植物乳桿菌在荸薺汁中的培養(yǎng)特性及其應(yīng)用研究

劉鵬揚(yáng)，劉軍義，羅佳

1(上海海洋大學(xué) 食品學(xué)院，上海，201306) 2(廣西出入境檢驗(yàn)檢疫局 檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心，廣西 南寧，530021)

植物乳桿菌在荸薺汁中的培養(yǎng)特性及其應(yīng)用研究

劉鵬揚(yáng)1，劉軍義2*，羅佳2

1(上海海洋大學(xué) 食品學(xué)院，上海，201306) 2(廣西出入境檢驗(yàn)檢疫局 檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心，廣西 南寧，530021)

研究植物乳桿菌在荸薺汁中的培養(yǎng)特性并尋找一種利用荸薺淀粉廢水生產(chǎn)乳酸菌劑的低碳環(huán)保工藝。將植物乳桿菌分別接種于可溶性固形物含量為0.5%、1.0%、2.0%、3.0%、5.0%的荸薺汁中進(jìn)行培養(yǎng)；接種到用NaOH溶液調(diào)pH至7.0，添加2.0%的葡萄糖的培養(yǎng)液中再培養(yǎng)；接種到121 ℃，15 min熱處理后的荸薺汁中進(jìn)行培養(yǎng)；接種荸薺汁分別置30、15、4 ℃下培養(yǎng)，觀察乳酸菌的培養(yǎng)特性；最后接種到荸薺淀粉廢水進(jìn)行培養(yǎng)。結(jié)果表明：植物乳桿菌密度在可溶性固形物含量為3.0%以下的荸薺汁中呈線性比例增加，用堿中和后可增加90%的菌密度，但加糖無效果；不經(jīng)熱處理的荸薺汁培養(yǎng)植物乳桿菌效果更好，植物乳桿菌在低溫下亦生長良好；荸薺淀粉廢水直接培養(yǎng)植物乳桿菌可得到菌含量為109CFU/mL的高濃度乳酸菌劑，荸薺淀粉廢水可直接被用于生產(chǎn)乳酸菌劑。

植物乳桿菌；荸薺汁；培養(yǎng)；荸薺淀粉廢水

乳酸菌是一種益生菌，通常是指發(fā)酵糖類主要產(chǎn)物為乳酸的一類無芽孢、革蘭氏染色陽性細(xì)菌的總稱。凡是能從葡萄糖或乳糖的發(fā)酵過程中產(chǎn)生乳酸菌的細(xì)菌統(tǒng)稱為乳酸菌，這是一群相當(dāng)龐雜的細(xì)菌，目前至少可分為23個屬，共有200多種。乳酸菌的應(yīng)用非常廣泛，除了用于食品發(fā)酵外，近年來還被廣為用作微生態(tài)制劑的主要菌種，用于制作飼料添加劑、水質(zhì)改良劑等乳酸菌劑，在健康養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)中發(fā)揮著越來越重要的作用[1]。

植物乳桿菌是乳酸菌的一種，最適生長溫度為30～35 ℃,厭氧或兼性厭氧,菌種為直或彎的桿狀，單個、有時成對或成鏈狀，最適pH 6. 5左右，屬于同型發(fā)酵乳酸菌[2]。植物乳桿菌與人類的生活關(guān)系密切，是一種常見于奶油、肉類及許多蔬菜發(fā)酵制品中的乳酸菌，能定植于腸道發(fā)揮有益作用。

植物乳桿菌劑的生產(chǎn)目前大多是以乳酸菌培養(yǎng)基或以此為基礎(chǔ)改良的合成培養(yǎng)基來生產(chǎn)[3-4]，原料及加工成本比較高，采用天然生物質(zhì)原料(特別是廢棄農(nóng)副產(chǎn)品)是一個非常有價值的途徑。中國是荸薺之鄉(xiāng)，荸薺深加工的一個重要途徑是生產(chǎn)荸薺淀粉，荸薺淀粉加工后排放的汁水量很大，如能加以利用，經(jīng)濟(jì)效益、社會效益都將十分巨大。本文以模擬加工條件下的荸薺汁為原料，研究了一種乳酸菌-植物乳桿菌在其中的培養(yǎng)特性，并研究了荸薺淀粉汁水的低碳利用工藝。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種

本試驗(yàn)采用2株不同來源的植物乳桿菌作為研究對象，1株為本實(shí)驗(yàn)室分離保存，標(biāo)記為L199，另1株購自美國杜邦公司，型號為Lactobacillusplantarum115，標(biāo)記為Lp115，其分離培養(yǎng)基采用MRS培養(yǎng)基[5]。將上述菌種活化，接種至MRS液體培養(yǎng)基， 36 ℃培養(yǎng)24 h，獲得菌種培養(yǎng)母液。將培養(yǎng)母液經(jīng)兩次擴(kuò)大培養(yǎng)后獲得生產(chǎn)用培養(yǎng)液備用。

1.1.2 荸薺汁

模擬荸薺淀粉加工過程，參照周愛梅等人的方法[5]，制備荸薺汁，方法如下：

荸薺→挑選→清洗→沸水燙漂3 min→按1∶1質(zhì)量比加dH2O均質(zhì)→紗濾→離心(3 000 g, 10 min)→取上清→測可溶性固形物。

可溶性固形物用手持式折光計直接讀數(shù)測定，上述方法制得的荸薺汁，其可溶性固形物為5.0%。再取一部分該荸薺汁，加入一定量的純凈水，分別制得可溶性固形物為0.5%、1.0%、2.0%、3.0%的荸薺汁。

1.1.3 現(xiàn)場加工荸薺汁

荸薺淀粉加工工藝如下：

荸薺→清洗→均質(zhì)→漿渣分離(2次)→流槽沉淀→得濕淀粉，上清排放。

排放的上清即為現(xiàn)場加工荸薺汁，根據(jù)原料來源不同和加工過程的控制不同，其可溶性固形物的范圍在1.0%～2.0%。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 植物乳桿菌在不同濃度荸薺汁中的培養(yǎng)試驗(yàn)

按10%的量，將上述2個菌種生產(chǎn)用培養(yǎng)液分別接種至可溶性固形物含量為0.5%、1.0%、2.0%、3.0%和5.0%的荸薺汁中，分別編號為L199-1#、-2#、-3#、-4#、-5#，Lp115-1’#、-2’#、-3’#、-4’#、-5’#，于36℃培養(yǎng)24 h，隨即進(jìn)行乳酸菌檢驗(yàn)，乳酸菌含量按GB 4789.35—2010[6]方法進(jìn)行計數(shù)及鑒定。

1.2.2 植物乳桿菌在加入堿溶液、加糖分處理的荸薺汁培養(yǎng)液中的再培養(yǎng)試驗(yàn)

將上述2個菌種生產(chǎn)用培養(yǎng)液接種于可溶性固形物含量為1.0%的荸薺汁(基于1.0%的荸薺汁已能較好的培養(yǎng)出較高活力乳酸菌，與使用2.0%、3.0%和5.0%的荸薺汁相比更低碳、環(huán)保)，于36 ℃培養(yǎng)24 h后，分別加入堿溶液、加糖分作為不同處理組。加堿溶液處理的方法為：用1 mol/L NaOH調(diào)pH至7.0，置36 ℃再培養(yǎng)24 h；加糖分處理方法：直接添加2.0%的葡萄糖(無需調(diào)節(jié)pH值)，置36 ℃再培養(yǎng)24 h。同時設(shè)置無任何處理的對照組，分別編號為L199-6#、-7#、-8#和Lp115-6’#、-7’#、-8’#。以上樣品試驗(yàn)前后均按GB/T 5009.8—2008方法[7]進(jìn)行總糖含量測定。

1.2.3 植物乳桿菌在熱處理的荸薺汁中的培養(yǎng)試驗(yàn)

可溶性固形物含量為1.0%的荸薺汁，121 ℃，15 min處理，然后接種上述2個菌種生產(chǎn)用培養(yǎng)液，于36 ℃培養(yǎng)24 h，同時分別設(shè)置不處理組作為對照(L199-9#和Lp115-9’#)。培養(yǎng)后，按照GB 4789.35—2010[6]方法進(jìn)行乳酸菌計數(shù)及鑒定。

1.2.4 植物乳桿菌在不同溫度下的培養(yǎng)試驗(yàn)

接L199菌種培養(yǎng)液按10%的量接種于可溶性固形物含量為2.0%的荸薺汁中，分別置30、15、4 ℃下進(jìn)行培養(yǎng)，分別編號為L199-9#、-10#、-11#和Lp115-9’#、-10’#、-11’#，分別測定各組pH值，待pH值降至4.0以下時，測定各組乳酸菌含量。

1.2.5 現(xiàn)場加工荸薺汁培養(yǎng)植物乳桿菌的應(yīng)用試驗(yàn)

本文中所述現(xiàn)場加工荸薺汁目前被當(dāng)作加工廢水排放，將該荸薺汁應(yīng)用于植物乳桿菌高效培養(yǎng)，設(shè)計低碳工藝流程如下：選取植物乳桿菌L199為例，取培養(yǎng)液1 000 mL→接種到9 000 mL廢水→自然環(huán)境條件下密封培養(yǎng)24 h→接種到90 L廢水→自然環(huán)境條件下密封培養(yǎng)24 h→對乳酸菌進(jìn)行檢驗(yàn)及鑒定。

2 結(jié)果與分析

2.1 植物乳桿菌在不同濃度荸薺汁中的培養(yǎng)結(jié)果

將2種不同來源的植物乳桿菌L199和Lp115接種于不同可溶性固形物含量的荸薺汁中，36 ℃培養(yǎng)24 h后，按照GB 4789.35—2010中乳酸菌的檢驗(yàn)及鑒定方法對荸薺汁中的乳酸菌進(jìn)行了計數(shù)和鏡檢鑒定，各組在選擇性MRS培養(yǎng)基上的計數(shù)結(jié)果如表1所示，經(jīng)鏡檢觀察，各組均只觀察到短桿狀、無芽胞、革蘭氏陽性菌，未見其他形態(tài)乳酸菌，根據(jù)GB 4789.35—2010的判定依據(jù)鑒定為植物乳桿菌。

表1 植物乳桿菌L199和Lp115在不同濃度荸薺汁中的培養(yǎng)結(jié)果

從表1中可以看出，當(dāng)可溶性固形物濃度在3.0%以下時，隨著荸薺汁可溶性固形物濃度的增加，接種L199和Lp115培養(yǎng)液培養(yǎng)后的乳酸菌含量也呈一定比例增加，其中，接種L199培養(yǎng)液的試驗(yàn)組表現(xiàn)出良好的線性關(guān)系，經(jīng)計算得出其相關(guān)系數(shù)R2=0.996。但當(dāng)可溶性固形物濃度超過3.0%時，2種乳酸菌含量均趨于穩(wěn)定，乳酸菌計數(shù)量分別為3.0×109CFU/mL和2.0×109CFU/mL。

2.2 植物乳桿菌在加堿溶液、加糖分處理后的荸薺汁培養(yǎng)液中的再培養(yǎng)結(jié)果

試驗(yàn)原始樣品為可溶性固形物為1.0%的荸薺汁接種L199和Lp115培養(yǎng)24 h后的培養(yǎng)物，經(jīng)加堿溶液調(diào)pH至中性和加糖分后，再培養(yǎng)24 h，其結(jié)果如表2所示。

表2 L199在加堿、加糖處理后荸薺汁培養(yǎng)液中的再培養(yǎng)結(jié)果

從表中可以看出，當(dāng)未接種植物乳桿菌時，可溶性固形物為1.0%的荸薺汁中的總糖為0.79 g/100 g，經(jīng)24 h培養(yǎng)后，分別迅速降為0.08 g/100 g和0.12 g/100 g，培養(yǎng)48 h后，總糖含量分別為0.05 g/100 g和0.07 g/100 g，乳酸菌計數(shù)分別為4.9×108CFU/mL和4.4×108CFU/mL；在作不同處理前，24 h培養(yǎng)液的總糖含量分別為0.08 g/100 g和0.12 g/100 g，而當(dāng)用NaOH將24 h培養(yǎng)液pH值調(diào)整至7.0后再培養(yǎng)時，乳酸菌的計數(shù)達(dá)到了9.3×108CFU/mL和8.7×108CFU/mL，同比分別增加了90%和100%。而添加葡萄糖處理后，雖然其總糖含量分別增加到2.10 g/100 g和2.47 g/100 g，培養(yǎng)液中的乳酸菌計數(shù)分別為5.0×108CUF/mL和4.7×108CFU/mL，與處理前含量相比，增長量并不大，處理效果與加堿溶液處理組相比差很多，因此，通過加堿溶液調(diào)節(jié)pH值的方法可大幅增加培養(yǎng)液中的乳酸菌含量。

2.3 植物乳桿菌在熱處理后荸薺汁中的培養(yǎng)結(jié)果

選取可溶性固形物含量為1.0%的荸薺汁，經(jīng)121 ℃，15 min處理后，接種L199和Lp115植物乳桿菌，24 h培養(yǎng)后分別進(jìn)行鏡檢，鏡檢結(jié)果為僅觀察到短桿狀的乳酸菌，即植物乳桿菌，乳酸菌計數(shù)結(jié)果為2.5×108CFU/mL和2.0×108CFU/mL，與未經(jīng)熱處理的荸薺汁培養(yǎng)液相比(L199-9#和Lp115-9’#)，含量只有未經(jīng)熱處理組的50%和48%?？梢?，荸薺汁不經(jīng)熱處理，直接接種植物乳桿菌L199更為經(jīng)濟(jì)、有效，這對實(shí)施低碳工藝非常有利。

2.4 植物乳桿菌在不同溫度下的培養(yǎng)結(jié)果

2種植物乳桿菌接種于可溶性固形物含量為1.0%的荸薺汁中，于30、15、4 ℃下培養(yǎng)后，結(jié)果如表3所示。表中乳酸菌的計數(shù)是在培養(yǎng)液pH值低于4.0時的當(dāng)天測得。

表3 L199在不同溫度下的培養(yǎng)結(jié)果

從表3中可以看出，在30 ℃培養(yǎng)條件下，24 h內(nèi)，兩植物乳桿菌荸薺汁培養(yǎng)液pH值就分別降到了4.0和4.4，乳酸菌計數(shù)達(dá)到4.7×108CFU/mL和4.3×108CFU/mL，當(dāng)在15 ℃時，乳酸菌生長速度也比較快，48 h內(nèi)pH值也分別降到了4.0和4.5，乳酸菌計數(shù)達(dá)到4.5×108CFU/mL和3.8×108CFU/mL。在4 ℃條件下，則6 d后培養(yǎng)成熟，乳酸菌計數(shù)可分別達(dá)3.4×108CFU/mL和3.1×108CFU/mL。荸薺收獲的季節(jié)在冬天，自然環(huán)境氣溫比較低，所以設(shè)計本試驗(yàn)的目的在于考證所使用的菌種是否可以在低溫下生長，從而避免通常發(fā)酵培養(yǎng)所需要的保溫措施，同時減少發(fā)酵容器的周轉(zhuǎn)，達(dá)到節(jié)省能源和資源的雙重目的。結(jié)果表明，本菌可以在15 ℃下快速生長，在4 ℃低溫下也可持續(xù)生長，具有較好的實(shí)際應(yīng)用價值。

2.5 L199在現(xiàn)場加工荸薺汁中的應(yīng)用結(jié)果

2013年1月19日和2013年2月1日先后到廣西平樂某公司進(jìn)行現(xiàn)場試驗(yàn)，當(dāng)時氣溫分別為19 ℃和17 ℃，現(xiàn)場加工荸薺汁(荸薺廢水)的可溶性固形物分別為1%和2%，經(jīng)試驗(yàn)培養(yǎng)后，獲得兩批乳酸菌劑，乳酸菌的檢測結(jié)果分別為4.3×108CFU/mL和1.0×109CFU/mL?？梢娫囼?yàn)設(shè)計的低碳工藝比較成功。

3 討論

本文研究了植物乳桿菌L199在荸薺汁中的培養(yǎng)特性，發(fā)現(xiàn)當(dāng)荸薺汁的可溶性固形物濃度在3%以下時，L199的培養(yǎng)濃度與可溶性固形物濃度呈直線正比例關(guān)系；L199在較低溫度如15 ℃下也可快速繁殖，用未經(jīng)熱處理的荸薺汁作為培養(yǎng)液更有利于植物乳桿菌的增殖，這可能與熱處理后某些活性物質(zhì)與促生長因子的被破壞有關(guān)。然而，在實(shí)際應(yīng)用中，用未經(jīng)熱處理荸薺汁作為乳酸菌培養(yǎng)液較適用于飼料生產(chǎn)(無需滅菌)，而在食品領(lǐng)域則不宜采用，因此本文未進(jìn)一步探討。利用這些特性設(shè)計了L199利用現(xiàn)場荸薺加工汁即荸薺淀粉廢水的低碳工藝，結(jié)果獲得了乳酸菌數(shù)分別為4.3×108CFU/mL和1.0×109CFU/mL的兩批乳酸菌劑。實(shí)踐證明，該工藝簡單實(shí)用，低碳環(huán)保，且所用原料低廉易得，應(yīng)用前景廣闊。

乳酸菌的生長需要復(fù)雜的營養(yǎng)條件，荸薺汁在不需要添加任何外源因子的條件下就可培養(yǎng)出高活力的乳酸菌，說明荸薺汁的營養(yǎng)豐富又全面。但試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)當(dāng)荸薺汁的可溶性固形物濃度超過3%時，菌的密度并不增加，這應(yīng)當(dāng)是由于酸抑制的結(jié)果，所以當(dāng)培養(yǎng)24 h后，即使再添加2%的葡萄糖也沒有增加乳酸菌的密度。堿中和可以增加90%的菌量，但這不能理解為僅僅是解除了酸的限制作用，因?yàn)楸驹囼?yàn)中，堿中和時，殘?zhí)橇糠浅５?，只?.08 g/100 g，所以堿的作用除了中和乳酸，解除生長抑制外，可能還有堿水解淀粉后釋放出纖維素、果膠等營養(yǎng)物質(zhì)中釋放出的碳源、氮源的作用，該論點(diǎn)仍需要進(jìn)一步試驗(yàn)加以確證。

[1] CATALOLUK O, GOGEBAKAN B. Presence of drug resistance in intestinal lactobacilli of dairy and human origin in Turkey[J]. FEMS Microbio Lett,2004,236(1):7-12.

[2] 王水泉, 包艷, 董喜梅,等.植物乳桿菌的生理功能及應(yīng)用[J]. 中國農(nóng)業(yè)科技導(dǎo)報, 2010,12(4):49-55.

[3] 方義川, 楊虹坤, 何謙,等. 直投式乳酸菌發(fā)酵劑的研制[J]. 現(xiàn)代食品科技, 2012,28(8):990-994.

[4] 譚歡. 高效乳酸菌直投式發(fā)酵劑的研制[J]. 湖南農(nóng)業(yè)科學(xué), 2012(9):102-104,107.

[5] 周愛梅, 劉欣, 潘可,等. 荸薺粉廠廢水有效利用研究[J]. 食品工業(yè)科技, 2004, 25(6): 74-76.

[6] 中華人民共和國衛(wèi)生部. GB 4789.35—2010食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)乳酸菌檢驗(yàn)[S].北京:中國標(biāo)準(zhǔn)出版社, 2010.

[7] 中華人民共和國衛(wèi)生部、中國國家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會.GB/T 5009.8—2008 食品中蔗糖的測定[S].北京:中國標(biāo)準(zhǔn)出版社, 2008.

Study on the cultivation of lactobacillus in water chestnut juice and its application

LIU Peng-yang1, LIU Jun-yi2*, LUO Jia2

1(College of Food Science & Technology, Shanghai Ocean University, Shanghai 201306, China) 2(Technology Center of Guangxi Entry-Exit Inspection & Quarantine Bureaue, Nanning 530021, China)

The cultivation of lactobacillus in water chestnut juice was studied and a low-carbon green process utilizing starch waste water of water chestnut was developed. Lactobacillus was inoculated in water chestnut juice with different solvable solid density of 0.5%, 1.0%, 2.0%, 3.0%, 5.0% separately to culture. Lactobacillus was then inoculated in the fermented juice adjusted to pH 7.0 with NaOH and added with 2.0% glucose to reculture. Then lactobacillus was inoculated in the hot-treated water chestnut juice pretreated at 121 ℃ for 15 min, then to check the cultivation character of lactobacillus was checked during culturing at 30,15,4 ℃separately. Finally, the starch waste water of water chestnut was used to culture lactobacillus. Results showed that the density of lactobacillus had a linear increase with the increased density of solvable solid of water chestnut. Alkali neutralization could lead to a 90% increase of the bacteria density, but no effect was observed with the addition of glucose. It is better to using non-hot treatment juice. The lactobacillus was able to grow well even at low temperature. A high density of lactobacillus with 109CFU/mL was yielded by utilizing starch waste water of water chestnut to culture directly. The starch waste water of water chestnut can be used to produce lactobacillus preparation directly.

Lactobacillusplantarum; water chestnut juice; culture; waste water

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201612017

大學(xué)本科(劉軍義研究員為通訊作者，E-mail：ljy8463@163.com)。

廣西科技攻關(guān)計劃(桂科攻1598015-10)

2016-03-21，改回日期：2016-08-29