì)胞中的表達(dá)量很大。在前軟骨形成細(xì)胞ATDC5中，抑制所有Runx蛋白的DN-Runx2(dominant negative Runx2)會(huì)抑制細(xì)胞凝聚，提示Runx蛋白參與軟骨形成的早期階段。Enomoto等[8]證實(shí)在ATDC5細(xì)胞中，I型Runx2的表達(dá)在細(xì)胞分化成為以表達(dá)X型膠原為特征的肥大軟骨細(xì)胞以前就已經(jīng)上調(diào)；用I型Runx2反義寡核苷酸作用于ATDC5細(xì)胞后，X型膠原的表達(dá)量明顯減少，說明其抑制了軟骨細(xì)胞的成熟；進(jìn)一步將Runx2作用于小雞不成熟的軟骨細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)其加快軟骨細(xì)胞的成熟。

本實(shí)驗(yàn)中，前導(dǎo)大鼠下頜后髁突軟骨Runx2的表達(dá)實(shí)驗(yàn)組在第7、14、28天強(qiáng)于對照組，實(shí)驗(yàn)組隨著時(shí)間的推移大鼠髁突軟骨中Runx2的表達(dá)逐漸增強(qiáng)，提示Runx2可能參與了下頜前導(dǎo)后髁突軟骨的改建過程，同時(shí)Runx2的表達(dá)可能與時(shí)間有關(guān)。實(shí)驗(yàn)組髁突軟骨后部Runx2的表達(dá)強(qiáng)于中部和前部，Runx2是生物力學(xué)信號的靶目標(biāo)，用低振幅機(jī)械牽張力連續(xù)作用牙周膜細(xì)胞能迅速增加Runx2與DNA、成骨細(xì)胞特異性元件2的結(jié)合能力，凝膠滯留移動(dòng)實(shí)驗(yàn)表明在機(jī)械牽張30 min后，可以檢測到Runx2與成骨細(xì)胞特異性元件2的結(jié)合，6 h后達(dá)峰值，12 h后仍可檢測到。研究表明ERK1/2磷酸化程度在機(jī)械拉伸作用下與時(shí)間正相關(guān)，拉伸激活的ERK能同Runx2結(jié)合并使Runx2磷酸化，同時(shí)Runx2結(jié)合活性與之呈正相關(guān)，與本實(shí)驗(yàn)中觀測到的髁突不同應(yīng)力區(qū)Runx2表達(dá)強(qiáng)度不同一致，可能是因?yàn)椴煌瑧?yīng)力作用下髁突軟骨改建的水平不同，髁突軟骨在髁突后部的張應(yīng)力作用下，髁突軟骨細(xì)胞增殖明顯。

趙志河等[9]通過建立“下頜骨矯形系統(tǒng)”的三維有限元模型，對下頜前導(dǎo)時(shí)髁突的受力進(jìn)行研究，結(jié)果顯示髁突軟骨表面的前部為壓應(yīng)力集中區(qū)，后上部則為張力區(qū)，髁突發(fā)生向前向下的位移，認(rèn)為前伸下頜能促進(jìn)下頜髁突的生長，與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果相符。本研究實(shí)驗(yàn)組在同一時(shí)間點(diǎn)Runx2表達(dá)在髁突后部要強(qiáng)于前部和中部，提示Runx2的表達(dá)可能與下頜前導(dǎo)后髁突不同部位所產(chǎn)生的應(yīng)力不同有關(guān)。

[1] Levanon D，Negreanu V，Bernstein Y，et al.AML1，AML2 and AML3，the human members of the runt domain gene-family：cDNA structure expression，and chromosomal localization[J]．Genomics，1994，23：425-432．

[2] Rabie AB,Zhao Z,ShenG,et al.Osterogenesis in the glenoid fossa in response to mandibular advancement[J].Am Jorthod Denfacial Orthop,2001,119(4):390-400.

[3] Cholasueksa P,Warita H,Soma K，et al.Alterations of the rat temporomandibular joint in functional posterior displacement of the mandible[J].Angle Orthod,2004,74(5):677-683.

[4] 張紅梅，丁寅,王歡，等.升高咬合對青春期大鼠髁突軟骨改建的影響[J].第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)，2007,28(6)：524-526.

[5] KomoriT.Runx2,amultifunctional transcription factor in skeletal development[J].Cell Biochem,2002,87(1):1-8.

[6] Ken O,Linda JS.Extracellular matrix gene regulation[J].Clin Orthop,2004,427(10):123-128.

[7] Inada M,Yasui T，Nomura S，et a1．Maturational disturbance of chondrocytes in cbfa1-deficient mice[J]．Dev Dyn，1999，214：279-290．

[8] Enomoto H，Enomoto-Lwamoto M，Lwamoto M，et a1．Cbfa1 is a positive regulatory factor in chondrocyte maturation[J]．J Biol Chem,2000,275：8695-8702．

[9] 趙志河，周學(xué)東,趙美英.下頜前伸時(shí)髁突的三維有限元分析[J].中華口腔醫(yī)學(xué)雜志,1999,34(2):85-87.

Expression of BMP-2 in the condyle of rat during mandibular advancement

QinBo,WangXiaoling,XuWeihua.

DepartmentofOrthodontics,TheAffiliatedHospitalofGuizhouMedicalUniversity,Guiyang550004,Guizhou,China.

ObjectiveTo observe the expression of Runt-related transcription factor 2 (Runx2) in the condyle of rat during mandibular advancement,and explore the possible function in the remodeling of condyle cartilage in response to change of mandibular position.Methods Total of 40 of 35-day-old male Spague-Dawley (SD) rats were randomly divided into 4 groups.Each group consisted of 5 rats with bite-jumping appliance,which caused mandubular protrusion and 5 rats untreated as the control.One group was sacrificed on day 3,7,14 and 28 respectively.The expression of Runx2in the condyle cartilage was examined by immunohistochemical staining.Results The expression level of Runx2in experimental group was higher than in control group on days 7,14,28 (P<0.05)，The expression of Runx2in posterior region was stronger than anterior and middle regions in experimental group (P<0.05).Conclusion Runx2participate in the remodeling activities of cartilage,and has close relations to the endochondral ossification process.Mandibular cartilage remodeling may be different in the stretched region and loaded area.

Condyle cartilage； Mandibular advancement； Runt-related transcription factor 2

R-332；R313；R783.5

A

1000-744X(2016)12-1252-03

2016-10-23)

△通信作者,E-mail:29574748@qq.com