基于超聲波誘導(dǎo)孢子萌發(fā)與糖化酶活力表征移種策略高效合成檸檬酸

王寶石, 陳堅,2, 孫福新, 龐海強, 李由然, 張梁, 丁重陽, 顧正華, 石貴陽*

1(江南大學(xué),糧食發(fā)酵工藝與技術(shù)國家工程實驗室，江蘇 無錫， 214122)2(江南大學(xué),工業(yè)生物技術(shù)教育部重點實驗室，江蘇 無錫， 214122)3(江蘇國信協(xié)聯(lián)能源有限公司，江蘇 宜興，214200) 4(山東省費縣檢驗檢測中心，山東 費縣，273400)

基于超聲波誘導(dǎo)孢子萌發(fā)與糖化酶活力表征移種策略高效合成檸檬酸

王寶石1, 陳堅1,2, 孫福新3, 龐海強4, 李由然1, 張梁1, 丁重陽1, 顧正華1, 石貴陽1*

1(江南大學(xué),糧食發(fā)酵工藝與技術(shù)國家工程實驗室，江蘇 無錫， 214122)2(江南大學(xué),工業(yè)生物技術(shù)教育部重點實驗室，江蘇 無錫， 214122)3(江蘇國信協(xié)聯(lián)能源有限公司，江蘇 宜興，214200) 4(山東省費縣檢驗檢測中心，山東 費縣，273400)

檸檬酸作為最成熟的平臺化合物，近年來在新型行業(yè)的應(yīng)用需求呈現(xiàn)出逐漸增長的趨勢，實現(xiàn)其高效生產(chǎn)具有重要的現(xiàn)實意義。針對檸檬酸傳統(tǒng)發(fā)酵方式中存在的種子培養(yǎng)前期延滯期長與發(fā)酵菌種活力波動大的缺陷，采用超聲波預(yù)處理黑曲霉孢子120 s，誘發(fā)孢子級聯(lián)反應(yīng)而活化孢子，提高種子活力，縮短種子培養(yǎng)時間1.5 h，發(fā)酵效率提升8.13%；發(fā)酵罐水平系統(tǒng)研究種子整個生命周期中的關(guān)鍵指標(biāo)變化規(guī)律，發(fā)現(xiàn)自身分泌的糖化酶能夠直觀反映細(xì)胞活力，以此為移種標(biāo)準(zhǔn)，契合檸檬酸同步糖化發(fā)酵的特點。集成超聲波誘導(dǎo)孢子萌發(fā)與糖化酶活力表征移種的策略，獲得高活力發(fā)酵菌種，總發(fā)酵時間縮短7.9 h，發(fā)酵產(chǎn)率提升11.76%，實現(xiàn)了檸檬酸高效合成。研究結(jié)果同時對于絲狀真菌或類似微生物為主體的發(fā)酵過程具有良好借鑒意義。

超聲波誘導(dǎo)；黑曲霉孢子；同步糖化發(fā)酵；檸檬酸；糖化酶

檸檬酸(citric acid)又名枸櫞酸，是一種重要的、多功能的有機酸，廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥，化工等領(lǐng)域[1-3]；同時檸檬酸是最成熟的平臺化合物，伴隨著生物聚合、藥物運輸、 細(xì)胞培養(yǎng)等新興產(chǎn)業(yè)領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用[4-5]，現(xiàn)每年以5%的速度增長，是世界第二大發(fā)酵產(chǎn)品，產(chǎn)量僅次于酒精[6]；因而，檸檬酸的發(fā)酵生產(chǎn)一直是學(xué)者關(guān)注的熱點[7-8]。

黑曲霉由于酶系豐富，發(fā)酵效率高、副產(chǎn)物少等優(yōu)勢，是檸檬酸生產(chǎn)最重要的發(fā)酵菌種[9-10]。發(fā)酵法生產(chǎn)檸檬酸研究方向主要集中在廉價原料開發(fā)[11-13]，發(fā)酵過程菌絲體形態(tài)控制[14-16]，新型發(fā)酵模式探索[2, 12, 17]等方面，而關(guān)于發(fā)酵罐中黑曲霉整個生命周期中生長規(guī)律及高活力種子培養(yǎng)方法卻鮮有報道[15]。黑曲霉屬產(chǎn)孢微生物，孢子萌發(fā)是絲狀真菌整個生命周期的關(guān)鍵步驟[18]，是啟動發(fā)酵過程的重要元件[19]，它會顯著影響種子生長與活力[20-22]；孢子萌發(fā)過程包括孢子活化與腫脹發(fā)芽兩個階段，它是對變換環(huán)境條件的生理性應(yīng)答[23]。在種子培養(yǎng)過程的前期，孢子萌發(fā)需要較長的延滯期，從而延長了種子培養(yǎng)時間，尤其是在工業(yè)化生產(chǎn)中，增加了發(fā)酵設(shè)備運行時間，提高了運行成本。成熟種子轉(zhuǎn)接時機也是影響發(fā)酵的重要因素，而在現(xiàn)有發(fā)酵過程中，移種時機選擇多帶有經(jīng)驗性，往往依據(jù)搖瓶培養(yǎng)優(yōu)化的參數(shù)，仍然以種齡作為移種時機的關(guān)鍵指標(biāo)[24-25]；種子培養(yǎng)過程的動態(tài)性與復(fù)雜性引起的發(fā)酵菌種活力波動大而難以滿足實際生產(chǎn)需求，往往會引起發(fā)酵過程波動，進而影響發(fā)酵效率。如何縮短孢子萌發(fā)時間，培養(yǎng)高活力的種子，選擇合適移種時機對于提高檸檬酸發(fā)酵效率至關(guān)重要。

本研究基于絲狀真菌孢子萌發(fā)的生理性特點，提出超聲波激活孢子，誘發(fā)孢子萌發(fā)級聯(lián)反應(yīng)，縮短種子培養(yǎng)周期，提高種子活力；在發(fā)酵罐中培養(yǎng)黑曲霉種子，系統(tǒng)研究黑曲霉整個生命周期中的特征生理參數(shù)變化規(guī)律，同時基于檸檬酸淀粉質(zhì)粗料發(fā)酵模式與同步糖化發(fā)酵(simultaneous saccharification and fermentation，SSF)的特點，提出以種子糖化酶活力表征的移種策略。組合超聲波預(yù)處理誘導(dǎo)孢子快速萌發(fā)培養(yǎng)種子與種子糖化酶活力表征的移種策略，縮短種子培養(yǎng)時間，提高了種子活力，實現(xiàn)檸檬酸的高效合成。

1 材料與方法

1.1 菌種與培養(yǎng)基

1.1.1 菌種

黑曲霉H 915(Aspergillusniger，檸檬酸生產(chǎn)菌株)。

1.1.2 培養(yǎng)基

斜面培養(yǎng)基：PDA培養(yǎng)基。

玉米粉液化過程：玉米粉與水按照1∶3質(zhì)量比混合均勻，調(diào)節(jié)pH至5.8～6.0，添加耐高溫α-淀粉酶30 U/g玉米粉，90 ℃保溫，并不斷攪拌均勻，至碘試合格為止，得玉米液化混液；液化混液經(jīng)布氏漏斗抽濾，得液化清液。

種子培養(yǎng)基：玉米液化混液，添加硫酸銨與水按照一定的比例混合，調(diào)節(jié)總糖11%～12%，總氮0.23%～0.25%。

發(fā)酵培養(yǎng)基：玉米液化清液、玉米液化混液與水按照一定的比例混合，調(diào)節(jié)總糖16%～16.5%，總氮0.08%～0.09%。

1.2 儀器與設(shè)備

高轉(zhuǎn)速搖床，江蘇太倉市強樂實驗設(shè)備有限公司；恒溫培養(yǎng)箱，上海躍進醫(yī)療器械廠；紫外及可見光分光光度計UV2450，日本Shimazu公司；高效液相色譜系統(tǒng)及工作站，美國戴安公司；臺式高速離心機，德國Eppendorf公司；24-L發(fā)酵罐，江南大學(xué)自動化研究所與浙江新昌德力石化設(shè)備有限公司聯(lián)合研制；凱式定氮儀+凱式消化爐UDK159，意大利VELP。

1.3 培養(yǎng)方法

菌種活化及保存：將保藏的黑曲霉孢子轉(zhuǎn)接至茄子瓶，37 ℃恒溫培養(yǎng)箱倒置培養(yǎng)7 d，置于4 ℃冰箱中保存，備用。

孢子懸液制備：用無菌水洗下孢子，用玻璃珠打撒孢子，用血球計數(shù)板計數(shù)。

超聲波預(yù)處理孢子：將制備的濃度為4×105個/mL黑曲霉孢子懸液置于超聲波清洗儀中超聲處理120 s，立即接種種子培養(yǎng)基。

搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)：250 mL搖瓶，裝液量40 mL，培養(yǎng)溫度37 ℃，搖床轉(zhuǎn)速320 r/min，培養(yǎng)72 h結(jié)束發(fā)酵檢測。

24L發(fā)酵罐種子培養(yǎng)：黑曲霉孢子懸液以濃度4×105個/mL接種，裝液量18 L，培養(yǎng)溫度37 ℃，轉(zhuǎn)速與DO偶聯(lián)將DO控制在40%。

24L發(fā)酵罐發(fā)酵培養(yǎng)：成熟種子液接種量10%(v/v)，裝液量18 L，培養(yǎng)溫度37 ℃，轉(zhuǎn)速與DO偶聯(lián)將DO控制在50%。

1.4 檢測方法

發(fā)酵液離心(10 000×g，4 ℃，10 min)，發(fā)酵液上清用于檢測殘總糖、殘還原糖、糖化酶活力與檸檬酸，菌絲球用去離子水清洗3遍，105 ℃烘至恒重，測定生物量。殘總糖與還原糖采用菲林法測定；糖化酶活力采用GB 8276—2006；檸檬酸含量采用HPLC測定(Shodex SUGAR SH1011柱子 (6 μm×300 mm×8 mm)，紫外檢測，210 nm，0.005 mol/L稀硫酸)，重復(fù)3次實驗。

2 結(jié)果與分析

2.1 超聲波預(yù)處理孢子對種子生長與檸檬酸產(chǎn)量的影響

表1可以看出，策略A溶解氧開始下降時間為9±0.3 h，急劇下降時間為12±0.6 h；策略B溶解氧開始下降時間為7.5±0.3 h，急劇下降時間為10.5±0.5 h。孢子經(jīng)超聲波處理后，DO開始下降與急劇下降時間分別縮短了16.7%，12.5%，縮短了種子前期較長的延滯期，從而縮短種子培養(yǎng)時間，同時提升了最大菌體量，這可能是由于孢子經(jīng)超聲波處理后，激活孢子受體，啟動孢子系列反應(yīng)[18,26]。為了評估超聲波預(yù)處理培養(yǎng)的種子對檸檬酸產(chǎn)量的影響，將培養(yǎng)的種子液以10%(v/v)接種量分別接種到24 L發(fā)酵罐進行發(fā)酵實驗，結(jié)果如表1所示。從表1可以看出，孢子經(jīng)預(yù)處理后，檸檬酸產(chǎn)量增加，殘總糖降低；發(fā)酵周期縮短4 h，檸檬酸產(chǎn)率分別提高了8.13%。同時，發(fā)酵總時間(包括種子培養(yǎng)時間與發(fā)酵時間)縮短了5.5 h，提高了檸檬酸發(fā)酵效率。表明孢子經(jīng)過超聲波預(yù)處理不僅縮短了種子培養(yǎng)時間，同時提高了發(fā)酵種子活力。

表1 黑曲霉孢子超聲波預(yù)處理對種子生長和檸檬酸發(fā)酵的影響

模式A：直接接種孢子為對照組；模式B：孢子超聲波預(yù)處理120 s為實驗組。

2.2 發(fā)酵罐培養(yǎng)的黑曲霉種子生理特性及生長動力學(xué)

黑曲霉孢子懸液以濃度4×105個/mL接種至24 L發(fā)酵罐，系統(tǒng)考察種子整個生命周期中生理參數(shù)變化規(guī)律，結(jié)果如圖1所示。圖1可以看出，0～8 h，總糖與還原糖含量基本不變，此階段孢子處于休眠調(diào)整期，逐漸吸水膨脹，為孢子萌發(fā)作充分準(zhǔn)備；8 h開始孢子逐漸萌發(fā)，此階段因自身未分泌糖化酶不能生成還原糖，還原糖含量開始明顯下降；12 h開始，孢子已完全萌發(fā)并逐漸生長形成菌絲，總糖含量開始急劇下降，伴隨自身分泌的糖化酶活力增加，還原糖含量開始上升。糖化酶活力呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢，在24 h時，糖化酶活力達到最高；還原糖含量也呈現(xiàn)類似的變化趨勢，24 h開始，還原糖生成速度遠(yuǎn)低于消耗速度，還原糖含量直線下降。從檸檬酸產(chǎn)物變化曲線可以看出，16 h開始，檸檬酸產(chǎn)量明顯增加，呈直線上升趨勢，28 h檸檬酸合成速率放緩；pH變化曲線看出，培養(yǎng)8 h開始，培養(yǎng)液pH急劇下降，16 h 開始，培養(yǎng)液pH下降變化平穩(wěn)。

TS-總糖；RS-還原糖；CA-檸檬酸；GM-糖化酶圖1 發(fā)酵罐培養(yǎng)的黑曲霉種子生理特性Fig.1 Physiological properties of the seed of Aspergillus niger cultured in the fermenter

檸檬酸發(fā)酵過程屬于淀粉質(zhì)原料粗料發(fā)酵，淀粉質(zhì)原料經(jīng)液化后利用黑曲霉自身分泌的糖化能力進行同步糖化發(fā)酵。基于同步糖化發(fā)酵的工藝特點，發(fā)酵過程中葡萄糖生成速度會顯著影響發(fā)酵效率的提升，黑曲霉糖化酶活力會直接影響葡萄糖供給速率[27-28]；因此，轉(zhuǎn)接發(fā)酵時，種子糖化酶活力會顯著影響發(fā)酵過程。種子糖化酶活力及生長動力學(xué)變化規(guī)律如圖2所示，總糖消耗速率與檸檬酸合成速率均呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢，糖化酶活力呈現(xiàn)類似的趨勢；糖化酶活力可以直觀反映種子活力，因此，可以選擇糖化酶活力作為移種的特征指標(biāo)。

圖2 發(fā)酵罐培養(yǎng)的黑曲霉種子生長動力學(xué)Fig.2 Growth kinetics of the seed of Aspergillus niger cultured in the fermenter

2.3 基于黑曲霉種子糖化酶活力移種的檸檬酸發(fā)酵

通過對發(fā)酵罐培養(yǎng)的黑曲霉種子生理特性與生長動力學(xué)參數(shù)考察，黑曲霉自身分泌的糖化酶活力能夠直觀反映種子活力，契合檸檬酸同步糖化發(fā)酵的特征，為考察以糖化酶活力為移種標(biāo)準(zhǔn)的發(fā)酵過程，將發(fā)酵培養(yǎng)過程中不同糖化酶活力的種子轉(zhuǎn)接搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)，發(fā)酵結(jié)果如圖3所示。隨著接入種子糖化酶活力的增加，檸檬酸產(chǎn)量明顯增加，發(fā)酵殘總糖明顯降低；在酶活力最高時轉(zhuǎn)接發(fā)酵(酶活力270 U/mL)，檸檬酸產(chǎn)量最高，發(fā)酵殘?zhí)亲畹汀Ｒ陨涎芯拷Y(jié)果表明，種子較高的糖化酶活力，能夠較好地協(xié)同檸檬酸同步糖化發(fā)酵過程，因而可以選擇糖化酶活力作為移種的特征指標(biāo)。

A-種齡20 h，酶活210 U/mL; B-種齡22 h，酶活240 U/mL; C-種齡24 h，酶活270 U/mL; D-種齡26 h，酶活229 U/mL; E-種齡28 h，酶活196 U/mL圖3 不同糖化酶活力移種的檸檬酸發(fā)酵Fig.3 Citric acid fermentation based on the glucoamylase activity of the seed of Aspergillus niger

2.4 基于孢子超聲波預(yù)處理與糖化酶活力移種的檸檬酸發(fā)酵

在微生物發(fā)酵過程中，發(fā)酵菌種質(zhì)量是決定發(fā)酵成敗的關(guān)鍵，選擇合適的移種時機有助于提高發(fā)酵效率。超聲波預(yù)處理孢子，可以激活了孢子受體，啟動孢子系列反應(yīng)，縮短孢子萌發(fā)時間，提高種子活力。黑曲霉種子生長過程中，自身能夠分泌糖化酶，選擇高活力的糖化酶種子轉(zhuǎn)接發(fā)酵，能夠協(xié)同檸檬酸同步糖化發(fā)酵，提高發(fā)酵效率。超聲波預(yù)處理孢子120 s培養(yǎng)種子，與糖化酶活力最高時移種方式為實驗組，以孢子直接接種培養(yǎng)種子，與傳統(tǒng)種齡移種方式為對照組，結(jié)果如圖4與表2所示。圖4可以看出，實驗組比對照組需要更短調(diào)整期，檸檬酸產(chǎn)量呈直線上升的趨勢(圖4-a)，實驗組的檸檬酸合成速率明顯高于對照組(圖4-d)；發(fā)酵殘總糖濃度直線下降的趨勢，實驗組消耗速率高于對照組(圖4-b)；發(fā)酵還原糖濃度呈現(xiàn)先增加后下降的趨勢，實驗組下降趨勢明顯快于對照組(圖4-c)。研究結(jié)果表明，孢子經(jīng)過超聲波預(yù)處理后，縮短種子培養(yǎng)周期，培養(yǎng)的種子活力更高；糖化酶活力最高時轉(zhuǎn)接發(fā)酵，縮短產(chǎn)酸調(diào)整期，保障葡萄糖供給速率，協(xié)同檸檬酸發(fā)酵過程，提高發(fā)酵效率。發(fā)酵過程參數(shù)如表2所示，發(fā)酵周期縮短6 h，檸檬酸體積產(chǎn)率由2.55±0.09 g/L提高到2.85±0.17 g/L，提高11.76%，總發(fā)酵周期(移種時機與發(fā)酵周期)縮短7.9 h。以上研究結(jié)果表明，組合孢子預(yù)處理培養(yǎng)種子與糖化酶活力表征的移種策略，能夠協(xié)同檸檬酸同步糖化發(fā)酵過程，顯著提高了發(fā)酵效率。

圖4 兩種模式下的檸檬酸發(fā)酵中檸檬酸產(chǎn)量(a)，殘總糖(b)，殘還原糖(c)與檸檬酸合成速率(d)Fig.4 Citric acid (a), residual total sugar (b), residual reducing sugar (c), and citric acid production (d) in the two fermentation modes

培養(yǎng)模式種子移種時機/h發(fā)酵周期/h檸檬酸產(chǎn)量/(g·L-1)殘總糖/(g·L-1)體積產(chǎn)率/[g·(L·h)-1]總發(fā)酵時間/h對照組254±0264±18163±1818±12255±009894±01實驗組235±0858±23165±3617±13285±017815±01

注：對照組為孢子直接接種培養(yǎng)與傳統(tǒng)種齡移種方式；實驗組為孢子超聲波預(yù)處理120 s培養(yǎng)與糖化酶活力移種方式。

3 結(jié)論

微生物發(fā)酵過程中，高質(zhì)量種子是決定發(fā)酵成敗的關(guān)鍵因素。基于黑曲霉孢子萌發(fā)的生理特性，提出超聲波預(yù)處理孢子120 s，誘導(dǎo)孢子快速萌發(fā)，縮短種子培養(yǎng)時間，提高種子活力，發(fā)酵產(chǎn)率提高8.13%。在發(fā)酵罐水平培養(yǎng)種子，系統(tǒng)研究其整個生命過程中生理學(xué)特性及生長動力學(xué)參數(shù)，發(fā)現(xiàn)自身分泌糖化酶并能直觀反映細(xì)胞活力，契合檸檬酸同步糖化發(fā)酵的特點，可以作為移種的特征指標(biāo)?；诔暡ㄕT導(dǎo)孢子萌發(fā)與糖化酶活力表征的移種策略，移種后的菌種活力顯著提升，產(chǎn)酸調(diào)整期縮短，發(fā)酵產(chǎn)率提升11.76%，總發(fā)酵時間縮短7.9 h，顯著提高了發(fā)酵效率。

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High efficient production of citric acid integrated strategies of the ultrasonic pretreated the spores and glucoamylase representing seed-transferring

WANG Bao-shi1, CHEN Jian1,2, SUN Fu-xin3, PANG Hai-qiang4, LI You-ran1,ZHANG Liang1, DING Zhong-yang1, GU Zheng-hua1, SHI Gui-yang1*

1 (National Engineering Laboratory for Cereal Fermentation Technology, Jiangnan University, Wuxi 214122, China) 2 (Key Laboratory of Industrial Biotechnology, Ministry of Education, Jiangnan University, Wuxi 214122, China) 3 (Jiangsu Guoxin Union Energy Co., Ltd., Yixing 214203, China) 4 (Shandong Feixian Inspection and Detection Center, Feixian 273400, China)

As the most mature platform-compound, the demand for citric acid is increasing due to the application in emerging industry and important practical significance of high-efficient production possess. Given the defects of long-term lag phase in the early stage of the seed culture and instable strain activity, the spores were treated with ultrasonic wave for 120 s to induce the cascade reaction and activate the spores, thus the seed culture time shortened by 1.5 h and the fermentation efficiency was improved by 8.13%. Based on the regular changes of the key parameters in the whole life cycle of theAspergillusnigercultured in the fermenter, their own glucoamylase could directly reflect the cell viability and be presented as the seed-transferring index for simultaneous saccharification and fermentation. Pretreatment of spores with ultrasonic was combined with seed-transferring based on glucoamylase activity to obtain high activity seed and high-efficient synthesis of citric acid, thus total fermentation time shortened by 7.9 h and fermentation efficiency was improved by 11.76%. These results were also meaningful for the fermentation processes with the filamentous fungi or similar microbiology as main fermentative strain.

ultrasonic induction;Aspergillusnigerspores; simultaneous saccharification and fermentation; citric acid; glucoamylase

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201612001

博士研究生(石貴陽教授為通訊作者，E-mail: gyshi@jiangnan.edu.cn)。

國家高技術(shù)研究發(fā)展計劃(863計劃，No: 2015AA020302)；江蘇省產(chǎn)學(xué)研前瞻性聯(lián)合研究項目 (No. BY2015019-13)

2016-04-13，改回日期：2016-05-06