益母草堿對慢性心力衰竭心肌重構(gòu)大鼠心房利鈉肽、血管緊張素Ⅱ影響的研究

梁趙文 羅建華 楊冬花 楊輝 盧麗娜 袁露 李利

(1.貴陽中醫(yī)學(xué)院2014級研究生；2.貴州省人民醫(yī)院內(nèi)分泌科；3.貴州省人民醫(yī)院干醫(yī)科，貴州 貴陽 550002)

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·論 著·

益母草堿對慢性心力衰竭心肌重構(gòu)大鼠心房利鈉肽、血管緊張素Ⅱ影響的研究

梁趙文1羅建華2楊冬花△3楊輝3盧麗娜3袁露3李利3

(1.貴陽中醫(yī)學(xué)院2014級研究生；2.貴州省人民醫(yī)院內(nèi)分泌科；3.貴州省人民醫(yī)院干醫(yī)科，貴州 貴陽 550002)

目的 探討益母草堿對慢性心力衰竭心肌重構(gòu)大鼠血清心房利鈉肽(atrial natruretic peptide，ANP)、血管緊張素Ⅱ(angiotensin Ⅱ ，Ang Ⅱ)的影響。方法 10只正常SD大鼠作對照組，腹腔注射生理鹽水；另80只SD大鼠作為實驗鼠，連續(xù)2周腹腔注射異丙腎上腺素誘導(dǎo)慢性心力衰竭動物模型。造模成功后實驗鼠隨機(jī)分為5組：模型組(生理鹽水)、益母草堿低劑量組(給益母草堿量為7.5 mg/kg/d)、中劑量組(給益母草堿量為15 mg/kg/d)、高劑量組(給益母草堿量為30 mg/kg/d)、p38絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases，P38MAPK)抑制劑組(給P38MAPK量為0.3 mg/kg/d)，連續(xù)予相應(yīng)藥物腹腔注射2周后行心臟超聲檢測心臟結(jié)構(gòu)及功能，ELIAS法檢測血清ANP、Ang Ⅱ含量。結(jié)果 (1)與正常組比較，模型大鼠左室后壁厚度(LVPW)、室間隔厚度(IVS)、左室舒張末期內(nèi)經(jīng)(LVDd)、左室收縮末期內(nèi)徑(LVDs)以及血清ANP、Ang Ⅱ含量明顯增加，而左室射血分?jǐn)?shù)(EF%)、左室短軸縮短率(FS%)則明顯降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。(2)與模型組比較，益母草堿高劑量組和P38MAPK抑制劑組LVPW、IVS、LVDd、LVDs及血清ANP、Ang Ⅱ含量明顯降低，EF%、FS%則明顯升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論 高劑量益母草堿(30 mg/kg/d)通過減少慢性心力衰竭大鼠血清ANP、Ang Ⅱ含量對抑制心肌重構(gòu)有一定作用。

益母草堿； 心肌重構(gòu)； 心房利鈉肽； 血管緊張素Ⅱ

研究[1-2]發(fā)現(xiàn)益氣溫陽活血方從多途徑、多靶點抑制心肌重構(gòu)，改善心臟功能，益母草堿為益母草的主要有效成分之一，研究發(fā)現(xiàn)其具有抑制心肌纖維化[3]、改善認(rèn)知功能、促進(jìn)神經(jīng)元修復(fù)[4]、抗炎[5]、防治糖尿病[6]等多種功能，但在抑制心肌重構(gòu)、改善心臟功能方面的作用機(jī)制有待進(jìn)一步明確。本研究通過觀察益母草堿對慢性心力衰竭心肌重構(gòu)大鼠血清ANP、Ang Ⅱ含量的影響，初步探討其抑制心肌重構(gòu)作用機(jī)制，為益母草堿作為防治慢性心力衰竭心肌重構(gòu)新藥物的進(jìn)一步開發(fā)利用提供理論依據(jù)和實驗數(shù)據(jù)。報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 實驗動物為SD雄性大鼠90只，體質(zhì)量(200±10) g(由重慶騰鑫比爾實驗動物銷售有限公司提供，合格證號：2012-0011)。試劑與儀器為異丙腎上腺素(上海禾豐制藥有限公司)，益母草堿(上海恩域化工科技有限公司)，P38MAPK抑制劑(SB203580，上海碧云天生物技術(shù)有限公司)，ANP(Sigma公司)，Ang Ⅱ(Sigma公司)，酶標(biāo)儀(北京新風(fēng)公司ZS-3型)，心臟超聲儀(Philips公司iU22型)。

1.2 方法 (1)動物分組及治療:90只健康SD雄性大鼠，同批在動物房適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d后隨機(jī)分為正常組10只和實驗組80只。實驗組復(fù)制慢性心力衰竭動物模型參照劉艷麗等[7]方法：異丙腎上腺素(5 mg/kg/d)連續(xù)2周腹腔注射誘導(dǎo)心肌重構(gòu)模型。2周后實驗組存活大鼠55只，再以心臟超聲評價心衰模型成功與否。將造模成功48只大鼠隨機(jī)分5組并分別給藥，模型組(給予生理鹽水，10只)、益母草堿低劑量組(給予益母草堿7.5 mg/kg/d，10只)、益母草堿中劑量組(給予益母草堿15 mg/kg/d，10只)、益母草堿高劑量組(給予益母草堿30 mg/kg/d，9只)、P38MAPK抑制劑組(給予P38MAPK抑制劑0.3 mg/kg/d，9只)，正常對照組和模型組給予相同體積生理鹽水腹腔注射，每日1次，共2周。所有大鼠均予標(biāo)準(zhǔn)飼料飼養(yǎng)，自由飲水。(2)超聲心動圖檢查：實驗結(jié)束后，予5%水合氯醛腹腔注射麻醉，臥位固定，左胸前區(qū)剃毛，以Philips iU22超聲儀、頻率為12 MHz探頭對大鼠行心臟超聲檢查，分別測量LVDd、LVDs、LVPW、IVS，測算FS%、EF%。各指標(biāo)均在連續(xù)3個心動周期測量后取其平均值。(3)血清ANP、Ang Ⅱ的檢測：6組動物相應(yīng)時間處死后，采集頸動脈血分離血清，以ELISA法檢測ANP、Ang Ⅱ的含量，操作過程參照試劑盒說明進(jìn)行。

2 結(jié) 果

2.1 各組心臟結(jié)構(gòu)及功能的測定 與正常組比較，其他各組大鼠心臟IVS及LVPW增厚，LVDd、LVDs增大，而FS%、EF%值則明顯降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。與模型組比較，益母草堿高劑量組和P38MAPK抑制劑組LVPW、IVS、LVDd、LVDs及血清ANP、Ang Ⅱ含量明顯降低，EF%、FS%則明顯升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；P38MAPK抑制劑和益母草堿高劑量組上述指標(biāo)組間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；與模型組比較，益母草堿低劑量組和益母草堿中劑量組上述指標(biāo)差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表1及圖1～6。

組別nIVS/mmLVPW/mmLVDd/mmLVDs/mmFS/%EF/%正常組101.53±0.171.66±0.125.79±0.242.84±0.3050.96±4.3981.34±4.28模型組102.05±0.19*2.10±0.16*6.87±0.37*4.75±0.30*30.87±2.41*57.13±3.46*低劑量組102.02±0.20*2.11±0.18*6.90±0.40*4.69±0.61*32.28±5.36*58.87±7.79*中劑量組101.98±0.17*2.02±0.20*7.04±0.45*4.67±0.51*35.17±4.82*60.89±6.88*高劑量組91.81±0.22*△1.88±0.19*△6.42±0.43*△3.83±0.59*△40.61±6.10*△69.86±6.93*△P38組91.78±0.20*△1.85±0.20*△6.35±0.32*△3.75±0.64*△41.12±8.55*△70.09±8.96*△

注：與正常組比較，*P<0.05；與模型組比較，△P<0.05。

圖1 正常組 圖2 模型組 圖3 益母草堿低劑量組

圖4 益母草堿中劑量組 圖5 益母草堿高劑量組 圖6 P38MAPK抑制劑組

2.2 各組血清ANP、Ang Ⅱ含量的檢測 與正常組比較，其他各組大鼠血清ANP、Ang Ⅱ含量明顯升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與模型組比較，P38MAPK抑制劑組和益母草堿高劑量組上述指標(biāo)明顯降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；上述指標(biāo)P38MAPK抑制劑組和益母草堿高劑量組組間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；與模型組比較，益母草堿低劑量組和益母草堿中劑量組上述指標(biāo)差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

組別nANP/(ng/L)AngⅡ/(ng/L) 正常組1066.38±9.9653.58±9.49 模型組10152.52±20.48*137.23±16.54* 低劑量組10145.73±16.86*132.66±14.50* 中劑量組10143.41±16.09*135.32±18.32* 高劑量組984.85±10.90*△92.16±10.32*△ P38組983.67±11.31*△87.69±12.35*△

注：與正常組比較，*P<0.05；與模型組比較，△P<0.05。

3 討 論

心肌重構(gòu)是慢性心力衰竭心腔擴(kuò)大、心室肥厚的過程中，與心肌細(xì)胞外基質(zhì)膠原纖維網(wǎng)等各種組織結(jié)構(gòu)改變相關(guān)的結(jié)構(gòu)重構(gòu)以及與各種信號通道改變相關(guān)的重構(gòu)[8]，是導(dǎo)致心力衰竭不斷進(jìn)展的病理生理學(xué)基礎(chǔ)。因此，抑制心肌重構(gòu)已成為慢性心力衰竭的防治關(guān)鍵。目前西藥治療心力衰竭、抑制心肌重構(gòu)療效明確，但也存在不容忽視的不良反應(yīng)及使用禁忌[9]。近年來研究[10]發(fā)現(xiàn)，中醫(yī)藥在延緩心力衰竭、改善患者臨床癥狀、對抗心力衰竭西藥的不良反應(yīng)上顯示了獨(dú)特療效，并具有一定的優(yōu)勢，同時中藥協(xié)同西藥，既可消除或減少血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑和β受體阻滯劑的不良反應(yīng)，又縮短了藥物劑量遞增的時間。

益母草為唇形科益母草屬植物的新鮮或干燥地上部分，其味辛、苦、微寒，歸心﹑肝﹑膀胱經(jīng)，具有活血祛瘀、利尿消腫之功效，過去主要用于婦女血脈阻滯之月經(jīng)不調(diào)、經(jīng)行不暢、產(chǎn)后瘀阻疼痛、惡露不盡等，素有“血脈圣藥”、“經(jīng)產(chǎn)良方”之稱[11]。研究發(fā)現(xiàn)益母草中主要含有的化合物有：生物堿類、黃酮類、二萜類、苷類等,并含有鋅、銅、錳、鐵等多種微量元素，其中生物堿為益母草屬植物的主要有效成分[12]。

本研究結(jié)果顯示，以異丙腎上腺素造模3～5 d后，模型組大鼠活動減少、蜷縮、進(jìn)食減少、皮毛松軟、體質(zhì)量減輕，此后癥狀呈逐漸加重趨勢，出現(xiàn)唇周青紫，呼吸減弱，毛色枯槁、散亂豎起、脫毛，口唇及雙耳發(fā)紺以及死亡等。并且心臟超聲顯示LVPW、IVS明顯增厚，LVDd、LVDs擴(kuò)大，EF%和FS%下降，與正常組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

ANP是由28個氨基酸組成的肽類激素，當(dāng)出現(xiàn)心力衰竭時，由于心臟前后負(fù)荷均明顯升高，刺激了ANP的釋放[13]。在心衰發(fā)展過程中，ANP隨著疾病的嚴(yán)重程度，呈動態(tài)上升趨勢，ANP血清濃度測定能作為判斷充血性心力衰竭的指標(biāo)[14]，ANP的分泌會受到心肌重構(gòu)標(biāo)記物Ang Ⅱ受體的影響[15]。本實驗結(jié)果顯示，模型大鼠造模結(jié)束后，血清ANP和Ang Ⅱ含量明顯升高，與正常組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。綜上結(jié)果，模型大鼠出現(xiàn)了慢性心力衰竭癥狀表現(xiàn)、心臟結(jié)構(gòu)和功能的變化，同時判斷心力衰竭嚴(yán)重程度和心肌重構(gòu)指標(biāo)血清ANP和Ang Ⅱ含量明顯升高，提示造模成功。益母草堿低劑量組和中劑量組予相應(yīng)劑量干預(yù)治療后上述指標(biāo)差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，但益母草堿高劑量組療效雖未達(dá)到正常組水平，但與模型組比較，IVS、LVPW、LVDd、LVDs、血清ANP及Ang Ⅱ含量降低，F(xiàn)S%、EF%值升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，提示當(dāng)益母草堿治療劑量達(dá)30 mg/kg/d時，能夠降低血清ANP和Ang Ⅱ含量，抑制慢性心力衰竭大鼠心肌重構(gòu)。

P38MAPK是絲裂原蛋白活化激酶其中一條重要信號通路途經(jīng)，可被多種細(xì)胞外刺激信號激活，調(diào)節(jié)心肌細(xì)胞凋亡、肥大細(xì)胞炎性反應(yīng)、成纖維細(xì)胞活化和細(xì)胞外基質(zhì)代謝失衡，導(dǎo)致心臟結(jié)構(gòu)和功能受損，最終發(fā)展成心力衰竭[8]。當(dāng)心肌細(xì)胞受到如機(jī)械牽張、壓力負(fù)荷、缺血缺氧、NO缺乏等刺激后，以自分泌或旁分泌形式分泌Ang Ⅱ、內(nèi)皮素-1等因子，這些因子都能通過活化P38MAPK通路，誘導(dǎo)心肌蛋白合成，使心肌細(xì)胞增大，促進(jìn)心肌肥厚的發(fā)生[16]。

為明確益母草堿抑制心肌重構(gòu)的作用機(jī)制，本實驗同時設(shè)立了P38MAPK抑制劑組，發(fā)現(xiàn)予P38MAPK抑制劑干預(yù)后，IVS、LVPW、LVDd、LVDs、血清ANP及Ang Ⅱ含量明顯降低，F(xiàn)S%、EF%值則明顯升高，與模型組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，上述指標(biāo)益母草堿高劑量組和P38MAPK抑制劑組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。益母草堿抑制心肌重構(gòu)，是否與抑制P38MAPK信號通路活化降低血清ANP和Ang Ⅱ含量有關(guān)，具體機(jī)制有待于進(jìn)一步研究。

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Effects of Leonurine on serum atrial natruretic peptide and angiotensin II in the myocardial remodeling of rat with chronic heart failure

LiangZhaowen1,LuoJianhua2,YangDonghua△3,YangHui3,ZhuJingwen3,YuanLu3,LiLI3.

1.GuiyangTraditionalChineseMedicine(TCM)College.Guiyang550002,Guizhou,China. 2.DepartmentofEndocrinology,thePeople'sHospitalofGuizhouProvince,Guiyang550002,Guizhou,China. 3.DepartmentofMedicineforCadre,thePeople'sHospitalofGuizhouProvince,Guiyang550002,Guizhou,China.

ObjectiveTo investigate the effects of Leonurine on serum BNP and Ang II in the myocardial remodeling of rat with chronic heart failure.Methods 10 normal SD rats as control group, meanwhile 80 experimental rats were given isoproterenol of intraperitoneal injection daily for 2w , then the rats with chronic heart failure were divided randomly into five groups, which were the model group, low-dose Leonurine group (7.5 mg/kg/d), middle-dose Leonurine group (15mg/kg/d), high-dose Leonurine group (30 mg/kg/d) , and P38MAPK inhibitor group. During the experiment, different drugs and dose were intraperitoneal injections to different groups and the normal saline was used for normal group and model group. After 2w, cardiac structure and function was tested by echocardiography, content of serum ANP and Ang II were detected by ELISA respectively.Results Compared with those in normal group, LVPW, IVS, LVDd, LVDs, the levels of serum ANP and Ang II in model group were progressively increased, but EF% and FS% were significantly decreased (allP<0.05). Compared with those in model group, LVPW, IVS, LVDd, LVDs, the levels of serum ANP and Ang II in high-dose Leonurine group and P38MAPK inhibitor group were progressively decreased, but EF% and FS% were significantly increased (allP<0.05).Conclusion High-dose Leonurine group (30 mg/kg/d) can inhibit myocardial remodeling in the rat with chronic heart failure maybe through attenuating serum BNP and Ang II.

Leonurine； Myocardial remodeling； Atrial natruretic peptide； Angiotensin Ⅱ

國家自然科學(xué)基金項目(81560735)；貴州省社會公關(guān)項目(黔科合SY字[2011]3055)；貴州省科技聯(lián)合基金(黔科合SY[2010]3121號)；貴陽市科技計劃項目([2010]筑科農(nóng)合同字第1-社-37號)

R332;R541.6

B

1000-744X(2016)12-1235-04

2016-10-24)

△通信作者，E-mail：niuniucs0204@126.com