角蛋白酶酶活測(cè)定條件的研究

■冀勇良 劉麗英 朱傳合

（1.山東農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東泰安271018；2.山東農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山東泰安271018)

角蛋白酶是一種具有將羽毛等角蛋白物質(zhì)酶解為短肽和氨基酸的特殊蛋白酶，在飼料[1]、醫(yī)藥[2]、制革[3]、肥料、環(huán)保、食品以及洗滌劑等行業(yè)具有十分重要的應(yīng)用[4]，近年成為研究的熱點(diǎn)。然而目前，國(guó)內(nèi)外尚沒有統(tǒng)一的角蛋白酶活測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)，很多研究者采用不同的測(cè)定方法、條件和酶活單位，造成不同研究結(jié)果之間很難進(jìn)行比較和交流。雖然有相當(dāng)一部分研究者喜歡采用以Gradisar[5]為代表的測(cè)定方法。但該方法在測(cè)定條件的適用范圍、表述的詳實(shí)上也存在一定的不完善甚至錯(cuò)誤。例如對(duì)體系振蕩頻率只是含糊的表述為“定時(shí)取出用力振蕩”，對(duì)選用羽毛粉粒度的大小、底物濃度是否飽和以及酶活測(cè)定時(shí)不同試劑的添加順序也沒作具體說明，經(jīng)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)這些因素對(duì)酶活測(cè)定的結(jié)果都有著很大的影響，這樣會(huì)使同一酶樣的測(cè)定結(jié)果相差過大而難以比較。鑒于上述出現(xiàn)的實(shí)際問題，本研究以Gradisar等[5]的方法為基礎(chǔ)，系統(tǒng)地研究了多種因素對(duì)一株短小芽孢桿菌所產(chǎn)角蛋白酶酶活測(cè)定的影響，以期建立一種準(zhǔn)確、簡(jiǎn)便、快速的角蛋白酶酶活測(cè)定方法，為從事該領(lǐng)域研究的人員提供一定的參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 羽毛及羽毛粉

菜市場(chǎng)家禽屠宰點(diǎn)收集生雞毛，用自來水洗凈后80℃烘干，用于發(fā)酵產(chǎn)酶。烘干后的生雞毛再用粉碎機(jī)粉碎后過篩即制成羽毛粉，用于測(cè)定酶活。

1.1.2 菌種

短小芽孢桿菌（Bacillus pumilus，JYL），從堆積腐爛羽毛的土壤中分離篩選。

1.1.3 培養(yǎng)基

種子培養(yǎng)基：氯化鈉5 g、蛋白胨10 g、牛肉膏3 g、水1 000 ml，pH值7.0。

初始發(fā)酵培養(yǎng)基：NaCl 0.5 g、KH2PO40.35 g、K2HPO40.7 g、MgSO40.2 g、CaCl20.02 g、羽毛5 g、水1 000 ml，121℃高壓滅菌20 min，pH值自然。

1.2 方法

1.2.1 種子液制備

取一環(huán)斜面活化的菌種，接入到含50 ml種子培養(yǎng)基的250 ml三角瓶中，37℃、160 r/min培養(yǎng)24 h即為種子液。

1.2.2 液體發(fā)酵及粗酶液制備

取2 ml上述種子液接于含100 ml初始發(fā)酵培養(yǎng)基的250 ml三角瓶中，37℃，160 r/min培養(yǎng)36 h。發(fā)酵液4℃、10 000 r/min離心15 min,上清液即為粗酶液。

1.2.3 角蛋白酶酶活測(cè)定的基本方法

以Gradisar等（2000）[5]的方法為基礎(chǔ)。取1 ml粗酶液，加入2.0 ml 0.05 mol/l Tris-HCl緩沖液(pH值7.5)，然后加入10 mg羽毛粉，在40℃恒溫水浴鍋中反應(yīng)1 h（定時(shí)取出用力振蕩），加入2.0 ml 10%的三氯乙酸（TCA）終止反應(yīng)。6 000 r/min離心20 min，取上清液于OD280nm下測(cè)定吸光值。采用保溫前添加TCA的反應(yīng)管作為對(duì)照。一個(gè)酶活單位U定義為在特定反應(yīng)條件下OD280nm吸光值升高0.01為1unit(U)。

1.2.4 角蛋白酶酶活測(cè)定條件的研究

以測(cè)定波長(zhǎng)（取260～300 nm的范圍，每隔2 nm作為一個(gè)水平）、物質(zhì)添加順序(以底物S、酶E、三氯乙酸TCA、Tris-HCl緩沖液的不同排列設(shè)置6個(gè)不同處理)、底物粒度（0、20、40、60、80目）、底物添加量（5、10、15、20、25、30、35、40、45、50 mg）、振蕩頻率（30、20、15、10、5 min）、緩沖液pH值（在6～10的pH值范圍取不同值）、酶促反應(yīng)溫度（35、40、45、50、55、60 ℃）、酶促反應(yīng)時(shí)間（15、30、45、60、75、90、105、120 min）、酶液的制備方式（濾紙過濾后離心、直接離心、超聲破碎處理）等9個(gè)因素作為研究對(duì)象，分別進(jìn)行試驗(yàn)，測(cè)定各因素條件下的角蛋白酶酶活。

1.3 原始方法測(cè)定蛋白酶酶活值

試驗(yàn)前期以Gradisar等[5]的方法為原始方法，測(cè)得蛋白酶酶活值為16.5 U，與本研究結(jié)論做比照。

2 結(jié)果與分析

2.1 測(cè)定波長(zhǎng)的選擇

目前角蛋白酶酶活測(cè)定中，出現(xiàn)許多同波長(zhǎng)不同底物，同底物不同波長(zhǎng)等混亂現(xiàn)象[6-9]。這是造成不同結(jié)果之間難以進(jìn)行比較的原因之一。本試驗(yàn)以10 mg 20目的羽毛粉為底物，在260～300 nm的波長(zhǎng)范圍內(nèi)，按1.2.3中的方法測(cè)定同一酶液酶活，繪制波長(zhǎng)對(duì)吸光度的曲線，結(jié)果如圖1。由圖1可知，酶活測(cè)定的吸光值隨著測(cè)定波長(zhǎng)的增加先增加后逐漸變小，在280 nm時(shí)有最大吸收，因此選定280 nm作為角蛋白酶酶活測(cè)定的波長(zhǎng)。

圖1 波長(zhǎng)對(duì)酶活測(cè)定的影響

2.2 試劑添加順序?qū)γ富顪y(cè)定的影響

將底物（S）、酶（E）、Tris-HCl緩沖液（T）按不同的排列順序（ETS代表先添加酶，再向酶液中加Tris-HCl緩沖液，最后向反應(yīng)體系中加入底物，其他依次類推）組成酶活測(cè)定體系，按1.2.3中的方法測(cè)定酶活，結(jié)果見圖2。

由圖2可知，不同的試劑添加順序?qū)γ富顪y(cè)定結(jié)果有較明顯影響，按TSE的順序，即先向反應(yīng)體系中加入Tris-HCl緩沖液，再將底物加入到緩沖液中，最后加入酶的順序測(cè)得酶活最高。這可能是受酶和底物空間臨近效應(yīng)的影響，緩沖液可以有效的保持酶空間結(jié)構(gòu)不被破壞，從而保持酶的催化活性[10]。羽毛粉底物或反應(yīng)容器直接與酶接觸都會(huì)在一定程度上影響和破壞酶分子的空間結(jié)構(gòu)，從而使酶的活性下降。ETS酶活很低可能由于在緩沖液加入前，容器壁與酶長(zhǎng)時(shí)間接觸影響了酶的活性，EST和SET則可能是表面粗糙的羽毛粉底物與酶直接作用，影響或破壞了酶的空間結(jié)構(gòu)。只有先讓緩沖液將底物以及反應(yīng)容器接觸面充分浸潤(rùn)后再加入酶，酶才能保持和發(fā)揮最大的催化活性。

圖2 試劑添加順序?qū)γ富畹挠绊?/p>

2.3 底物粒度對(duì)酶活測(cè)定的影響

以未經(jīng)粉碎處理的羽毛做對(duì)照，用20、40、60、80目的羽毛粉做底物，試劑添加順序?yàn)門SE，按1.2.3中的方法測(cè)定不同粒度下角蛋白酶酶活，結(jié)果如圖3所示。

圖3 羽毛粉粒度對(duì)酶活的影響

粒度不同的物質(zhì)其表面積大小也不同，粒度通過影響底物與酶分子作用的表面積，從而影響酶的催化效率。由圖3可以看出，未經(jīng)處理的羽毛由于粒度較大，酶作用的有效表面積較小，加之羽毛的空間結(jié)構(gòu)未被破壞所以酶很難發(fā)揮作用。相比之下羽毛粉的粒度小，相對(duì)表面積大，可以有效地被酶降解，但粒度過?。ǔ^40目），雖然表面積增大，但由于羽毛粉的沉積與漂浮作用加強(qiáng)，反而使有效作用的底物離子數(shù)目減少。

2.4 底物添加量對(duì)酶活測(cè)定的影響

米氏方程表達(dá)了酶反應(yīng)速度與底物濃度之間的定量關(guān)系。在測(cè)定酶活時(shí)，一般選擇底物飽和以滿足酶活測(cè)定的零級(jí)動(dòng)力學(xué)條件[11]。在底物飽和的條件下，酶活才正比于酶的濃度，而與底物濃度無關(guān)，此時(shí)酶促反應(yīng)的速度達(dá)到最大，為零級(jí)反應(yīng)。用同一酶液，按TSE的試劑添加順序，分別向反應(yīng)體系中加入不同重量粒度為40目的羽毛粉進(jìn)行反應(yīng)，研究底物添加量對(duì)酶活測(cè)定的影響，結(jié)果如圖4所示。

圖4 底物添加量對(duì)酶活的影響

由圖4可知，在底物量低于45 mg時(shí)，測(cè)得的酶活值隨底物添加量的增加而增大，此時(shí)酶沒有被底物所飽和，反應(yīng)速度與底物濃度成正比，表現(xiàn)為一級(jí)反應(yīng)；當(dāng)?shù)孜锾砑恿窟_(dá)到45 mg時(shí)，酶活不再增加，表明酶已被底物飽和，反應(yīng)速度達(dá)到最大，表現(xiàn)為零級(jí)反應(yīng)，酶活趨于極限值。所以45 mg羽毛粉是準(zhǔn)確測(cè)定角蛋白酶酶活的適宜底物濃度。

2.5 振蕩對(duì)酶活測(cè)定的影響

在測(cè)定角蛋白酶酶活時(shí)，究竟以間隔多長(zhǎng)時(shí)間進(jìn)行振蕩最適合酶活測(cè)定未見報(bào)道。為此，本試驗(yàn)設(shè)置了不同的振蕩間隔時(shí)間以代表不同的振蕩反應(yīng)體系，并以不振蕩的處理做對(duì)照，代表靜止反應(yīng)體系來研究振蕩對(duì)酶活測(cè)定的影響，結(jié)果見圖5。

振蕩可以使羽毛粉底物均勻地分散在反應(yīng)體系中，便于酶分子與底物的充分結(jié)合，從而在一定程度上利于酶促反應(yīng)的進(jìn)行。由圖5可知，與靜止體系相比，振蕩反應(yīng)體系確實(shí)有利于酶促反應(yīng)的進(jìn)行，但不同振蕩頻率之間所測(cè)酶活大小并無太顯著的差別，說明振蕩頻率不是影響角蛋白酶酶活測(cè)定的顯著因素，在沒有振蕩設(shè)備提供下，可以將反應(yīng)容器定時(shí)取出，人工振蕩即可滿足酶活測(cè)定的要求。本試驗(yàn)中每隔15 min進(jìn)行振蕩酶活最高，故選擇間隔15 min作為最適振蕩頻率。

圖5 振蕩次數(shù)對(duì)酶活的影響

2.6 緩沖液pH值對(duì)酶活測(cè)定的影響

角蛋白酶的最適反應(yīng)pH值以中性到堿性居多，一般為7～10之間，酸性角蛋白酶比較少。本試驗(yàn)在6～10的pH值范圍取不同值，以45 mg過40目篩的羽毛粉做底物，按TSE的順序添加試劑，每隔15 min進(jìn)行振蕩，在40℃下分別測(cè)定不同pH值下的角蛋白酶酶活，結(jié)果見圖6。

反應(yīng)體系的pH值可以影響底物、酶分子的活性部位以及中間絡(luò)合物（ES）等相關(guān)集團(tuán)的解離狀態(tài)，進(jìn)而對(duì)酶的催化反應(yīng)產(chǎn)生影響，反應(yīng)體系過酸或過堿可以使酶的空間結(jié)構(gòu)破壞，引起酶構(gòu)象的改變和酶活性的喪失。由圖6可知，pH值在8.5～9.1間酶活較高，而在酸性范圍內(nèi)酶活較低。緩沖液的最適pH值為8.8。

圖6 緩沖液pH值對(duì)酶活的影響

2.7 反應(yīng)溫度對(duì)酶活的影響

不同來源的角蛋白酶其作用的最適溫度存在較大的差異，一般都在40～60℃間，目前測(cè)定時(shí)采用的溫度有37、40、50、55 ℃等。本試驗(yàn)以45 mg過40目篩的羽毛粉做底物，緩沖液pH值為8.8，按TSE的順序添加試劑，每隔15 min進(jìn)行振蕩，分別在不同溫度條件下反應(yīng)1 h，測(cè)其酶活結(jié)果如圖7。

由圖7可知，開始時(shí)隨著反應(yīng)溫度的上升酶活性值也在不斷增大，45℃時(shí)酶活達(dá)到最大值，之后，隨著溫度上升酶活迅速下降，因此酶的最適溫度為45℃。

圖7 溫度對(duì)酶活的影響

2.8 反應(yīng)時(shí)間對(duì)酶活的影響

本試驗(yàn)測(cè)定了不同反應(yīng)時(shí)間下的酶活值，繪成曲線，結(jié)果如圖8所示。

圖8 反應(yīng)時(shí)間對(duì)酶活的影響

由圖8可以看出，在15～60 min內(nèi)曲線基本為一條直線，其斜率代表初速度，按理論可以取15～60 min之內(nèi)的任何時(shí)間[12]，但如果時(shí)間過短，則誤差比較大，且根據(jù)酶活測(cè)定的一般原則，測(cè)酶活時(shí)除了選擇底物飽和以消除底物濃度對(duì)分析結(jié)果的影響外，還應(yīng)盡可能地延長(zhǎng)線性反應(yīng)的時(shí)間[11]，但反應(yīng)時(shí)間過長(zhǎng)，經(jīng)濟(jì)性較差。因此綜合考慮選擇60 min作為酶活測(cè)定的最適反應(yīng)時(shí)間。

2.9 酶液的制備方式對(duì)酶活測(cè)定的影響

2.9.1 過濾與離心對(duì)酶活測(cè)定的影響

用直接離心、直接濾紙過濾、過濾后再離心三種方法制備粗酶液，并分別測(cè)其酶活，每個(gè)處理3個(gè)平行，研究不同酶液制備方法對(duì)酶活的影響，結(jié)果如圖9所示。

圖9 酶制備方式對(duì)酶活的影響

由圖9可知，直接離心制備的酶液活性相對(duì)較高，這是因?yàn)楦咚匐x心不但可以將酶從含羽毛殘?jiān)图?xì)菌菌體的發(fā)酵液中有效分離出來，而且離心是在4℃相對(duì)較低的溫度下快速進(jìn)行，使酶的活性得以很好保持；濾紙過濾或過濾后再離心制得的酶活性要低于直接離心制備的酶，原因可能是，一方面濾紙過濾是在室溫下進(jìn)行，且由于發(fā)酵液中殘?jiān)锏淖璧K，過濾需要相對(duì)較長(zhǎng)的時(shí)間才能完成，使酶長(zhǎng)時(shí)間暴露在不適的溫度下對(duì)酶活造成影響；另一方面，濾紙過濾效果不佳，制得的酶液中可能含有相對(duì)較多的菌體細(xì)胞及其它雜質(zhì)，影響酶的純度。所以就方便性和效果而言，采用直接高速離心制備酶液的方法最好。

2.9.2 超聲處理對(duì)酶活的影響

本試驗(yàn)設(shè)置不同的超聲功率，分別處理30 s,以無超聲處理的做對(duì)照，測(cè)定直接離心制備的粗酶液酶活，結(jié)果如圖10所示。

圖10 超聲功率對(duì)酶活的影響

由圖10可知，用40、80、120 W的超聲波處理發(fā)酵液制得酶液的酶活均比未經(jīng)過超聲處理的對(duì)照組高，這說明該菌株所產(chǎn)的酶屬于胞內(nèi)胞外混合型酶，40 W時(shí)酶活最高，之后隨著超聲功率的增大酶活性反而降低，超過160 W時(shí)酶活已低于對(duì)照，這主要因?yàn)殡S著超聲功率的增大，超聲對(duì)酶分子的破壞力也在增大。

3 結(jié)論

①試劑添加順序、底物粒度大小、底物添加量、反應(yīng)溫度、pH值以及超聲處理等因素對(duì)酶活測(cè)定結(jié)果具有較大影響，振蕩頻率和粗酶液制備方式對(duì)測(cè)定結(jié)果影響不大。

②以羽毛粉為底物，測(cè)定角蛋白酶酶活的最佳測(cè)定條件和步驟為：發(fā)酵液用40 W的超聲波處理30 s后直接在4℃下，10 000 r/min離心15 min，上清液即為粗酶液；按順序依次向反應(yīng)容器內(nèi)加入2 ml pH值8.8的Tris-HCl緩沖液、45 mg粒度為40目的羽毛粉底物和1 ml酶液，混合均勻后在45℃恒溫水浴鍋中反應(yīng)1 h（每隔15 min取出用力振蕩），加入2.0 ml 10%的三氯乙酸（TCA）終止反應(yīng)。6 000 r/min離心20 min，取上清液于OD280nm下測(cè)定吸光值。采用保溫前添加TCA的反應(yīng)管作為對(duì)照。經(jīng)驗(yàn)證此方法測(cè)得的酶活值為34.8 U，而原始方法測(cè)得的酶活值為16.5 U，約是原始方法測(cè)定值的2.1倍。