新疆地方綿羊Cytb基因遺傳多樣性與起源研究

寧禮群，古麗娜·艾山，馬合木提·哈力克

(新疆大學生命科學與技術學院，新疆 烏魯木齊 830046)

新疆地方綿羊Cytb基因遺傳多樣性與起源研究

寧禮群，古麗娜·艾山，馬合木提·哈力克*

(新疆大學生命科學與技術學院，新疆 烏魯木齊 830046)

為探討新疆綿羊系統(tǒng)進化與起源，本文測定了新疆10個羊品種的Cytb序列，并進行了系統(tǒng)發(fā)育學分析。結果表明，這10個地方綿羊共有 37種單倍型，60個多態(tài)位點；單倍型多樣度為0.785±0.00193，核苷酸多樣度為0.00368±0.01185，表明新疆地方綿羊品種的遺傳多樣性豐富；不論是鄰接法(Neighbor Joining)還是最大似然法(Maximum Likelihood)系統(tǒng)進化樹都表明新疆地方綿羊共分為3支，說明新疆地方綿羊至少有3個獨立的母系起源。本研究為確立新疆地方綿羊種群關系和保護物種資源提供理論依據。

細胞色素b；地方綿羊；遺傳多樣性；起源

新疆最有特色的基礎和傳統(tǒng)產業(yè)是畜牧業(yè)，新疆的畜牧業(yè)發(fā)展?jié)摿薮?。新疆主要畜種一直是綿羊，改革開放以來，的效益得到顯著提高，規(guī)模也不斷擴大，目前養(yǎng)羊產業(yè)已成為新疆畜牧業(yè)的主導產業(yè)[1-2]。目前，新疆主要畜禽品種共有59種，其中綿、山羊23種，牛7種，馬、驢羊產業(yè)、駝7種，豬9個，家禽7種，特種經濟動物2種[3]。新疆地方綿羊品種共有9種、育成品種4種、引進品種4種[4]。

畜禽遺傳資源，與人類關系最密切、最直接，畜禽遺傳資源也受人類影響最大的一部分。它是人類生活重要的生產資料，與人類社會生活有著非常密切的關系，如果要和野生物種多樣性丟失相比，它的丟失對人類利益的損害更大。研究動物的mtDNA，可以更深入的了解家畜的馴化過程，確定其野生近緣種，也可以推測馴化起源地、時間及規(guī)模，理解家畜的分化和品種內變化[5]。mtDNA已被用于解決家畜遺傳多樣性、系統(tǒng)進化關系、起源分化的關系、遺傳親緣關系[6-10]等方面的研究，保護生物學家越來越重視家畜品種遺傳資源，對于制定保護策略有巨大的貢獻。

關于新疆家綿羊的起源目前不是很清楚，許多野生品種如摩佛倫羊(Ovisorientalis)、盤羊(Ovisammon)、塬羊(Ovisvignei)都曾經被認為是家養(yǎng)綿羊的祖先，或者至少對某些品種遺傳資源具有一定的貢獻。最近對家養(yǎng)綿羊mtDNA分析顯示其有多個不同的母系起源，而且認為在綿羊的進化過程中塬羊和盤羊沒有貢獻，而家養(yǎng)綿羊共同的祖先被認為是摩佛倫羊[ 11-14 ]，也有研究認為新疆綿羊群體之間分化程度不高[ 15 ]。

本實驗通過研究新疆地方綿羊Cytb基因，確定其遺傳背景情況和遺傳特征，通過Cytb基因來反映其遺傳多樣性和豐富度，確定綿羊在種內、種間的遺傳結構，了解綿羊各類群間及其近緣群中間的親緣關系。根據綿羊的遺傳分化情況劃分綿羊品種類型，同時為遺傳資源的動態(tài)監(jiān)測，合理開發(fā)利用家畜的遺傳資源，定向培育新品種，為進一步摸清新疆地方綿羊品種遺傳現狀提供一定的理論依據。

1 材料與方法

1.1 供試材料

本試驗隨機采集蒙古羊、哈薩克羊、巴仕拜羊、卡拉庫爾羊、柯爾克孜羊、哈密羊、和田羊、麥蓋提羊、塔什庫爾干羊、阿爾泰羊血樣各十份(表1)，共100份。每只羊取靜脈血2 mL，無水乙醇與血樣按1∶1混勻，置于2 mL凍存離心管中，-20 ℃保存。本實用酚-氯仿法提取血樣DNA。于0.8 %瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計檢測DNA純度及濃度，將濃度稀釋成50 ng/μl，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 PCR擴增與測序

引物的合成根據文獻報道[16]，直接確定目前廣泛應用的引物序列：上游引物5′ TGATCAACATCCGAAAAACC-3′， 下游引物5′-TTCGATGATGCTAGC TACTGG-3′。該引物由上海生工生物技術公司合成。PCR反應體系為10×Buffer 1.5 mmol/ L、dNTP 0.17 mmol/L、Primer L 0.4 mmol/L、Primer R 0.4 μmol/L、Taq酶 2U、DNA 2 ng/μl，ddH2O補齊50 μl。PCR擴增反應程序為：95 ℃預變性 5 min，30個循環(huán)(95 ℃ 1 min，62 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min)，72 ℃最終延伸10 min，4 ℃保存。1.5 %瓊脂糖凝膠檢測，由上海生工進行雙向測序。

1.3 統(tǒng)計方法與分析軟件

測序結果用Chromas觀察峰值并用DNAStar7.1對序列進行編輯校正；采用DNAMAN6.0對正反向序列進行拼接；將100條地方綿羊Cytb全序列和NCBI數據庫中下載的其他的序列進行比對分析；使用MEGA6.0[17]統(tǒng)計序列堿基組成、多態(tài)位點數、單一信息位點數、簡約信息位點數、單倍型間的遺傳距離等，以鄰接法(Neighbor-joining，NJ)和極大似然法(Maximum likelihood，ML)構建系統(tǒng)發(fā)育樹,進化樹各分支的置信度采用1000次自檢分析進行重復檢驗；Medianjioning單倍型網絡圖由Network4.6.11[18 ]繪制。應用DnaSP 5.10[19 ]計算單倍型數(Number of haplotypes，h)，單倍型多樣度(Haplotype diversity，Hd)，核苷酸多樣度(Nucleotide diversity，Pi)，平均核苷酸差異數(Average number of nucleotide differences，K)，遺傳變異系數Fst，基因流Nm，并進行中性檢驗，繪制單倍型岐點分布圖(Mismatch distribution)。

2 結果與分析

2.1 Cytb基因全序列的堿基組成及序列變異

經測序得到100個樣本的擴增序列，經過軟件校對和編輯后有效序列全長為984 bp。結果表明PCR擴增總是產生大小相同的條帶，無其他非特異性條帶影響，經序列比對與氨基酸轉換，表明無轉化、確實和插入密碼子出現。由此可得我們所得到的序列均為線粒體細胞色素b序列，而非細胞核中線粒體假基因的干擾。從100條綿羊Cytb基因序列共定義37種單倍型。T、C、A、G 4種堿基組成的平均含量來看分別為27.4 %、29.1 %、30.1 %和13.4 %，各品種間4種堿基的比例也略有差異，但差異不顯著。其中G+C含量的比例為42.5 %，低于A+T含量的比例57.5 %。從結構上說明了Cytb區(qū)的功能明顯的反G偏倚，是脊椎動物線粒體DNA的共同特點之一 。

表1 新疆地方綿羊遺傳多樣性參數

圖1 Cytb 基因的變異位點Fig.1 Variable sites of Cytb gene

各綿羊群體的核苷酸多樣度(Pi)、單倍型多樣度(Hd)和平均核苷酸差異數(K)見表1。從單倍型角度來看，巴什拜羊單倍型多樣度最高，為1.000±0.0020，而蒙古羊單倍型多樣度最低，為0.378±0.0328；核苷酸多樣性反映的是核苷酸序列的平均差異，麥蓋提羊最高，為0.0061，最低為哈密羊0.001。在所有位點中沒有發(fā)現插入和缺失變異，共發(fā)現60個變異位點，均為兩堿基變異，其中單一多態(tài)位點32個，簡約信息多態(tài)位點28個。3個位點發(fā)生轉換，0個位點發(fā)生顛換。圖1為地方綿羊Cytb基因37種單倍型的多態(tài)位點。

表2 新疆地方綿羊群體間遺傳距離

2.2 新疆地方綿羊遺傳結構分析分析

本實驗所測序的10個綿羊品種100條序列經軟件分析，確定了37 種單倍型，其中H1為優(yōu)勢單倍型，約占樣本含量的46 %，巴仕拜羊的單倍型數最多10個單倍型多樣性也最高1.000±0.00200，其次是塔什庫爾干羊表現出7個單倍型，柯爾克孜羊、哈薩克羊表現出6個單倍型，哈密羊和卡拉庫爾表出5個單倍型，和田羊和阿勒泰羊表現出4個單倍型，蒙古羊表現出3個單倍型見(表1)。

對10個受試綿羊品種的細胞色素b部分序列，利用MEGA 6.0軟件選擇Kimura-2參數模型，計算品種間的平均遺傳距離。從表2可以看出，和田羊與哈薩克羊的遺傳距離最近0.0020，巴什拜羊與麥蓋提羊遺傳距離最遠0.0058。

應用軟件NETWORK 4.1.1.1，采用中介網絡分析法(Medianjioining)對綿羊群體的Cytb序列進行分析。家養(yǎng)動物在馴化過程中會隨著人類的遷移，從起源地不斷向外遷移，形成群體擴張，在網絡上表現出的是“星狀結構”，因此，對于系統(tǒng)發(fā)育分析，傳統(tǒng)“二叉樹”對物種內個體間較近的DNA序列之間的進化反映不真實研究證明通過網絡分析。更能客觀描述種內不同單倍型間的遺傳進化關系。中介網絡進化圖顯示新疆地方綿羊群體可分為A、B、C 3個大的支系，從表2可以看到，每個支系呈“星狀”，提示新疆地方綿羊至少存在有3個獨立的母系起源。實心圓點(紅色圓點)為軟件給出的中間單倍型，通過它將其他一些單倍型連接起來，從進化的角度這些中間單倍型可以解釋為他們在群體中存在沒有檢測到，或者在群體中曾經存在但隨著進化隨機消失了。

依據所獲得的細胞色素b序列，選取綿羊近緣種盤羊(Ovisammon)，歐洲摩弗倫羊(Ovismusimon)，東方盤羊(Ovisorientalis)的同原序列(GenBank登錄號：AJ867276.1、D84203.1 、FJ936231.1)作為外群，采用Kimura 2-參數模型，同時應用自引導檢驗(bootstrap test)估計系統(tǒng)樹中結點的置信度(自引導的重復次數為1000次) ，采用Neighbor-joining、Maximum likelihood 2種方法，構建2個種群各單元型間的系統(tǒng)發(fā)生關系。從圖3～4可以看出，3個分支與單倍型一一對應。37個單倍型可以歸結為3個獨立的分枝，分別命名為A、B和C。其中A單倍型組包括22個單倍型，B單倍型組包括9個單倍型，并發(fā)現歐洲摩弗倫羊余B支系聚在一起，C單倍型組包括6個單倍型。這一結果提示現代家綿羊有3個獨立的母系起源，其中A和B單倍型已經被證實，而第3種單倍型(C單倍型)為新發(fā)現的單倍型。在所有的系統(tǒng)聚類圖中，這3個單倍型組都保持了相對的穩(wěn)定性，而且各單倍型組內的個體也大體一致，從而進一步證實了第3個母系起源的存在。支系B與支系C遺傳距離最大為0.0149，A與B最小為0.0051；遺傳分化系數Gst支系A與支系C較低0.00277，說明2個支系之間的距離較遠(表3～4)。Fu’s檢驗表明差異不顯著(D=-2.21875， 0.05

圖2 10個綿羊群體的網絡進化分析Fig.2 Network analysis based on mt-DNA haplotypes of 10 sheep populations

LineageABB0.0051-C0.0130.015

圖3 基于細胞色素B(Cytb)基因列構建的鄰接樹Fig.3 NJ tree based on Cytb gene sequence

圖5 A支系核苷酸不配對分布Fig.5 Mismatch distribution for lineage A

LineageLineageGstDaDxyFsttestAB0.00680.00180.00510.3584BC0.01500.00630.01110.5629CA0.00280.00810.01300.6236

圖4 基于細胞色素B(Cytb)基因列構建的最大自然數Fig.4 ML tree based on Cytb gene sequence

圖6 B支系核苷酸不配對分布Fig.6 Mismatch distribution for lineage B

圖7 C支系核苷酸不配對分布Fig.7 Mismatch distribution for lineage C

2.3 新疆地方綿羊群體歷史動態(tài)分析

對分析的綿羊細胞色素b 序列用Tajiam’sD值進行中性檢驗，個綿羊品種的Tajiam’sD值詳見表1，各綿羊品種經中性檢驗均不顯著，而整個綿羊群體Tajiam’sD值為-1.9678，經中性檢驗也不顯著(P>0.10)，符合中性突變。根據群體核苷酸不配對分布曲線是否呈現多峰或單峰型，以及Tajiam’s D值中性檢驗是否顯著判定群體在過去是否發(fā)生了群體擴張，若核苷酸不配對曲線呈現單峰分布，且Tajiam’sD值顯著偏離中性檢驗，則群體在過去經受了擴張，反之群體大小保持穩(wěn)定[20-21]。本實驗測定3個支系的核苷酸不配對分布曲線如圖5～7所示，分析表明A支系呈現單峰Tajiam’sD值中性檢驗結果顯著說明A支系過去出現群體擴張，B支系呈現雙峰Tajiam’sD值中性檢驗結果不顯著說明B支系過去沒有出現群體擴張和持續(xù)增長模式，群體大小保持穩(wěn)定。C支系呈現多峰Tajiam’sD值中性檢驗結果不顯著說明群體可能經歷過多種瓶頸效應，也可能群體水平保持不變。

3 討 論

3.1 新疆地方綿羊Cytb序列特征和遺傳多樣性

在984 bp的所有序列中共檢測出60個變異位點，其中單一多態(tài)位點32，簡約信息多態(tài)位點為28個。遠遠低于D-loop區(qū)的核苷酸多樣性，可見Cytb基因具有相對的保守性。本研究測定了新疆地方綿羊100只個體的Cytb序列，共檢測出37個單倍型，單倍型的多樣性為0.785±0.00193，核苷酸多樣性為0.00368±0.01185，說明新疆地方綿羊群體具有較高的遺傳多樣性。張傳生等[22]利用細胞色素b基因的部分序列片段對4個綿羊品種進行了研究，結果mtDNA多態(tài)性較貧乏，G+C的平均含量為38.3 %，核苷酸替換在綿羊上全部為轉換。國內學者通過mtDNA的RFLP方法對我國其他綿羊品種(云南的3個綿羊品種[23]，蒙古羊、烏珠穆沁羊、湖羊和小尾寒羊[24]貴州威寧綿羊和六盤水綿羊[25])的研究結果均表明，我國綿羊品種的遺傳多樣性比較匱乏。另外，賈斌等[26]對新疆8個綿羊品種的遺傳多樣性和系統(tǒng)發(fā)生關系進行了微衛(wèi)星分析，結果所有綿羊群體的平均多態(tài)信息含量均低于國外其他品種的綿羊，基因多態(tài)性和遺傳多態(tài)性相對貧乏。趙倩君等[27]對12個綿羊品種和多角綿羊的細胞色素b全序列，對不同地區(qū)、不同類型的中國綿羊群體cytb基因本試驗的綿羊個體可定義為 40 個單倍型，單倍型多樣度為 0.997±0.006，核苷酸多樣度為 0.793 %，反映群體多樣性和遺傳變異豐富度。結果都說明中國綿羊品種不論從核DNA角度還是從線粒體DNA的角度進行的研究，都表現出遺傳多樣性較匱乏。耿立英等[28]用PCR方法擴增出灘羊和洼地綿羊共112個個體Cytb基因，用限制性內切酶EcoR Ι對其進行限制性長度多態(tài)性(RFLP)分析，結果顯示在56個灘羊樣品為2種限制性態(tài)型，而56個洼地綿羊為1種限制性態(tài)型，說明綿羊品種線粒體DNA多態(tài)性較第，且mtDNACytb基因在種內、種間保守性較強。

3.2 新疆地方綿羊的起源進化

我國飼養(yǎng)家養(yǎng)動物歷史悠久，我國具有家養(yǎng)動物資源非常豐富。據近年來有關報道，我國的綿品種共有79個，山羊品種48個[29]，新疆主要綿羊地方品種9個，育成品種4個，引進品種4個[3]。新疆地大物博，畜牧業(yè)歷史悠久，其自然條件得天獨厚，具有獨特的文化條件和社會經濟條件，因此新疆地方綿羊品種豐富多樣且性狀優(yōu)良。以往關于新疆地方綿羊品種間遺傳變異與起源分化研究主要集中在少數品種或群體間，而關于新疆綿羊品種間系統(tǒng)全面的研究卻鮮有報道。因此對新疆地方綿羊起源仍存在一定爭議。王昕等[30]對中國中西部9個地方綿羊品種Cytb基因全序列進行了遺傳多樣性與系統(tǒng)進化研究結果表明檢測出18種單倍型，單倍型多樣性為97.1 %。分析發(fā)現現中國綿羊群體存在A、B、C 3種單倍型。曹麗榮等[31]從細胞色素b基因全序列差異分析了巖羊和矮巖羊的系統(tǒng)進化關系，推測矮巖羊與巖羊之間的差異可能已經達到了亞種的水平。張傳生等[32]測定了小尾寒羊、大尾寒羊和洼地綿羊mtDNA細胞色素b基因的415 bp基因片段，推測這3個品種具有共同的母系祖先。鞏元芳等[33]應用 PCR-RFL P 方法 ，對我國 9 個地方綿羊品種和 3 個引入品種共計 120 個綿羊個體的Cytb基因進行分析，共得到4 種基因單倍型類型，其中單倍型 Ⅰ為受試綿羊品種的基本單倍型。趙倩君等[27]測定中國8個省區(qū) 42個綿羊個體的細胞色素 b 基因全序列，試驗結果表明共發(fā)現 40 個單倍型，單倍型多樣度為 0.997±0.006，核苷酸多樣度為 0.793 %。系統(tǒng)發(fā)育分析表明，中國地方綿羊群體共可分為 4 個支系(A、B、C 和 D)，說明中國綿羊有多個母系起源或經過多次馴化，且未發(fā)現盤羊、東方盤羊和亞洲摩佛倫羊對綿羊進化具有貢獻的分子證據。

本研究為了進一步確定新疆地方綿羊品種母系起源到底有幾個，選擇了mtDNA結構中Cytb基因的部分序列進行遺傳結構分析。并且我們所選取的樣本是新疆各地具有代表的綿羊品種，他們都是長期長期在當地自然地理環(huán)境下成長的品種，所受到受外來品種的影響較小甚至沒有，因此能夠真實反應新疆地方品種的遺傳結構和起源。利用細胞色素b基部分全序列構建的系統(tǒng)進化樹都表明新疆地方綿羊品種具有3個母系起源，而且第3種單倍型僅在新疆地方綿羊品種中出現，推測新疆可能是現代家綿羊的一個起源地，這一結果與Hiendleder[34-37]等的觀點不同。樣本來源不同是導致這一差異的主要原因是，他們所研究的樣本是來自于非洲、新西蘭、歐洲和中亞地區(qū)，并沒有新疆地方綿羊品種。在本試驗中通過借用GenBank上已發(fā)表的歐洲摩弗倫羊，東方盤羊，亞洲摩弗倫羊的細胞色素b部分序列構建的系統(tǒng)樹。結果表明，摩佛倫羊聚在B單倍型組中，說明與新疆地方綿羊品種關系較近的是摩佛倫羊。而盤羊自成一類，并沒有出現在3個單倍型組中，3個支系之間的遺傳距離表明支系A與支系B之間的遺傳距離較近，C支系與其他2個支系之間的距離較遠，證明了Hiendleder等的觀點。在C單倍型組中也沒有出現歐洲個體，因而可以進一步論證上述結果的可靠性，即新疆地方綿羊品種間存在第3個母系起源，而且起源地可能就在中國。此外，由于序列數據本身的局限性問題，還要通過表型分析、考古學、社會學以及歷史學等方面提供佐證。

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(責任編輯 陳 虹)

Genetic Diversity and Origin of Xinjiang Domestic Sheep(Ovisaries) Analyzed byCytbgene

NING Li-qun, GULNAR Hasan, MAHMUT Halik*

(College of Life Science and Technology, Xinjiang University, Xinjiang Urumqi 830016, China)

In order to explore the Xinjiang sheep’s system evolution and origin, thecytbsequences from 10 breed populations were studied. The result showed that the 37 different haplotyes and 60 polymorphic sites from 10 breed populations by phylogenetic analysis were found; The haplotype diversity(Hd), nucleotide diversity(Pi) of them were 0.785±0.00193, 0.00368±0.01185, which indicated that Xinjiang sheep breed populations had high genetic diversity; The phylogenetic trees by Neighbor joining or Maximum likelihood were divided into three branches,which would provide a theoretical basis for the establishment of the domesticated sheep population relation in Xinjiang and the protect of germplasm resource.

Cytb; Domestic sheep; Genetic diversity; Origin

1001-4829(2016)12-3001-08

10.16213/j.cnki.scjas.2016.12.041

2015-11-08

國家自然科學基金項目(31360266)

寧禮群(1991-)，女，碩士研究生，主要從事動物保護遺傳，E-mail:379960499@qq.com，*為通訊作者：馬合木提·哈力克(1959-)，維吾爾族，男，教授，博士，博士生導師，E-mail: mahmuthalic@xju.edu.cn。

S826

A