PRP PRF和CGF的研究進展與比較

李 婷 戴驍意 沈 潔 單樂天*

血小板作為全血中最重要的組成部分之一，富含多種生長因子（GF），例如血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）、堿性成纖維細胞生長因子（bFGF）、轉(zhuǎn)化生長因子（TGFβ-1）、血小板衍生生長因子（PDGF-AB）、表皮生長因子（EGF）等。血小板可釋放多種因子在生理情況下發(fā)揮粘附、聚集、釋放及收縮功能，能參與機體凝血機制，且還在血栓形成、炎癥反應(yīng)及免疫反應(yīng)等過程中發(fā)揮重要作用［1］。

而富血小板血漿（PRP）作為第一代血小板濃縮物，是將新鮮全血通過特定離心方式得到的含高濃度血小板的血漿。在1998年Marx首先將PRP應(yīng)用于骨重建中。因其富含高濃度的血小板，含有高濃度促進骨組織和軟骨組織再生修復的生長因子，對骨再生和傷口愈合有積極的作用；富血小板纖維蛋白（PRF）是在PRP基礎(chǔ)上最早在法國由Choukr-oun等［2］提出的第二代血小板濃縮物。是在PRP的基礎(chǔ)上，在無任何化學添加劑的情況下制得的富含血小板的纖維蛋白，纖維蛋白的聚合過程類似于自然形成的過程，這樣一個纖維蛋白網(wǎng)絡(luò)將導致一個更高效的細胞遷移和增殖，且能緩慢釋放生長因子，延長作用時間從而促進傷口組織愈合；濃縮生長因子（CGF）是繼PRP、PRF之后第三代血小板濃縮物，最早是由Sacco［3］提出，是利用血液樣本和特殊的離心設(shè)備制備而出的更大、富含更高濃度生長因子的纖維蛋白團塊，故這些團塊具有更好的促再生能力和可塑性，更易于吸收。PRP、PRF、CGF作為血漿提取物研究的三個階段的產(chǎn)物，有著各自不同的臨床價值與應(yīng)用。故作者參考國內(nèi)外文獻及研究進展，將三者進行比較與分析。

1 PRP

1.1 制備方法 PRP在臨床上尚無統(tǒng)一標準化的制備方法，但基本原理相同：即血小板濃縮過程，根據(jù)全血不同成分的密度經(jīng)梯度離心分離。加入抗凝劑，先全血離心，分離出紅細胞及白細胞，接著從血漿中將PRP分離出來，離心后，各成分根據(jù)比重不同分為3 層：下層為紅細胞，中間層為白細胞和血小板，上層為上清液，吸取中間層混勻即為 PRP［4］。

PRP制備方法種類較多，傳統(tǒng)的手工制備法是通過離心機等儀器設(shè)備獲取富血小板血漿的一種方法。目前較普遍肯定的有一次離心法Anitua法［4］和二次離心法中Sonnleitne法、Petrungaro 法、Landersberg 法［5］等。一次離心法Anitua法能獲取PRP的血小板平均濃度約為433000/mm3，Sonnleitner法獲得的PRP血小板濃度＞2000000/mm3，不同的方法制備出的PRP的濃度各不相同，PRP制備方法未標準化也是對PRP的研究與應(yīng)用造成重要影響的原因之一。

美國 FDA認證并商業(yè)化生產(chǎn)的 PRP 制備系統(tǒng)有9種，其中部分制備系統(tǒng)能快速穩(wěn)定地獲得PRP，通過計算PRP中血小板或白細胞回收率，富集系數(shù)及測定生長因子的濃度與全血比較，進行質(zhì)量控制。但9種制備系統(tǒng)獲得的 PRP在血小板回收率及濃度方面存在較大差異。

1.2 作用機制與生物特性 PRP中含有含高濃度的血小板、纖維蛋白及少量細胞成分。血小板中含有α 顆粒，α 顆粒中含有凝血因子和生長因子，在治療過程中能促進傷口愈合。PRP被激活后，血小板聚集，α顆粒釋放生長因子。生長因子錨定相關(guān)細胞的增殖和遷移，再介導炎癥，傷口愈合的級聯(lián)反應(yīng)和血管增生，然后調(diào)控細胞外基質(zhì)蛋白合成和組織重塑［6］。

PRP的作用機制尚未完全闡明，PRP富含VEGF、bFGF、TGF-β1、PDGF-AB、IGFs和基質(zhì)蛋白等。各種生長因子在不同階段發(fā)揮不同的作用，形成錯綜復雜的信號分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。PDGF 是組織愈合初期關(guān)鍵的生長因子，能促進干細胞、成纖維細胞和軟骨細胞等增殖與趨化；TGF-β能提高成纖維細胞的增殖，促進基質(zhì)的分泌以及骨基質(zhì)的沉積；TGF-β可以抑制破骨細胞形成和骨吸收；VEGF可促進內(nèi)皮細胞遷移和有絲分裂，是強有力的血管生成因子［7］。

纖維蛋白也是PRP重要成分，PRP凝膠能夠形成由纖維蛋白構(gòu)成的三維網(wǎng)狀支架，其能產(chǎn)生一個合適的三維結(jié)構(gòu)，為修復細胞提供良好支架，有利于生長因子的分泌和組織修復，還可收縮創(chuàng)面，促進凝血，刺激組織再生，促進創(chuàng)面閉合。1.3 臨床應(yīng)用 因PRP具有富含多種高濃度生長因子，且各種細胞因子間具有最佳協(xié)同作用，且制作方法和步驟比較簡單，對供體損傷小，隨著研究的深入，PRP能促進組織修復，還可收縮創(chuàng)面，促進凝血，刺激組織再生，促進創(chuàng)面閉合等PRP的臨床應(yīng)用逐漸增多，如骨再生與骨愈合［8］、牙科、創(chuàng)面愈合等。

此外，PRP還具有抗炎抑菌的作用。上述實驗局部應(yīng)用自體 PRP可以降低骨關(guān)節(jié)感染的風險，且PRP對金黃色葡萄球菌、A族鏈球菌等有較強的體外抑菌活性，故總結(jié)出自體 PRP不僅具有傳統(tǒng)的促進組織修復的作用，還具有抑制炎癥反應(yīng)、抑制病原菌，控制感染的潛能。

PRP的臨床應(yīng)用技術(shù)存在一些不足之處，主要缺點是關(guān)節(jié)內(nèi)PRP凝膠分布不均，無法做到準確分布至損傷部位，難以保證局部有高濃度生長因子，且關(guān)節(jié)軟骨及周圍組織受到醫(yī)源性損傷的會有所增加。目前對注射 PRP導致的疼痛、腫脹等不良反應(yīng)、相關(guān)的應(yīng)對措施等方面，尚缺乏系統(tǒng)性研究。

2 PRF

2.1 制備方法 PRF制備原理即離心反應(yīng)與凝集反應(yīng)，因依賴于天然的凝血酶，在其作用下使得纖維蛋白原緩慢凝結(jié)為疏松的纖維蛋白網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，其中包含了大量的血小板和白細胞，應(yīng)用于臨床也會引起一個更高效的細胞遷移和擴散，促進軟硬組織愈合。

常用制備過程即只需靜脈血于干燥的未加入抗凝劑的離心管，在離心機強大的離心力作用下，使血液中血細胞的沉降加快，將血液中不同沉降速率的物質(zhì)分開，實現(xiàn)血液分層：上層為淡黃色的貧血小板血漿層，底層為紅細胞碎片層，二者之間即為富含血小板的纖維蛋白凝膠層。在孫英華等［9］對PRF凝膠與膜顯微與超微結(jié)構(gòu)研究的掃描電鏡標本觀察結(jié)果顯示，在PRF凝膠可見大量的血小板和白細胞主要聚集在紅細胞層和凝膠的交界處，因此在制取凝膠時底部應(yīng)該留有小許的紅細胞層，可以防止血小板和白細胞的丟失。

國內(nèi)研究人員在長期研究觀察制備PRF的不同方法對體外釋放生長因子中發(fā)揮的作用影響發(fā)現(xiàn)，玻璃離心管30000r/min，離心10min效果最佳。目前多使用純富血小板纖維蛋白（P-PRF）和富白細胞血小板纖維蛋白（L-PRF），制備出PRF膜，PRF凝膠及與其他材料形成復合材料的形式使用于臨床中。

2.2 生物特性與作用機制 PRF主要是由血小板、白細胞和纖維蛋白基質(zhì)等共同構(gòu)成的。PRF 的分子結(jié)構(gòu)類似于天然血凝塊，富含VEGF、bFGF、TGF-β1、PDGF-AB、EGF等?？梢越柚L因子的調(diào)節(jié)作用以及纖維蛋白的支架作用進行組織修復，PRF可在血管生成、免疫應(yīng)激、組織再生和骨組織愈合中發(fā)揮重要的作用［10］。PRF中主要含有三種濃縮的生長因子TGF-β、PDGF和VEGF，PDGF是在早期階段對于骨細胞的分裂和增殖起著重要作用。TGF-β在同一時間作為生物信號調(diào)節(jié)骨形成和吸收。

生長因子與細胞因子等的調(diào)節(jié)作用機制與PRF相似，與PRP相比，PRF更具有特色的是纖維蛋白的作用。孫潔等［11］對PRF的超微結(jié)構(gòu)的觀察與探討中掃描電鏡和透射電鏡觀察均證實 PRF 的主要結(jié)構(gòu)是纖維蛋白形成的疏松的三維立體網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，掃描電鏡顯示 PRF表面的纖維蛋白數(shù)量多，形態(tài)規(guī)則清晰，由纖維蛋白聚集形成的疏松多孔的立體網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)中大量的纖維蛋白三叉結(jié)構(gòu)隨處可見。

故PRF通過等邊連接方式緩慢形成立體疏松且富有彈性的纖維蛋白凝塊，有利于細胞因子的融入，能為細胞的附著、遷移與分化提供場所，且三維立體結(jié)構(gòu)其能在傷口愈合過程中緩慢釋放出生長因子和細胞因子，從而延長因子在創(chuàng)口中的作用時間。

2.3 臨床應(yīng)用 作為新型再生醫(yī)學材料，在國內(nèi)PRF已被逐漸用于臨床醫(yī)學不同的方向中。PRF在國內(nèi)口腔方面的應(yīng)用最廣泛。利用PRF中纖維蛋白凝膠促進軟硬組織修復的特點，孫曉琳等［12］報道提出評價PRF在前牙即刻種植修復中應(yīng)用的臨床效果，聯(lián)合GBR技術(shù)，在此病例中發(fā)現(xiàn)應(yīng)用PRF能關(guān)閉創(chuàng)口，有利于滲出物排除，降低感染幾率，擴大手術(shù)適應(yīng)癥；目前PRF臨床多用于口腔種植手術(shù)中，在牙周軟組織再生中和在治療牙周炎導致的骨缺損方面臨床應(yīng)用極少，其遠期臨床療效尚有待于進一步觀察。

在國內(nèi)整形美容方面，李澤華等［13］利用24例面部皮膚軟組織老化萎縮凹陷患者，在精微脂肪復合PRF移植于面部年輕化治療中發(fā)現(xiàn)PRF對移植脂肪組織初期的血管化有促進作用，使得脂肪注射移植后患者腫脹期短、恢復快速、移植效果明顯，同時有效地防止了移植后出現(xiàn)的硬結(jié)、鈣化、不平整等并發(fā)癥，說明 PRF能促進血管生成，可用于自體脂肪移植過程。

在骨科方面，雍志軍［14］利用PRF修復兔膝關(guān)節(jié)軟骨全層缺損的實驗研究發(fā)現(xiàn)，PRF中大量的血小板和生長因子與纖維蛋白通過糖蛋白以化學鍵結(jié)合，使得生長因子的釋放緩慢而持久，能更好的誘導BMSCs 向軟骨細胞分化；PRF呈疏松多孔的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，能促進軟骨特異性基質(zhì)的分泌，有效促進軟骨缺損的修復再生。

3 CGF

3.1 制備方法 CGF的獲取是經(jīng)過特殊離心機制備而成，制備過程中無需任何化學或過敏性添加劑，是采用差速不間斷離心技術(shù)獲取的血液提取物，制備出的物質(zhì)分為三層：上層為血清（PPP），中層為CGF，下層為紅細胞層（RBC）。

常用制備方法是分別抽取靜脈血注入試管（Medifuge離心加速機特殊匹配試管劑）中，立即放入Medifuge 離心加速機的轉(zhuǎn)筒中，按預定程序制備出 CGF，分離出CGF并存儲在稀釋的抗菌溶液中。在臨床治療過程中，可通過測定TGF-β1、PDGF-BB、VEGF的釋放濃度進行定性質(zhì)量控制。

3.2 生物特性與作用機制 因制備CGF的特殊離心制備方法，CGF似乎有更好的再生能力和多功能性，CGF中生長因子含量及纖維蛋白的粘合度和拉伸強度均高于PRP和PRF。尤其是表現(xiàn)在TGF-β1，PDGF-BB，VEGF。故在CGF中VEGF 對慢性傷口的愈合和軟骨化效果更加顯著，且其在炎癥階段后期產(chǎn)生強大的血管再生能力。TGF-β1對傷口愈合具有重要作用，為確保傷痕相對美觀效果顯著，必須確保TGF-β1的平衡表達。

CGF的潛力在于其擁有含血小板、白細胞、生長因子的纖維蛋白網(wǎng)絡(luò)，CGF擁有獨特的三分子和多分子濃縮形成的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，使得各類細胞成分及抗體更易于趨化、附著、增殖，為細胞的遷移提供微環(huán)境。且可以持久的釋放生長因子。

3.3 臨床應(yīng)用 CGF的臨床應(yīng)用中熱點方向即為CGF作為新型填充材料以及再生材料有著巨大的潛力。王國光［15］研究結(jié)果說明CGF凝膠和CGF膜在體內(nèi)可以誘導組織細胞的增殖，促進組織修復。因此，CGF凝膠和CGF膜可以作為一種充填材料，修復頜面部軟組織塌陷畸形，且CGF能夠促進軟組織快速愈合，減少術(shù)后瘢痕形成。

在口腔科學應(yīng)用方面，高瑩［16］將CGF與傳統(tǒng)骨代替材料Bio-oss骨粉混合后植入牙槽骨的缺損區(qū)內(nèi)，發(fā)現(xiàn)CGF具有顯著的引導牙周組織再生的作用，表現(xiàn)為牙槽骨高度的增加，新生牙骨質(zhì)的出現(xiàn)，新生血管形成等；但也有實驗指出在一些缺損面積較大的術(shù)區(qū)，CGF類物質(zhì)的高生物相容性使用時的有效屏障作用持續(xù)時間較短，對于開窗較大的創(chuàng)口無法起到長期、有效的屏障作用。

4 三者比較

4.1 PRP與PRF PRP的制備時機，頻率，應(yīng)用技術(shù)的未標準化，最有效的濃度和局部環(huán)境還有待進一步研究，且PRP 的制備過程需要加入異種凝血酶和抗凝血制品，可能會導致免疫排斥反應(yīng)的發(fā)生和感染性疾病的傳播。除此之外因為PRF含有高濃度的非活性膠狀基質(zhì)，完整的血小板，能緩慢釋放生長因子，且制備PRP不使用牛凝血酶或其他外生催化劑制備過程非常簡單和快速，和簡化處理，PRP制備占用更多的時間。

由于PRR與PRF制備方法的不同，PRP 通過雙邊連接方式迅速形成致密堅硬的纖維蛋白網(wǎng)絡(luò)，不利于細胞因子的融入和細胞遷移。而PRF是在離心過程中自然而緩慢的形成的，保證了PRF的纖維蛋白之間有更緊密的連接和更好的彈性。國內(nèi)在臨床上 PRP 凝膠很少單獨使用，一般與骨粉等混合應(yīng)用起輔助作用，而 PRF 是具有彈性質(zhì)韌的半透明膜狀構(gòu)，可以作為自體源性生物材料單獨用于植骨手術(shù)。

He L等［17］實驗研究發(fā)現(xiàn)，PRF比PRP更能促進小鼠成骨細胞增殖與分化，PRP釋放的生長因子TGF-beta1和PDGF-AB在第一天達到最高后減少。而PRF釋放TGF-beta1在第14天達到最高，說明與PRP相比，PRF能更加緩慢的釋放生長因子，更能有效促進增殖和分化。

4.2 PRF與CGF 因PRF與CGF制備時所采取的離心方法不同導致最終生長因子濃度以及生物結(jié)構(gòu)有著較大的差異從而影響生物性能。

5 討論

綜上所述，PRP、PRF和CGF均是血小板濃縮物生物學材料，都含有高濃度的血小板、纖維蛋白及少量細胞成分。PRP在骨科的研究最為廣泛但PRP處理效率低，制備方法未標準化，且抗凝劑的使用及個體之間存在差異，故難以控制PRP制劑的質(zhì)量水平，這些是研究PRP亟需解決的問題；而PRF的形成類似自然凝血過程，故含有更立體的纖維蛋白網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)利于生長因子的吸附，在臨床應(yīng)用方面更加廣泛；CGF作為最新一代的血小板濃縮提取物，因富含更加柔軟而纖薄彈性的有機纖維蛋白網(wǎng)格及高濃度的生長因子，在填充修復以及再生方面研究廣泛，但同樣存在制備缺乏標準化的規(guī)范、可能存在較大個體差異的問題，難以獲得標準化的產(chǎn)品；也因難以控制臨床效果的穩(wěn)定性及疾病的預后效果等問題導致其臨床試用范圍存在爭議，目前臨床上PRP、PRF和CGF仍處于試驗階段，故日后將會通過更多的動物試驗以及臨床試驗來探尋作用機制以拓寬三種血小板濃縮提取物的研究領(lǐng)域。

［1］ Fioravanti C,Frustaci I,Armellin E,et al．Autologous blood preparations rich in platelets,fibrin and growth factors． Oral Implantol(Rome), 2016,8(4):96-113．

［2］ Whitman DH,Berry RL,Green DM．Platelet gel: an autologous alternative to fibrin glue with applications in oral and maxillofacial surgery． J Oral Maxillofac Surg,1997,55(11):1294-1299．

［3］ Baksh N,Hannon CP,Murawski CD,et al．Platelet-rich plasma in tendon models: a systematic review of basic science literature．Arthroscopy, 2013,29:596-560．

［4］ Anitua E．Plasma rich in growth factors: preliminary results of use in the preparation of future sites for implants．Int J Oral Maxillofac Implants, 1999,14:529-535．

［5］ Landesberg R,Roy M,Glickman RS,et al．Quantification of growth factor levels using a simplifed method of platelet-rich plasma gel preparation．J Oral Maxillofac Suig, 2000,58:297-300．

［6］ Miroshnychenko O,Chang WT,Dragoo JL．The use of plateletrich and platelet-poor plasma to enhance differentiation of skeletal myoblasts．Am J Sports Med,2017,45(4):945-953．

［7］ ?zdemir B,Kurti? B,Tüter G,et al．Double-application of plateletrich plasma on bone healing in rabbits．Medicina oral,patol oral cir bucal,2012,17(1):171-177．

［8］ 劉步云,孫育良,何本祥,等．關(guān)節(jié)腔注射富血小板血漿與玻璃酸鈉治療膝關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)炎的療效比較．實用骨科雜志,2017,23(1):71-73．

［9］ 孫英華,王稚英．富血小板纖維蛋白凝膠和膜顯微與超微結(jié)構(gòu)研究．中國醫(yī)學工程,2011,19(7):65-67．

［10］ Dohan DM,Choukroun J,Diss A,et al．Platelet-rich fibrin(PRF):a second-generation platelet concentrate．Part I: technological concepts and evolution．Oral surgery,oral medicine,oral pathology,oral radiology,and endodontics,2006,101(3):37-44．

［11］ 孫潔,張劍明,李彥秋．富血小板纖維蛋白超微結(jié)構(gòu)的觀察與探討．口腔醫(yī)學研究,2010,26(1):98-101．

［12］ 孫曉琳,翟婧捷,孫悅,等．PRF聯(lián)合GBR在前牙即刻種植中的應(yīng)用1例．口腔醫(yī)學研究,2017,33(1):106-107．

［13］ 李澤華,謝紅炬,鄧穎,等．精微脂肪復合富血小板纖維蛋白(PRF)移植在面部年輕化治療中的應(yīng)用．中南醫(yī)學科學雜志,2016,44(2):166-169．

［14］ 雍志軍．自體富血小板纖維蛋白(PRF)修復兔膝關(guān)節(jié)軟骨全層缺損的實驗研究．第四軍醫(yī)大學,2014．

［15］ 王國光．富自體濃縮生長因子纖維蛋白凝膠/膜形態(tài)學觀察及皮下充填實驗研究．河北醫(yī)科大學,2014．

［16］ 高瑩．自體濃縮生長因子(CGF)在犬牙周組織缺損再生中的研究．山東大學,2015．

［17］ He L,Lin Y,Hu X,et al．A comparative study of platelet-rich fibrin(PRF)and platelet-rich plasma(PRP)on the effect of proliferation and differentiation of rat osteoblasts in vitro．Oral Surg Oral Med Oral Pathol Oral Radiol Endod．2009 Nov,108(5):707-713．