組織工程支架材料降解的監(jiān)測

王祥盛 綜述 張文杰 審校

·綜述·

組織工程支架材料降解的監(jiān)測

王祥盛 綜述 張文杰 審校

支架材料是組織工程三大要素之一，始終是研究的重點(diǎn)和熱點(diǎn)。合適的支架材料必須具有與組織形成相匹配的降解速率。因此，有效監(jiān)測支架材料降解的技術(shù)是該領(lǐng)域亟待解決的問題。我們回顧了近年來對支架材料降解監(jiān)測的相關(guān)研究，對各種監(jiān)測方法的原理、優(yōu)缺點(diǎn)進(jìn)行綜述，以期為探索理想的監(jiān)測方法提供思路。

組織工程支架材料降解監(jiān)測

組織工程的基本原理是將體外擴(kuò)增的種子細(xì)胞接種到可生物降解的支架材料上，通過細(xì)胞在支架材料上的增殖和細(xì)胞外基質(zhì)分泌及支架材料的逐步降解，從而最終在體外或體內(nèi)構(gòu)建組織工程化組織或器官。其中，支架材料不僅提供了細(xì)胞黏附、遷移、增殖和功能代謝的場所，還承擔(dān)著細(xì)胞、信號分子及營養(yǎng)物質(zhì)的傳輸和廢物的排泄等功能[1]。理想支架材料的重要特征之一是具有與組織形成相匹配的降解速率。材料過早降解將失去對細(xì)胞的支持，而過晚降解則因空間占位效應(yīng)阻礙組織的再生。因此，了解支架材料的降解情況具有重大意義。我們就監(jiān)測組織工程支架材料降解的方法進(jìn)行綜述，并提出可能的監(jiān)測新技術(shù)。

1 常用支架材料的特性

1.1 基本特性

組織工程支架材料在宏觀形態(tài)、微觀結(jié)構(gòu)、機(jī)械強(qiáng)度、毒性、細(xì)胞相容性和免疫原性等方面都有嚴(yán)格的要求。因此良好的組織工程支架材料需要滿足以下條件[2]：①具有良好機(jī)械強(qiáng)度和韌性，可形成特定的三維結(jié)構(gòu)；②適合的表面性質(zhì)，有利于細(xì)胞附著；③生物相容性好，可滿足細(xì)胞的增殖分化，產(chǎn)生細(xì)胞外基質(zhì)；④具有與組織再生相匹配的降解速率，降解產(chǎn)物無毒性及免疫原性；⑤微觀上具有相互連通的孔隙結(jié)構(gòu)和高孔隙率，利于組織長入和代謝廢物排出。

1.2 基本分類

組織工程常用的可生物降解的支架材料可分為典型的四個種類：可降解的無機(jī)材料、人工合成高分子聚合物、天然生物材料，以及復(fù)合材料。

1.2.1 可降解的無機(jī)材料

這類材料常用于構(gòu)建組織工程骨，如羥基磷灰石（HA）和磷酸三鈣（TCP）等。其特點(diǎn)為：較高的機(jī)械強(qiáng)度，非常低的彈性和脆硬的表面。由于在化學(xué)成分和組成結(jié)構(gòu)上與天然骨組織有很高的相似性，與成骨細(xì)胞的生物相容性好，可以提高成骨細(xì)胞增殖與分化的能力[3-4]。但是，這類材料脆性大、不易塑形，且植入困難，無法維持新生骨重塑所需要的機(jī)械負(fù)荷[5]，降解速率不易控制[6]等，難以滿足臨床應(yīng)用的需求。

1.2.2 人工合成高分子聚合物

這類材料可制造出特定的三維結(jié)構(gòu)，且孔隙率可調(diào)整，通過改變其組成比例、分子大小，可以控制其降解速率[7-8]。常見的有聚苯乙烯、聚左旋乳酸（PLLA）、聚乙醇酸（PGA）和聚乳酸-羥基乙酸共聚物（PLGA）等。這類材料彌補(bǔ)了無機(jī)材料的不足，在組織工程中應(yīng)用廣泛。然而，這類材料的生物相容性較差，降解產(chǎn)物具酸性，可降低局部的pH值，導(dǎo)致細(xì)胞或組織的活性下降，甚至凋亡[9]。

1.2.3 天然生物材料

天然生物材料具有生物活性，可促進(jìn)細(xì)胞的黏附與生長，并且允許宿主細(xì)胞分泌細(xì)胞外基質(zhì)，并被其取代。常見的有各種膠原、蛋白聚糖、海藻酸鹽和殼聚糖等。其缺點(diǎn)是機(jī)械性能差，三維結(jié)構(gòu)不牢固，降解速率過快。

1.2.4 組織工程復(fù)合載體支架材料

這類支架材料包括：天然材料間復(fù)合、天然材料與合成材料復(fù)合，以及有機(jī)材料與無機(jī)材料復(fù)合[10-12]。比較典型的方法是將膠原蛋白為基礎(chǔ)的支架，摻入其他材料以此來提高機(jī)械強(qiáng)度。利用不同性質(zhì)支架材料合成的組織工程復(fù)合材料，具有足夠的機(jī)械強(qiáng)度和韌性，良好的生物相容性和合適的生物降解速率。既彌補(bǔ)了單一天然生物材料本身存在的機(jī)械強(qiáng)度和韌性不足、降解速率過快等缺陷，也使得人工合成聚合物材料生物相容性差、降解產(chǎn)生細(xì)胞毒性、缺少細(xì)胞識別位點(diǎn)等問題有了很大改善。

1.3 材料的影像學(xué)特征

可降解的無機(jī)材料，由于含有大量鈣、磷、硅等元素，因此結(jié)構(gòu)較為致密，能在X線下顯影，并能與周圍的軟組織區(qū)分開，但是因?yàn)槠涿芏扰c骨接近，所以在骨組織工程中，無法區(qū)分新生骨組織與支架材料。而高分子聚合物材料，由于與軟組織密度較為接近，雖然可以區(qū)分新生骨組織與支架，但是不能很好地區(qū)分支架與軟骨組織，也不能區(qū)分支架與周圍組織的關(guān)系。

2 監(jiān)測支架材料降解的方法

2.1 有創(chuàng)檢測方法

動物實(shí)驗(yàn)中最常用的材料降解檢測方法為標(biāo)本組織學(xué)切片染色法或機(jī)械測量等[13-14]，這些方法均是在固定時間點(diǎn)處死動物，將再生組織取出，然后進(jìn)行相關(guān)的檢測。這些方法可較為直觀、準(zhǔn)確地了解支架材料的降解情況，以及細(xì)胞組織的再生狀況。但缺點(diǎn)亦顯而易見：①需要制備大量的實(shí)驗(yàn)動物，以備在不同的時間點(diǎn)取材；②無法實(shí)現(xiàn)同一動物體內(nèi)連續(xù)的觀察；③動物間存在個體差異，材料在不同個體內(nèi)的降解不一致，可能導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)結(jié)果的誤差；④無法用于臨床。

2.2 非侵入監(jiān)測技術(shù)

為克服上述缺陷，需要建立一種能在同一實(shí)驗(yàn)對象上無創(chuàng)性動態(tài)監(jiān)測組織生長和支架降解的方法。近年來，非侵入成像技術(shù)得到快速發(fā)展，為持續(xù)動態(tài)監(jiān)測體內(nèi)組織工程支架材料的降解提供了可能。

2.2.1 X線計(jì)算機(jī)斷層成像（CT）

CT或Micro－CT常用于非侵入性地檢測支架降解。其特點(diǎn)是操作簡便，有較高的時間和空間分辨率，可以確定材料的相對空間位置、大小，獲取支架材料的三維空間結(jié)構(gòu)信息，安全可靠。研究表明，可以用CT來檢測羥基磷灰石、生物凝膠等支架材料的降解和骨的形成[15-16]。但是，CT只對硬組織成像效果良好，如骨骼、牙齒等；而對低密度的軟組織，如心臟、肝臟、血管及高分子聚合物材料等，效果差，組織間無法區(qū)分，有些甚至無法成像[17-18]。另外，CT只能提供支架材料的表面結(jié)構(gòu)信息，無法探究材料內(nèi)部結(jié)構(gòu)變化及性能的改變。

2.2.2 超聲彈性成像（UEI）

UEI是一個有價值的非侵入性工具，適用于生物組織力學(xué)特性的研究[19-22]。超聲彈性成像的基本原理是對組織施加一個內(nèi)部（包括自身的）或外部的動態(tài)/靜態(tài)/準(zhǔn)靜態(tài)的激勵。在彈性力學(xué)、生物力學(xué)等物理規(guī)律作用下，組織將產(chǎn)生一個響應(yīng)，例如位移、應(yīng)變、速度的分布產(chǎn)生一定改變。利用超聲成像方法，結(jié)合數(shù)字信號處理或數(shù)字圖像處理技術(shù)，可以估計(jì)出組織內(nèi)部的相應(yīng)情況，從而間接或直接反映組織內(nèi)部的彈性模量等力學(xué)屬性的差異。最常用的彈性成像技術(shù)是基于二維相關(guān)的散斑跟蹤方法[23-24]。Owens等[25]應(yīng)用該方法成功監(jiān)測了poly(1,8-octanediol-co-citrate)（POC）合成的支架材料的降解。然而，UEI只能顯示二維彈性成像，無法獲得三維結(jié)構(gòu)信息；支架材料微觀結(jié)構(gòu)上的孔隙大小和數(shù)量也會影響到超聲結(jié)果的準(zhǔn)確性；材料降解時，支架本身的張力發(fā)生變化，其彈性也會相應(yīng)改變，這些都會干擾UEI的準(zhǔn)確性[26-27]。

2.2.3 熒光成像監(jiān)測

Artzi等[28]合成了熒光素標(biāo)記的聚乙二醇及德克薩斯紅色標(biāo)記的膠原蛋白，通過有機(jī)熒光染料共價結(jié)合到支架材料上，形成熒光標(biāo)記的支架材料，并在大鼠模型上成功實(shí)現(xiàn)熒光光學(xué)成像，隨著支架的降解，熒光材料逐漸被代謝排出，通過使用非侵入性的活體成像系統(tǒng)（IVIS）信號，計(jì)算總物質(zhì)熒光的衰減，成功監(jiān)測了支架材料的降解情況。Kim等[29]首次報道利用小鼠模型，通過兩性離子近紅外熒光納米分子探針ZW800-1標(biāo)記膠原支架，并進(jìn)行了長時間體內(nèi)近紅外成像。結(jié)果表明，熒光成像可以實(shí)時示蹤膠原支架在體內(nèi)代謝的動態(tài)過程。熒光分子探針和熒光成像系統(tǒng)可以在細(xì)胞、分子水平上對支架材料的降解情況進(jìn)行示蹤，具有很高的靈敏度，是一種較為新型的非侵入監(jiān)測手段。其不足之處在于：只能二維平面成像，無法獲得三維結(jié)構(gòu)（剖視性）；熒光探針代謝時可能被周圍細(xì)胞吸收，進(jìn)入新生組織，使得難以區(qū)分殘留熒光和原支架材料熒光。故單獨(dú)使用熒光成像監(jiān)測支架材料降解，還存在著較大困難。

2.2.4 放射性元素材料標(biāo)記監(jiān)測

用放射性元素標(biāo)記示蹤法追蹤物質(zhì)的代謝與轉(zhuǎn)歸，是生物學(xué)上常用的方法之一。孫皎等[30-31]創(chuàng)建了一種能直接標(biāo)記聚丙交酯-乙交酯的125I同位素示蹤技術(shù)，可用于分析聚丙交酯-乙交酯降解類生物材料的降解產(chǎn)物在體內(nèi)分布、代謝和評價等問題。然而，同位素示蹤法監(jiān)測材料降解，有可能會造成放射性核素的污染，使其臨床應(yīng)用受到限制。

3 展望

動態(tài)監(jiān)測組織工程支架材料的降解速率是組織工程領(lǐng)域亟待解決的難題之一。以往的組織學(xué)染色法和直接機(jī)械測量法雖能較直觀地檢測支架的降解情況和組織的再生情況，然而是以犧牲動物，材料取出為代價，并不能用于后續(xù)研究，且存在個體誤差，使用動物樣本量大，無法用于臨床等問題。近年來，CT、MRI、UEI、熒光成像等非侵入檢測手段的應(yīng)用，一定程度上讓動態(tài)無創(chuàng)性監(jiān)測體內(nèi)支架材料的降解成為可能。然而由于各自的局限性，其應(yīng)用都受到一定的限制。目前該領(lǐng)域的研究重心，是探索開發(fā)出一種“支架材料探針”，可以與支架材料結(jié)合在一起，并且不影響支架材料的理化、生物性質(zhì)，又能長時間檢測支架的降解情況和組織的再生情況。除了對材料進(jìn)行放射性元素標(biāo)記以外，納米材料技術(shù)的發(fā)展，為材料標(biāo)記提供了新的可能。例如，將熒光金納米團(tuán)簇與支架材料相結(jié)合，利用金納米團(tuán)簇穩(wěn)定的近紅外熒光特性，和對X線強(qiáng)的衰減特性[32]，有望實(shí)現(xiàn)近紅外熒光和CT雙模式成像的方式，建立無創(chuàng)性動態(tài)監(jiān)測支架材料降解速率與組織再生匹配程度的體系，為動態(tài)監(jiān)測支架材料的降解，提供一種新的途徑和思路。

[1]Tabata Y.Biomaterial technology for tissue engineering applications [J].J R Soc Interface,2009,6(Suppl 3):S311-S324.

[2]Bonassar LJ,Vacanti CA.Tissue engineering:the first decade and beyond[J].J Cell Biochem Suppl,1998,30-31:297-303.

[3]Ambrosio AM,Sahota JS,Khan Y,et al.A novel amorphous calcium phosphate polymer ceramic for bone repair:I.Synthesis and characterization[J].J Biomed Mater Res,2001,58(3):295-301.

[4]Wang M.Developing bioactive composite materials for tissue replacement[J].Biomaterials,2003,24(13):2133-2151.

[5]Tancred DC,Carr AJ,McCormack BA.Development of a new synthetic bone graft[J].J Mater Sci Mater Med,1998,9(12):819-823.

[6]Oh SH,Kang SG,Kim ES,et al.Fabrication and characterization of hydrophilic poly(lactic-co-glycolic acid)/poly(vinyl alcohol) blend cell scaffolds by melt-molding particulate-leaching method [J].Biomaterials,2003,24(22):4011-4021.

[7]Liu H,Slamovich EB,Webster TJ.Less harmful acidic degradation of poly(lacticco-glycolic acid)bone tissue engineering scaffolds through titania nanoparticle addition[J].Int J Nanomedicine, 2006,1(4):541-545.

[8]Rowlands AS,Lim SA,Martin D,et al.Polyurethane/poly(lacticco-glycolic)acid composite scaffolds fabricated by thermally induced phase separation[J].Biomaterials,2007,28(12):2109-2121.

[9]Kim SS,Sun PM,Jeon O,et al.Poly(lactide-co-glycolide)/ hydroxyapatite composite scaffolds for bone tissue engineering[J]. Biomaterials,2006,27(8):1399-1409.

[10]Huang YX,Ren J,Chen C,et al.Preparation and properties of poly(lactide-co-glycolide)(PLGA)/nano-hydroxyapatite(NHA) scaffolds by thermally induced phase separation and rabbit MSCs culture on scaffolds[J].J Biomater Appl,2008,22(5):409-432.

[11]Damadzadeh B,Jabari H,Skrifvars M,et al.Effect of ceramic filler content on the mechanical and thermal behaviour of poly-L-lactic acid and poly-L-lactic-co-glycolic acid composites for medical applications[J].J Mater Sci Mater Med,2010,21(9): 2523-2531.

[12]Oh SH,Park SC,Kim HK,et al.Degradation Behavior of 3D porous polydioxanone-b-polycaprolactone scaffolds fabricated using the melt-molding particulate-leaching method[J].J Biomater Sci Polym Ed,2011,22(1-3):225-237.

[13]Sun W,Darling A,Starly B,et al.Computer-aided tissue engineering: overview,scope and challenges[J].Biotechnol Appl Biochem, 2004,39(1):29-47.

[14]Lee SJ,Liu J,Oh SH,et al.Development of a composite vascular scaffolding system that withstands physiological vascular conditions [J].Biomaterials,2008,29(19):2891-2898.

[15]Rhoades GW,Belev GS,Chapman LD,et al.Diffraction-enhanced computed tomographic imaging of growing piglet joints by using a synchrotron light source[J].Comp Med,2015,65(4):342-347.

[16]耿海霞,郭秀娟,錢君榮,等.羥基磷灰石/凝膠納米復(fù)合物修復(fù)兔顱骨缺損的影像學(xué)評估[J].中國組織工程研究,2014(34):5413-5417.

[17]Lerner RM,Waag RC.Wave space interpretation of scattered ultrasound[J].Ultrasound Med Biol,1988,14(2):97-102.

[18]Saldanha KJ,Piper SL,Ainslie KM,et al.Magnetic resonance imaging of iron oxide labelled stem cells:applications to tissue engineering based regeneration of the intervertebral disc[J].Eur Cell Mater,2008,16:17-25.

[19]Ophir J,Cespedes I,Ponnekanti H,et al.Elastography:a quantitative method for imaging the elasticity of biological tissues[J].Ultrason Imaging,1991,13(2):111-134.

[20]Hall TJ,Zhu Y,Spalding CS.In vivo real-time freehand palpation imaging[J].Ultrasound Med Biol,2003,29(3):427-435.

[21]Aglyamov S,Skovoroda AR,Rubin JM,et al.Model-based reconstructive elasticity imaging of deep venous thrombosis[J]. IEEE Trans Ultrason Ferroelectr Freq Control,2004,51(5):521-531.

[22]Luo J,Konofagou EE.Imaging of wall motion coupled with blood flow velocity in the heart and vessels in vivo:a feasibility study [J].Ultrasound Med Biol,2011,37(6):980-995.

[23]Kim K,Jeong CG,Hollister SJ.Non-invasive monitoring of tissue scaffold degradation using ultrasound elasticity imaging[J].Acta Biomater,2008,4(4):783-790.

[24]Herd MT,Hall TJ,Jiang J,et al.Improving the statistics of quantitative ultrasound techniques with deformation compounding: an experimental study[J].Ultrasound Med Biol,2011,37(12): 2066-2074.

[25]Chen X,Xie H,Erkamp R,et al.3-D correlation-based speckle tracking[J].Ultrason Imaging,2005,27(1):21-36.

[26]Oberai AA,Gokhale NH,Doyley MM,et al.Evaluation of the adjoint equation based algorithm for elasticity imaging[J].Phys Med Biol,2004,49(13):2955-2974.

[27]Richards MS,Barbone PE,Oberai AA.Quantitative threedimensional elasticity imaging from quasi-static deformation:a phantom study[J].Phys Med Biol,2009,54(3):757-779.

[28]Artzi N,Oliva N,Puron C,et al.In vivo and in vitro tracking of erosion in biodegradable materials using non-invasive fluorescence imaging[J].Nat Mater,2011,10(9):704-709.

[29]Kim SH,Lee JH,Hyun H,et al.Near-infrared fluorescence imaging for noninvasive trafficking of scaffold degradation[J].Sci Rep,2013,3:1198.

[30]Kim D,Park S,Lee JH,et al.Antibiofouling polymer-coated gold nanoparticles as a contrast agent for in vivo X-ray computed tomography imaging[J].J Am Chem Soc,2007,129(24):7661-7665.

[31]Xie G,Wang C,Sun J,et al.Tissue distribution and excretion of intravenously administered titanium dioxide nanoparticles[J]. Toxicol Lett,2011,205(1):55-61.

[32]Segal NA,Nevitt MC,Lynch JA,et al.Diagnostic performance of 3D standing CT imaging for detection of knee osteoarthritis features[J].Phys Sportsmed,2015,43(3):213-220.

Monitoring of Scaffold Degradation in Tissue Engineering

Tissue Engineering;Scaffold;Degradation;Monitor

R318.1

B

1673－0364（2017）01－0042－03

WANG Xiangsheng,ZHANG Wenjie.
Department of Plastic and Reconstructive Surgery,Shanghai Ninth People's Hospital,Shanghai Jiaotong University School of Medicine,Shanghai Key Laboratory of Tissue Engineering,Shanghai 200011,China;National Tissue Engineering Center of China,Shanghai 200240,China.Corresponding author:ZHANG Wenjie(E-mail:wenjieboshi@aliyun.com).

2016年7月23日；

2016年9月14日）

10.3969/j.issn.1673-0364.2017.01.012

國家自然科學(xué)基金（81271714，31170944）；上海市科委基礎(chǔ)重點(diǎn)研究項(xiàng)目（15JC1490600）。

200011上海市上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院整復(fù)外科，上海市組織工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，組織工程國家工程中心。

張文杰（E-mail：wenjieboshi@aliyun.com）。

【Summary】Biodegradable scaffolds as one of the three main factors in tissue engineering,play an important role in tissue regeneration.An ideal scaffold material must have appropriate degradation rate that could match the forming rate of tissue regeneration process.However,how to monitor the degradation of scaffold materials has been a great challenge in this field. In this paper,the latest literature about monitoring of scaffold degradation in tissue engineering was reviewed.The principle of each method as well as their advantages and disadvantages were summarized and the potential methods were discussed.