微流控芯片分選臨床樣品中循環(huán)腫瘤細(xì)胞的研究進(jìn)展

包建民, 王丹丹, 李優(yōu)鑫(天津大學(xué)藥物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院, 天津化學(xué)化工協(xié)同創(chuàng)新中心, 天津市現(xiàn)代藥物傳遞及功能化高效能轉(zhuǎn)化重點實驗室, 天津 300072)

鄒漢法研究員紀(jì)念專輯(下)·專論與綜述

微流控芯片分選臨床樣品中循環(huán)腫瘤細(xì)胞的研究進(jìn)展

包建民, 王丹丹, 李優(yōu)鑫*
(天津大學(xué)藥物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院, 天津化學(xué)化工協(xié)同創(chuàng)新中心, 天津市現(xiàn)代藥物傳遞及功能化高效能轉(zhuǎn)化重點實驗室, 天津 300072)

癌癥作為常見病正嚴(yán)重威脅著我國乃至全球居民的健康。循環(huán)腫瘤細(xì)胞(CTCs)是一類由癌變部位釋放并進(jìn)入血液中的癌細(xì)胞,其在癌癥的早期診斷、個體化及腫瘤轉(zhuǎn)移機(jī)制研究等方面的作用正逐漸被發(fā)現(xiàn)和認(rèn)可,但由于血液中的CTCs含量極少,對其分選極具挑戰(zhàn)。微流控芯片作為一種微型化、高通量、集成化平臺,在CTCs研究中彰顯了獨特的優(yōu)勢,相關(guān)報道也越來越多。隨著研究的深入,微流控芯片技術(shù)不再局限于基于模型樣品的方法學(xué)開發(fā),而是更注重于能否用于臨床實際樣品中CTCs的檢測,但目前未見該角度的綜述報道。為此,文章綜述了近年來用于臨床實際樣品CTCs分析的微流控芯片分選技術(shù),并探討了微流控芯片用于CTCs分選的發(fā)展趨勢。

臨床樣品;微流控芯片;循環(huán)腫瘤細(xì)胞;分選;綜述

隨著人口老齡化進(jìn)程的加快,我國每年約有160萬人新患癌癥,同時有約130萬人因癌癥死亡,癌癥作為常見的疾病已成為我國乃至全球居民的主要死因。循環(huán)腫瘤細(xì)胞(circulating tumor cells, CTCs)的檢測因在腫瘤早期診斷、治療效果評估、腫瘤復(fù)發(fā)監(jiān)測等方面彰顯了巨大的潛力,已引起廣泛的關(guān)注,并成為當(dāng)前癌癥研究的熱點。1869年,Ashworth首先在血液中發(fā)現(xiàn)CTCs,它是指從原發(fā)病灶或者轉(zhuǎn)移灶脫落后進(jìn)入外周循環(huán)血液系統(tǒng)的腫瘤細(xì)胞[1,2]。CTCs最早出現(xiàn)于腫瘤早期階段,可以作為癌癥早期篩查的項目。同時,CTCs被認(rèn)為是腫瘤發(fā)生轉(zhuǎn)移的必要前提[3,4],它會對宿主組織器官產(chǎn)生威脅,引起病變[5-8]。研究表明約90%的癌癥死亡案例與CTCs擴(kuò)散有關(guān)[1,2],因此CTCs能很好地反映腫瘤的惡性程度及轉(zhuǎn)移能力等信息。由于CTCs在血液中含量極少,每mL血液中約含有1～10個CTCs[5,6],因此在血液中直接檢測CTCs極具挑戰(zhàn)。

20世紀(jì)90年代,Manz等[7]提出了微流控芯片技術(shù),其是通過多學(xué)科交叉將化學(xué)、生物學(xué)、醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域所涉及的樣品預(yù)處理、生化反應(yīng)、分選及檢測等過程集成到幾平方厘米的芯片上,從而實現(xiàn)從樣品前處理到后續(xù)分析的微型化、自動化、集成化和便攜化的技術(shù)。由于微流控芯片的通道在尺寸上與細(xì)胞相匹配,在細(xì)胞分選上顯示出了巨大的應(yīng)用潛力。近些年來,有越來越多的研究者將該技術(shù)應(yīng)用到CTCs的分選上[3,8,9]。根據(jù)分選原理,微流控芯片有基于癌細(xì)胞與正常細(xì)胞或血細(xì)胞間生物學(xué)性質(zhì)(包括細(xì)胞表面蛋白表達(dá)水平、細(xì)胞活性和侵潤能力等)和它們之間物理性質(zhì)(包括尺寸、密度、細(xì)胞表面電荷量和變形性等)差異的兩大類CTCs分選方法。隨著研究的深入和技術(shù)的成熟,不斷有研究者探索微流控芯片細(xì)胞分選方法在臨床實際樣品中的應(yīng)用,但目前未見從實際分選CTCs角度的文獻(xiàn)綜述報道。為此,本文擬從化學(xué)和物理差異兩方面綜述微流控芯片CTCs分選法在臨床樣品中的研究進(jìn)展。

1 化學(xué)性質(zhì)差異(親和性分選)

親和性分選是微流控芯片細(xì)胞分選中最經(jīng)典的方法,通過在芯片內(nèi)部的微結(jié)構(gòu)上固定能與目標(biāo)細(xì)胞結(jié)合的特定的抗體或配體,當(dāng)樣品流經(jīng)微通道時,固定在微通道中的抗體通過與細(xì)胞表面抗原特異性結(jié)合將CTCs捕獲并保留在芯片內(nèi),其他細(xì)胞隨緩沖液流出芯片。常用的CTCs捕獲抗體有人上皮細(xì)胞黏附分子[4](epithelial cell adhesion molecule, EpCAM)和白細(xì)胞共同抗原CD45[10]。親和性分選包括兩種捕獲方式,一種是直接特異性地捕獲目標(biāo)細(xì)胞,稱為陽性分選法;另一種是捕獲并棄除非目標(biāo)細(xì)胞,被稱為陰性分選法。

1.1 陽性分選法

傳統(tǒng)的親和性分選方法是直接將抗體結(jié)合在微流控芯片通道內(nèi)[11],但由于樣品在芯片中多處于層流狀態(tài),只有貼近管壁的細(xì)胞可以和抗體接觸從而被捕獲,分選效率相對較低。針對此問題,學(xué)者們紛紛開發(fā)了多種適用于實際樣品中CTCs檢測的微流控芯片。

Nagrath等[12]開發(fā)了一種名為“CTC-chip”的微柱陣列微流控芯片,將抗-EpCAM抗體固定到微柱上,此設(shè)計增大了細(xì)胞和抗體的接觸面積。他們用此芯片對轉(zhuǎn)移性肺癌、前列腺癌、胰腺癌、乳腺癌、結(jié)腸癌5種癌癥共116例患者血樣進(jìn)行了檢測,在其中115例樣品中成功檢測到了CTCs,檢出率高達(dá)99%,分選速度可達(dá)1～2 mL/h,純度約50%。同時,他們在捕獲的癌細(xì)胞中成功檢測到了腫瘤標(biāo)記物,并通過DNA檢測驗證了實驗結(jié)果,結(jié)果表明此系統(tǒng)適合后續(xù)的分子分析。為了評估CTCs數(shù)量變化與腫瘤體積變化之間的關(guān)聯(lián)性,作者還測試了9例正接受治療的3種癌癥患者不同治療時期的血樣中CTCs的含量,結(jié)合CT掃描結(jié)果所得皮爾森相關(guān)系數(shù)為0.68(P=0.03),說明該方法在癌癥治療效果評估中也有一定的潛力。

Stott等[13]設(shè)計了一種由78 000個結(jié)合有抗-EpCAM抗體的微柱組成的芯片,并配有可以多個垂直焦平面分析、多個發(fā)射光譜信號量化的數(shù)字成像系統(tǒng),以實現(xiàn)CTCs快速準(zhǔn)確的計數(shù)。該系統(tǒng)從19例前列腺腫瘤患者腫瘤切除術(shù)前血樣中成功檢測了8例,CTCs檢測含量為38～222個/mL,從36例轉(zhuǎn)移性前列腺癌患者血樣中檢出23例,CTCs檢出含量為14～5 000個/mL。

為了進(jìn)一步增加癌細(xì)胞與微通道中捕獲抗體的結(jié)合幾率,Wang等[14]設(shè)計了由兩個功能部分組成的芯片,第一功能部分是在芯片頂部嵌入鋸齒狀結(jié)構(gòu),其可使樣品呈渦旋式流經(jīng)芯片頂部,即當(dāng)樣品流經(jīng)芯片內(nèi)部時,頂部的鋸齒形結(jié)構(gòu)可誘導(dǎo)水平流動的液體沿鋸齒垂直流動,增加CTCs與硅納米粒子(silicon nanoparticles, SiNP)襯底之間的接觸頻率。另一功能部分是在芯片底部設(shè)計了涂覆抗-EpCAM的硅納米柱結(jié)構(gòu),該結(jié)構(gòu)可增大細(xì)胞與捕獲抗體的接觸面積。他們用此芯片分析了26例處于不同癌癥階段的前列腺癌患者的外周血樣,分選速度為1 mL/h,并將分析結(jié)果與CellSearch的分析結(jié)果對比,發(fā)現(xiàn):芯片處理1 mL樣品時的捕獲量與用美國食品藥品監(jiān)督管理局唯一認(rèn)證的CellSearch的方法處理7.5 mL樣品所獲得的捕獲量相當(dāng),該結(jié)果證明了該芯片有更高的捕獲效率。

同樣基于增加捕獲抗體與細(xì)胞的接觸頻率的思路,Lu等[15]研發(fā)了一種名為NanoVelcro的芯片系統(tǒng),該芯片不同于Wang等[14]的硅納米柱設(shè)計,其在芯片底部布滿硅制納米線以增加捕獲抗體與CTCs的接觸概率。該系統(tǒng)測試了40例前列腺癌癥患者和12例健康志愿者的血樣,其中,患者血液中CTCs的檢出含量為1～99個CTCs/mL,健康人血液中循環(huán)上皮細(xì)胞(circulating epithelial cells, CECs)的檢出含量為0～2個CECs/mL,分選速度為0.5～1 mL/h,證明NanoVelcro芯片有強(qiáng)大的CTCs捕獲效率,可以有效避免CellSearch方法對大部分晚期前列腺癌癥患者樣品假陰性的問題。鑒于捕獲的細(xì)胞均保有細(xì)胞活性,如果芯片集成其他檢測技術(shù),如基因組、轉(zhuǎn)錄和蛋白質(zhì)組分析模塊,則可獲得捕獲細(xì)胞準(zhǔn)確的分子信息。

在化學(xué)親和分選方法中,較高流速會影響抗原-抗體的吸附作用,因此分選速度一般較低。為了提高芯片系統(tǒng)的分選速度,Hughes等[16]將埃洛石納米管集成在芯片內(nèi)壁,納米管上固定有E-選擇素和抗-EpCAM,其中E-選擇素可以捕獲快速移動的CTCs,而抗-EpCAM可以特異性的捕獲CTCs。納米管既可以保證分選效率,又可提高分選速度(1～4 mL/h),這是因為:1)納米管涂層增加了捕獲表面積,使能結(jié)合到微通道中的捕獲抗體大大增加[17]; 2)納米管由通道壁延伸到通道內(nèi)部液體層,該結(jié)構(gòu)使得結(jié)合在其上的E-選擇素的結(jié)合位點充分暴露在樣品溶液中,增大了捕獲CTCs的概率;3)納米管能夠抑制白細(xì)胞在微通道內(nèi)壁的黏附[18],提高了CTCs的捕獲純度。作者用此芯片分析了乳腺癌和肺癌轉(zhuǎn)移患者的血樣,CTCs的捕獲純度可達(dá)到50%以上,且分選后的癌細(xì)胞在培養(yǎng)條件下可以維持細(xì)胞活性15天。

大多數(shù)親和分選方法所用樣品需要將紅細(xì)胞裂解離心去除,為了簡化實驗步驟,Stott等[19]設(shè)計了一種魚骨結(jié)構(gòu)的親和分選芯片可以直接分析全血樣品,如圖1a所示,魚骨結(jié)構(gòu)中固定有捕獲癌細(xì)胞的EpCAM,魚骨結(jié)構(gòu)可將液體的流動狀態(tài)從層流轉(zhuǎn)變?yōu)闇u流,從而使細(xì)胞更容易與捕獲抗體接觸。該芯片易于操作,通過集成多條微通道至芯片中形成平行陣列,分選速度可達(dá)1 mL/h,捕獲的循環(huán)腫瘤細(xì)胞還可用于其他檢測或細(xì)胞培養(yǎng)。Stott利用魚骨芯片對15例男性前列腺癌癥患者外周血進(jìn)行分選試驗,結(jié)果顯示該芯片在14例血樣中成功捕獲到了CTCs。此芯片還被用于36例轉(zhuǎn)移性前列腺癌癥患者血樣中CTCs的檢測,成功檢出了23例,并通過基因測序成功檢測到了捕獲細(xì)胞裂解液中的TMPRSS2-ERG嵌合轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。此外,在癌癥患者血液分選過程中,作者在芯片中觀察到了細(xì)胞群,這可能與癌癥的轉(zhuǎn)移過程相關(guān),而在模擬樣品(即癌細(xì)胞與正常血液的混合樣品)分析中未見此類現(xiàn)象報道,這進(jìn)一步表明模擬樣品與真實樣品存在一定的差異。

Sheng等[20]對魚骨結(jié)構(gòu)進(jìn)行了優(yōu)化,將寬度均一的魚骨槽尺寸增大到80 μm甚至120 μm。在1 mL/min的通量下,CTCs的捕獲效率提高到90%以上,分選純度大于84%。在18例胰腺癌患者血樣中,17例被檢出CTCs,在健康志愿者血樣中未檢測到CTCs。

眾所周知,CTCs有諸多亞型細(xì)胞,這進(jìn)一步增加了CTCs分選的難度,若將可與多種細(xì)胞表面抗原結(jié)合的抗體同時應(yīng)用于CTCs分選中,在理論上CTCs分選的靈敏度也會相應(yīng)提高。Jackson等[21]將與急性髓性白血病白細(xì)胞相關(guān)的3個細(xì)胞表面抗原(CD33、CD34、CD117)抗體分別固定在3張芯片上,每個芯片包含50組寬25 μm的正弦型通道,血液分別流經(jīng)3張芯片時不同亞型的CTCs最大程度地被捕獲。在25 μL/min的通量下,CTCs的捕獲純度為88%～99%。干細(xì)胞移植后的患者血樣中CTCs監(jiān)測結(jié)果顯示,此法適用于90%以上的患者,不存在多參數(shù)流式細(xì)胞術(shù)采樣頻率低和適用比例(低于50%)低的問題。

上述固載了捕獲抗體的微流控芯片技術(shù)都展示出了較好的CTCs捕獲能力,但在釋放CTCs出微流控芯片以進(jìn)行后續(xù)分析存在較大的困難。為此,學(xué)者們將磁性材料引入到微流控芯片CTCs分選中[22-33],它是將可與細(xì)胞表面抗原發(fā)生免疫反應(yīng)的抗體結(jié)合到磁性材料上,將其置于樣品溶液中,隨后引入到微流控芯片中,施加外界磁場,捕獲了CTCs細(xì)胞的磁性材料可被固定于微流控芯片中并與其他細(xì)胞分離,撤去外界磁場后,可將捕獲細(xì)胞從微流控芯片中釋放出來。

Earhart等[22]在12 μm厚的軟磁合金上制作了尺寸為40 μm×40 μm的微孔陣列,整個芯片大小7 mm×7 mm(見圖1b)。血樣首先與結(jié)合有抗-EpCAM的磁性納米粒子混合孵育,樣品中的CTCs與磁性粒子結(jié)合,當(dāng)樣品流經(jīng)處于外界磁場中的微孔陣列時,未結(jié)合細(xì)胞可穿過微孔,而磁性納米粒子標(biāo)記的CTCs則被磁場捕獲保留在芯片內(nèi)部,關(guān)閉外界磁場,低流速緩沖液沖洗芯片即可收集捕獲的CTCs。此芯片系統(tǒng)首先分析了肺癌細(xì)胞H1650和健康志愿者的全血混合樣品,在0.9 mL/min的流速下,CTCs的捕獲率高達(dá)95.7%。隨后,此芯片又被用于測試6例非小細(xì)胞肺癌患者和5名健康志愿者的實際全血樣品,癌癥患者組檢測出CTCs含量為31～96個/mL,在健康組僅檢出一個CTCs。

圖1 CTCs親和分選裝置(a)魚骨結(jié)構(gòu)微漩渦發(fā)生器[19]、(b)抗體標(biāo)記的磁性粒子捕獲CTCs[22]及(c)速度谷分選芯片、電化學(xué)裂解電極、納米結(jié)構(gòu)傳感器[25]的示意圖 Fig. 1 Schematics of workstation setup of (a) micro-vortex-generating herringbone[19], (b) magnetically labeled target cells captured at the pore edges where high magnetic field gradients exist[22]and (c) the integrated velocity valley (VV) chip featuring capture structures, electrochemical lysis electrodes, and nanostructured sensors[25]for CTCs affinity separation

Saliba等[23]提出了一種利用Ephesia技術(shù)的細(xì)胞分選方法,將生物功能化的超順磁珠放置在微流控芯片通道中,在適度的外場下(10～30 T),偶極-偶極相互作用能克服磁珠的布朗運動并誘導(dǎo)磁珠鏈順磁場方向形成。該系統(tǒng)包括一個底層的流體運輸通道和一個上層的與流體運輸通道交叉的夾管閥。通過控制流速和閥門的開合可以避免液流脈沖對于磁性柱陣列穩(wěn)定性的不利影響。磁珠上結(jié)合的抗-CD19單抗可與B淋巴細(xì)胞特異性結(jié)合以達(dá)到分選的目的。作者用此芯片分析了4例慢性淋巴細(xì)胞白血病、1例套細(xì)胞淋巴瘤、2例濾泡性淋巴瘤共7例患者的血樣,在這些樣品中均成功分選出CTCs。利用Ephesia技術(shù)中使用的功能化磁性珠可以批量生產(chǎn),因此成本大大降低。

Autebert等[24]同樣將Ephesia技術(shù)應(yīng)用于CTCs分選中,并用于上皮性癌癥患者血樣分析,在8例前列腺癌和5例乳腺癌患者血樣中分別檢測出6例和4例,實驗結(jié)果和CellSearch相當(dāng)。此外作者將血樣進(jìn)行梯度離心處理,提高了分選純度以便于下游分析。

在利用免疫磁分選的基礎(chǔ)上,Mohamadi等[25]利用速度谷芯片制作了一個集CTCs捕獲、裂解、mRNA電化學(xué)傳感檢測于一體的分選系統(tǒng)(見圖1c)。芯片分為細(xì)胞捕獲裂解和mRNA檢測兩大功能部分。在第一功能區(qū)域的速度谷芯片中,X型結(jié)構(gòu)使通道中的流體產(chǎn)生速度差,CTCs會滯留在通道中液體流速小的位置,同時EpCAM抗體功能化磁性納米粒子可與CTCs特異性結(jié)合,通過外加磁場即可實現(xiàn)對CTCs的捕獲。通過在細(xì)胞捕獲芯片區(qū)域的交叉電極上施加20 V電壓可將細(xì)胞進(jìn)行電化學(xué)裂解,檢測區(qū)域是由一系列標(biāo)記有可與靶mRNA互補(bǔ)的中性肽核酸探針的納米微電極組成,裂解物轉(zhuǎn)移到傳感檢測區(qū)后孵育30 min,可檢測細(xì)胞中前列腺特異性抗原的mRNA。通過對16例前列腺癌癥患者和7例健康志愿者的血樣測試及對細(xì)胞的免疫染色實驗表明:癌癥患者血樣中CTCs的檢出含量均在15個CTCs/mL以上,而健康志愿者血樣的檢測濃度均低于15個CTCs/mL。該系統(tǒng)在2 mL全血中的CTCs捕獲效率高達(dá)97%,其富集效率可達(dá)500倍,可將CellSearch分選CTCs純度提升兩個數(shù)量級。

Wang等[26]設(shè)計了一種一步CTCs分選芯片,該芯片可直接將CTCs從全血中分離出來。作者將免疫磁珠分離法和魚骨結(jié)構(gòu)的芯片結(jié)合,標(biāo)記有抗EpCAM和表皮生長因子受體抗體的磁珠首先與血樣混合孵育,當(dāng)混合樣品通過魚骨結(jié)構(gòu)的芯片時,位于芯片上方的磁場可將CTCs捕獲并保留在芯片中,通過移除磁場可將CTCs回收并進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)及下游分子分析。此方法分選回收的CTCs具有較高的生物活性且能在較小體積的細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境中達(dá)到細(xì)胞增殖的濃度。在35例肺腺癌患者的血樣中,有5例成功實現(xiàn)了CTCs細(xì)胞增殖,2例血樣中的CTCs的培養(yǎng)時間可達(dá)6個月以上。

Tang等[27]設(shè)計了一種操作簡便的免疫磁珠CTCs分選方法,其在分選裝置中加入了包被在聚二甲基硅氧烷芯片中的鎳點陣列,鎳點尺寸為50 μm×50 μm,兩個相鄰鎳點的縱向間距為100 μm,橫向間距為50 μm,鎳點可以增強(qiáng)磁性粒子局部磁場且可調(diào)節(jié)磁場分布(調(diào)節(jié)精度可到微米級),結(jié)合有抗-EpCAM抗體的磁性納米粒子在外加磁場的作用下會在芯片內(nèi)部形成均一的磁性層,便于CTCs捕獲。細(xì)胞的回收及磁性粒子的解離僅需磷酸緩沖鹽沖洗幾分鐘,此法操作簡單且能保持細(xì)胞活性,被作者成功用于癌癥患者血樣中CTCs分選。

光化學(xué)也可被用于免疫磁力分選CTCs中,Lv等[28]將具有光敏特性的7-氨基香豆素作為連接抗-EpCAM抗體和磁性粒子的橋梁,免疫磁性粒子捕獲CTCs后,通過光照射可使7-氨基香豆素與磁性粒子解離以釋放CTCs,此法避免了磁性粒子對回收CTCs細(xì)胞培養(yǎng)的影響。在癌細(xì)胞系與人血的混合樣品測試實驗中,該系統(tǒng)的CTCs分選效率可達(dá)90%,純度約為85%。在紫外照射下,有90%活細(xì)胞從芯片釋放,近紅外光可到97%的釋放率。13例癌癥患者(肺癌、乳腺癌、肝癌、結(jié)腸癌)血樣中均檢測到了CTCs,而在8例健康志愿者血樣中未檢出CTCs。

1.2 陰性分選法

腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移過程會引起EpCAM表達(dá)水平顯著性降低甚至喪失,因此基于EpCAM的親和分選方法無法應(yīng)用到EpCAM弱表達(dá)或者不表達(dá)的CTCs分選中。同時,陽性分選方法也存在一些問題,如由于癌細(xì)胞亞群不同導(dǎo)致的CTCs檢出量低、捕獲的癌細(xì)胞不易回收或在回收過程中細(xì)胞活性易受影響。

針對這些問題,研究者們開發(fā)了多種不同的陰性分選方法。例如,Lee等[34]設(shè)計了一種叫“μ-MixMACS”的芯片,此芯片包括兩個功能模塊,分別是多渦旋混合模塊和磁力細(xì)胞分選模塊。首先使用溶血緩沖液去除血樣中的紅細(xì)胞,然后樣品在有多個弧形通道的芯片中與標(biāo)記有抗-CD45抗體的磁性納米粒子充分混合,樣品中的白細(xì)胞與抗-CD45抗體特異性結(jié)合,當(dāng)外界加入磁場時,白細(xì)胞保留在芯片中,而其他的細(xì)胞會隨緩沖液流出而被收集。在10例乳腺癌患者血樣檢測實驗中,該系統(tǒng)成功在5例樣品中檢出CTCs?！唉?MixMACS”芯片的分離過程無需長時間的孵育且能實現(xiàn)CTCs的連續(xù)分離,此方法不受癌細(xì)胞表面抗體表達(dá)量和細(xì)胞亞型的影響從而使CTCs的檢出量大大增加。因此,“μ-MixMACS”芯片可以用于收集各種類型CTCs。

Sajay等[35]設(shè)計了一種兩步陰性CTCs分選平臺,首先在磁場的作用下利用標(biāo)記有抗-CD45抗體的磁性粒子除去血液中的白細(xì)胞,然后樣品流經(jīng)9 μm的狹縫薄膜時尺寸較小的紅細(xì)胞、血小板等細(xì)胞通過狹縫,而尺寸較大的CTCs保留在芯片中。為了測試該系統(tǒng)在臨床中應(yīng)用的效果,作者測試了12例非小細(xì)胞肺癌和3例結(jié)直腸癌患者的血液樣品,此系統(tǒng)成功檢測到所有樣品中的CTCs。此方法具有3方面優(yōu)勢:1)2 mL全血樣品完成分析過程僅需60 min,可以滿足快速分析的要求;2)無需離心去除白細(xì)胞或加入化學(xué)試劑除去紅細(xì)胞,免去了繁瑣的樣品前處理過程,而且白細(xì)胞和CTCs的回收率均大于90%; 3)由于整個分析過程未加入化學(xué)試劑,所以回收的細(xì)胞依舊保持生物活性,可以進(jìn)一步進(jìn)行蛋白質(zhì)或核酸內(nèi)容物的分析。

2 物理性質(zhì)差異

血細(xì)胞和癌細(xì)胞存在很大的物理性質(zhì)差異,如密度、大小、形狀和變形性以及在流場中的力學(xué)特性等。根據(jù)其不同的物理特點,通過設(shè)計不同的微結(jié)構(gòu)單元可將CTCs從血液中分離出來,常用的微結(jié)構(gòu)包括微孔陣列、微過濾膜和微柱等。

基于物理性質(zhì)差異的分選方法不依賴細(xì)胞表面標(biāo)志物,操作簡單成本低,且分選后收集的CTCs可以結(jié)合多種抗體進(jìn)行標(biāo)志物鑒別,而且樣品流速大能夠?qū)崿F(xiàn)高通量分選。但在尺寸上CTCs和白細(xì)胞有重疊,分選后的細(xì)胞中可能混有白細(xì)胞,而且在較大的機(jī)械力作用下,CTCs流經(jīng)微孔或者濾網(wǎng)時容易破裂[36],這會導(dǎo)致分離純度和細(xì)胞活性降低。

2.1 尺寸差異和變形性差異

2010年,Tan等[37,38]利用癌細(xì)胞和血細(xì)胞在尺寸和變形性上的差異設(shè)計了一種芯片分離平臺,芯片的過濾部分是由3根呈圓弧形排布的微柱組成的陣列,微柱間間隙5 μm,以保證只有尺寸較大的癌細(xì)胞不能通過,且每個過濾單元捕獲一個癌細(xì)胞,既達(dá)到分離的目的又避免了CTCs堆積造成的堵塞。作者選用5組肺癌轉(zhuǎn)移患者的血樣對此裝置進(jìn)行了測試,實驗結(jié)果達(dá)到了100%的檢測率和50%的捕獲率,平均分選純度為83%。此裝置的優(yōu)點是樣品不需要預(yù)處理而且完成細(xì)胞的分選僅需一步,該系統(tǒng)可以直接回收活性癌細(xì)胞以便下游分析。

Lv等[39]設(shè)計了一種具有高純、高效優(yōu)點的間距遞減的CTCs分選芯片。該芯片由過濾和捕獲兩部分組成,過濾部分由間距為50 μm的微柱陣列組成,可以減少細(xì)胞堵塞;捕獲部分由間距從12 μm到4 μm遞減的10列微柱組成,尺寸較小且變形性高的血細(xì)胞可通過間距較小的微柱進(jìn)入廢液槽,而尺寸較大的腫瘤細(xì)胞和部分白細(xì)胞則進(jìn)入旁側(cè)回收槽。該裝置的CTCs的分選效率大于90%,純度約為90%。作者通過裂解將紅細(xì)胞除去可以很大程度地提高分選速度并可以減輕細(xì)胞堵塞的影響。此芯片在取樣的10例肝癌患者血樣中均檢測到CTCs。

聚對二甲苯(Parylene)是一種具有較好生物相容性的材料。2010年,Lin等[40]采用Parylene微孔薄膜設(shè)計了一種CTCs分選芯片,為了比較此芯片與CellSearch在檢測靈敏度上的差異,作者將10個培養(yǎng)的癌細(xì)胞混入10 mL健康志愿者的血樣中,取7.5 mL作為分選樣品,每個裝置測試5組樣品,其中,該系統(tǒng)在5組樣品中均至少檢測到1個CTCs,而CellSearch僅在3組樣品中檢測到CTCs。之后,他們利用此裝置和CellSearch分別測定57例癌癥患者血液樣品,其中微孔薄膜分選系統(tǒng)可以確定的有51例,而CellSearch僅能確定26例。由此可以看出微孔薄膜分選系統(tǒng)較CellSearch有更高的檢測靈敏度,且由于Parylene具有很好的透光性,該系統(tǒng)可以實現(xiàn)在顯微鏡上直接觀察芯片中的細(xì)胞。

2012年,Lim等[41]同樣利用癌細(xì)胞和血細(xì)胞在大小和變形性上的差異,使用有105個密集孔陣列的硅材料快速分析了血液中的CTCs,陣列中孔直徑為10 μm,孔間距為15 μm。在對人乳腺癌細(xì)胞(MCF-7)和人肝癌細(xì)胞(HepG2)與血液的混合樣品測試時得到了大于80%的回收率,為了進(jìn)一步驗證此芯片在實際樣品測試中的可行性,作者又用8例癌癥患者的血樣作為樣品進(jìn)行分析,該芯片成功地檢測到CTCs,從進(jìn)樣到得到測試結(jié)果僅需要1.5 h。由于Lim將芯片嵌合入熒光顯微鏡中,因此該芯片實現(xiàn)了集CTCs捕獲、計數(shù)、鑒定、免疫熒光染色的一體化。

2013年,Hosokawa等[42]依據(jù)細(xì)胞間尺寸的差異設(shè)計了特定的微腔大小和幾何結(jié)構(gòu)以分選CTCs。該系統(tǒng)的核心結(jié)構(gòu)由104個直徑為8～9 μm的微腔陣列組成,樣品通過蠕動泵進(jìn)入芯片,尺寸較小的血細(xì)胞通過微腔隨緩沖液流出,尺寸較大的腫瘤細(xì)胞則由于負(fù)壓作用被固定在圓孔上。該芯片測試了8種癌細(xì)胞與健康人血液的混合樣品,其分離效率高達(dá)97%,遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于同一實驗樣本采用CellSearch系統(tǒng)的分選效率,并且細(xì)胞活性不會被破壞。在臨床試驗中,作者用微腔陣列和CellSearch兩種方法分別對22例非小細(xì)胞肺癌和21例小細(xì)胞肺癌患者樣品進(jìn)行檢測,該系統(tǒng)的檢出率高達(dá)77%和95%,而CellSearch的檢出率僅為32%和57%,兩者在7.5 mL血樣中檢出CTCs的量分別為2～2 329個和0～325個。實驗結(jié)果表明微腔陣列分選芯片較CellSearch有更高的CTCs檢測靈敏度。

分選芯片復(fù)雜的制作步驟和昂貴的制作成本限制了其在臨床中的應(yīng)用,因此很有必要開發(fā)一種簡單、可靠、價格低廉的芯片。Huang等[43]設(shè)計了一種基于細(xì)胞尺寸差異的過濾式分選芯片。該芯片由86對互相平行的主通道和旁通道組成,主通道和旁通道中間隔有分離通道,主通道寬50 μm,深50 μm,分離通道寬20 μm,深2～8 μm。主通道的一端直接與進(jìn)樣口相連,另一端則被封閉。細(xì)胞進(jìn)入芯片主通道時,尺寸較小的血細(xì)胞可以通過分離通道進(jìn)入旁通道進(jìn)而在廢液池被收集,而尺寸較大的癌細(xì)胞則被保留在主通道內(nèi)。此芯片的制作非常簡單,僅需要將模塑成型的聚二甲基硅氧烷(polydimethylsiloxane, PDMS)黏合在玻璃基片上,在芯片的進(jìn)樣口連接一個注射泵即可。使用該芯片在60例肺癌患者血樣中成功檢出58例,CTCs平均檢測含量為18.6個/mL。該芯片具有制作簡單成本低、實驗操作簡單易行且結(jié)果真實可靠的優(yōu)點。

Adams等[44]將孔徑為7 μm的CellSieveTM過濾芯片用于CTCs分選。如圖2所示,一次性的CellSieveTM過濾芯片置于支撐槽中,血樣樣品由裝置上部加入并流經(jīng)過濾芯片時尺寸較大的CTCs保留在芯片中,其他細(xì)胞隨緩沖液進(jìn)入注射器中,分選過程結(jié)束后將含有細(xì)胞廢液的注射器換成裝有磷酸鹽緩沖液的注射器,并將此裝置反轉(zhuǎn),手動將緩沖液推入支撐槽中即可實現(xiàn)CTCs回收。作者選用10例乳腺癌和6例前列腺癌患者血樣進(jìn)行測試,此裝置不僅可以成功分選出CTCs并且可以完成細(xì)胞原位鑒定及細(xì)胞回收相關(guān)實驗。CellSieveTM過濾芯片無自發(fā)性熒光且有生物惰性,因此可以實現(xiàn)捕獲細(xì)胞的原位免疫熒光染色鑒別和細(xì)胞培養(yǎng)。此裝置集CTCs捕獲、培養(yǎng)、鑒定、多種分子水平分析于一體,結(jié)構(gòu)簡單,分選過程無需對血樣進(jìn)行前處理,可以滿足商業(yè)化、臨床化的要求。

Chudziak等[45]將Parsortix系統(tǒng)的CTCs分選和血漿中游離循環(huán)DNA檢測結(jié)合,如圖2所示,一次性的Parsortix芯片中有多個并列的寬度呈階梯狀遞減的通道,通道最窄處10 μm,由于CTCs較大的尺寸及不易變形的特性,CTCs被保留在通道的最窄處,通過反方向沖洗芯片即可回收CTCs,離心獲得血漿中的游離循環(huán)DNA由核酸檢測試劑盒檢測。將此方法與CellSearch方法同時對12例肺癌患者樣品測試,此方法在全部血樣中均檢測出CTCs,而CellSearch檢出10例。此方法的優(yōu)勢在于:分選系統(tǒng)適用于室溫存放4天之久的全血樣品而且將CTCs芯片分選與血漿中游離循環(huán)DNA檢測結(jié)合,獲取的CTCs信息更加全面。

圖2 一次性Parsortix盒整體及截面結(jié)構(gòu)示意圖[45]Fig. 2 Schematic of the disposable cassette andgraphical representation of the cross-section of the cassette[45]

2.2 力學(xué)性質(zhì)差異

慣性分選也被用于CTCs檢測,其原理是芯片中的粒子受到慣性遷移和彎流道中的二次流效應(yīng)的影響,在特定雷諾數(shù)條件下遷移至特定的平衡位置,形成聚焦流動,從而實現(xiàn)不同種類細(xì)胞的分選。通常慣性分選采用的流速較高,雷諾數(shù)在100左右,且分選通道可平行集成,因而具有較高的通量。

Sollier等[46]設(shè)計了一種具有8列并聯(lián)管道,每個管道含8個縮擴(kuò)單元的高通量分選芯片,其中壓縮單元寬40 μm,擴(kuò)張儲液槽寬480 μm、長720 μm?？s擴(kuò)結(jié)構(gòu)中的慣性升力和流道結(jié)構(gòu)誘導(dǎo)產(chǎn)生的渦流將不同細(xì)胞置于不同的平衡位置,直徑較大的癌細(xì)胞受較大的梯度剪切升力遠(yuǎn)離管道中心,保留在擴(kuò)張儲液槽中,而直徑較小的血細(xì)胞則留在主流體中隨液體流出芯片,通過減低流速削弱渦流的作用可收集保留在芯片中的CTCs。在4 mL/min的高通量下,該芯片分離癌細(xì)胞和健康人血液混合樣品的效率可達(dá)85%。同時,作者用該系統(tǒng)檢測了12例乳腺癌和小細(xì)胞肺癌病人的血液樣本,其中9例被成功檢出。

Hyun等[47]同樣將縮擴(kuò)結(jié)構(gòu)用于細(xì)胞分選,4組縮擴(kuò)結(jié)構(gòu)平行集成在一張芯片上,通道中的收縮單元寬60 μm、長150 μm,擴(kuò)張單元寬300 μm、長300 μm,通道深度為60 μm,每組微通道末端有3個收集口,位于通道中間的出口收集癌細(xì)胞,兩側(cè)的出口收集白細(xì)胞等。在樣品進(jìn)口和收集口分別安裝一個注射泵以使液體在微通道中連續(xù)且穩(wěn)定的流動。為了避免在樣品處理過程中產(chǎn)生的異質(zhì)碎片堵塞通道,作者在分離通道的前面加了一個過濾器,過濾器的加入不僅可以除去樣品中的碎片同時增加了芯片的使用壽命。他們分別分析了MCF-7與白細(xì)胞混合樣品和MDA-MB-231與白細(xì)胞混合樣品,兩種癌細(xì)胞分選率分別為94%和92%。該系統(tǒng)又被用于檢測24例轉(zhuǎn)移乳腺癌患者的血液樣品,其中有19例樣品成功檢測到了CTCs。為了鑒定回收的CTCs,作者分別檢測了癌癥細(xì)胞特征蛋白和DNA,發(fā)現(xiàn)細(xì)胞角蛋白陽性、細(xì)胞表面CD45陰性和DNA陽性,結(jié)果表明此芯片可以成功地將CTCs和白細(xì)胞分離。但分離微通道的平行化集成導(dǎo)致出口太多,不便于操作,并且此方法每次取樣量為7.5 mL, CTCs檢出數(shù)量僅為0～21個,該分選系統(tǒng)的檢測靈敏度較低。

在螺旋通道內(nèi)的細(xì)胞會受到慣性升力和Dean拽力的共同作用而聚焦在不同平衡位置,Warkiani等[48]利用此原理設(shè)計了一種梯形截面螺旋通道芯片,相對常見的矩形截面而言,梯形截面能拉大平衡時尺寸不同細(xì)胞的距離,在細(xì)胞分選純度上更有優(yōu)勢,此裝置通量可達(dá)1.7 mL/min, CTCs回收率高于80%, 10例轉(zhuǎn)移性乳腺癌和肺癌患者樣品中均被檢測到了CTCs, CTCs檢出含量為3～125個/mL。

同樣基于慣性分選原理,Khoo等[49]設(shè)計了一種由3組并聯(lián)螺旋通道組成的微流控芯片分選系統(tǒng),該系統(tǒng)實現(xiàn)了大于7.5 mL/min的超高速分選,在56例乳腺癌和肺癌患者樣品中均檢測到了CTCs,其中乳腺癌患者血樣的CTCs檢出含量為12～1 275個/mL,乳腺癌患者血樣的CTCs檢出含量為10～1 535個/mL。但該法需要樣品進(jìn)行離心裂解除去血漿和紅細(xì)胞等前處理,操作過程繁瑣且有可能導(dǎo)致CTCs的丟失。

圖3 (a)尺寸過濾+免疫磁力分選[50]和(b)確定性側(cè)向偏移+慣性+磁性分選多級分選結(jié)構(gòu)[51]Fig. 3 Schematic illustrations of multistage separationof (a) size-based filtration+immunomagnetics[50]and(b)hydrodynamic cell sorting+inertial focusing+magnetophoresis[51]

3 多種技術(shù)結(jié)合

目前,已經(jīng)報道了多種技術(shù)相結(jié)合的分選方法[50-55], Chang等[50]將免疫磁力分選技術(shù)和尺寸過濾技術(shù)相結(jié)合分選了CTCs,如圖3a所示,此系統(tǒng)由1張微孔直徑為8 μm的芯片、2個分別位于芯片頂部和底部的磁鐵組成。首先,免疫磁性分選方法將CTCs與其他血細(xì)胞分離;然后,水平移動芯片頂部的磁力較弱的磁鐵促使過量的磁性粒子從微孔流出,從而獲取純CTCs。分析不同類型癌癥樣品時,他們將多種結(jié)合有不同抗體的磁性粒子混合使用,50例肺癌和腺癌患者血樣中有49例被檢出CTCs,患者在治療前后血樣中CTCs數(shù)量的變化也被成功追蹤,結(jié)果表明:治療前后CTCs的數(shù)量確有顯著性差異,可以作為治療效果評估的手段。在保證分選效率和純度的基礎(chǔ)上,該系統(tǒng)分選速度可達(dá)2 mL/min,克服了親和分選方法中速度低、CTCs不易洗脫或回收樣品中磁性粒子難以去除及物理分選方法中回收CTCs純度低的問題。

Ozkumur等[51]開發(fā)的名為CTC-iChip的多級微流控芯片也被用于實際樣品分析。該芯片分為3部分,見圖3b。首先,樣品依據(jù)尺寸差異經(jīng)流體動力學(xué)初選,即全血和免疫磁珠混合樣品通過間隔32 μm的微柱陣列時,紅細(xì)胞、血小板、血漿蛋白、游離磁珠和其他血液組分被丟棄并通過頂部出口流出。隨后,正弦型慣性微流道將白細(xì)胞和CTCs聚焦,連接特定抗體的磁珠與相應(yīng)的細(xì)胞結(jié)合。最后,磁場力將連接磁珠的細(xì)胞與其他細(xì)胞分開,在收集口處收集CTCs。該系統(tǒng)可以根據(jù)分選細(xì)胞類型的不同選擇陽性或陰性分選模式,分別適用于EpCAM高表達(dá)的上皮性癌細(xì)胞和EpCAM低水平表達(dá)的非上皮性癌細(xì)胞,CTC-iChip對EpCAM表達(dá)水平不同的癌細(xì)胞均有較好的捕獲效率。在8 mL/h的分析速度下,該芯片CTCs捕獲率高達(dá)97%。作者用患者樣品測試了該系統(tǒng)的陰性模式,成功地在41例前列腺癌患者樣品中檢出37例。同法分析了10例轉(zhuǎn)移性乳腺癌患者樣品,并對捕獲的CTCs染色,將其與處于乳腺癌早期的細(xì)胞進(jìn)行對比,發(fā)現(xiàn)分選獲得的CTCs與之形態(tài)相似。實驗結(jié)果表明:CTC-iChip是一種不完全依賴腫瘤細(xì)胞膜抗原的、無偏的、廣泛適用的且高通量的分選系統(tǒng)。

4 結(jié)論與展望

微流控芯片具有體積小、通量高、操作簡便、樣品和試劑消耗量少、便于集成多種分析檢測模塊等優(yōu)點,使其在細(xì)胞分選方面具有一定的優(yōu)勢,本文總結(jié)了近些年已經(jīng)用于臨床樣品中CTCs分選捕獲的微流控芯片系統(tǒng),可以看出這些方法均可分選實際樣品中的CTCs,具有較好的分選效率和收集純度。免疫親和性分選法具有特異性強(qiáng)和純度高的優(yōu)點,以及分選速度慢、通量低、成本高的不足,同時上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)換的作用使得細(xì)胞表面抗體表達(dá)水平具有多變性[56,57],親和性分選方法僅適用于特異性抗體高表達(dá)的癌細(xì)胞分選?；谖锢聿町惖姆诌x方法實驗簡單、易行,不需加入抗原抗體等昂貴試劑,成本低,分選過程不會引起細(xì)胞表型變化,分選出的CTCs可進(jìn)行單細(xì)胞基因組測序、轉(zhuǎn)錄組測序等下游分析,但該法CTCs檢出量偏低,這是由于CTCs會與白細(xì)胞黏附或相互作用,同時因白細(xì)胞和CTCs存在一定程度的尺寸重合,該法細(xì)胞分選純度也較低。

微流控芯片在CTCs分選中也面臨一些技術(shù)上的挑戰(zhàn),如1)芯片通道空間小,實驗過程中通道容易堵塞;2)芯片制作需要精密儀器,故造價昂貴不利推廣;3)在進(jìn)行細(xì)胞分選時,有些方法難以確保較高的細(xì)胞活性。

盡管如此,不斷有新型微流控分選系統(tǒng)被成功應(yīng)用到臨床樣品CTCs分選中。目前,該技術(shù)發(fā)展趨勢如下:1)單一分選方法都存在不足,同一塊芯片上多種分選技術(shù)的融合互補(bǔ)將增加分析系統(tǒng)的魯棒性;2)細(xì)胞內(nèi)分子分析和CTCs表征有助于臨床上治療方案的選擇決策,在芯片上集成樣品預(yù)處理、CTCs分選、細(xì)胞計數(shù)、內(nèi)容物分析等功能單元,使CTCs分選集成化、一體化;3)制備廉價、便攜、易于床邊實時監(jiān)控診斷的多功能微流控芯片。隨著技術(shù)的不斷完善,我們相信微流控技術(shù)在CTCs研究中將逐漸發(fā)揮更重要的作用。

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Application advances of microfluidic chips for sortingcirculating tumor cells in clinical samples

BAO James Jianmin, WANG Dandan, LI Youxin*
(SchoolofPharmaceuticalScienceandTechnology,TianjinUniversity,CollaborativeInnovationCenterofTianjinChemicalEngineering,TianjinKeyLaboratoryforModernDrugDelivery&High-Efficiency,Tianjin300072,China)

Cancer is becoming a common disease threatening seriously to the human health. Circulating tumor cells (CTCs) is a kind of cancer cells released from tumors and circulates with bloodstream. It is gradually discovered of the potential value of CTCs in diagnosis of cancer in initial stage, individual treatment and research of metastasis mechanism. However, it is a very challenge task for sorting the extremely few CTCs in blood. Microfluidic chip, a miniaturized, high-throughput and integrated platform, shows the unique advantages in the study of CTCs. With the progress of the research, the technology is no longer limited to the development of sorting method based on model samples, but scientists pay more attention to the analysis of clinical samples. To the best of our knowledge, there has been no paper summing up the progress of microfluidic chip techniques applied to the analysis of clinical samples recently. This review focuses on those microfluidic techniques that have been applied to sorting CTCs from the blood of cancer patients. Meanwhile, we predict the trends of sorting CTCs in clinical samples using microfluidic chip technology.

clinical samples; microfluidic chip; circulating tumor cells (CTCs); sorting; review

10.3724/SP.J.1123.2016.09005

2016-09-01

國家自然科學(xué)基金項目(21375093,21605112);高等學(xué)校博士學(xué)科點專項科研基金項目(20130032120081);天津市應(yīng)用基礎(chǔ)與前沿技術(shù)研究計劃青年項目(15JCQNJC43200).

Foundation item: National Natural Science Foundation of China (Nos. 21375093, 21605112); Special Research Found for the Doctoral Program of Higher Education (No. 20130032120081); Youth Fund of the Science and Technology Committee of Tianjin Municipal Government (No. 15JCQNJC43200).

O658

:A

:1000-8713(2017)01-0129-09

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