印度黃檀莖段腋芽誘導(dǎo)培養(yǎng)研究

杜 婷，牛慈瓊，石 雷*，廖懷建

(1.中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院資源昆蟲研究所，云南 昆明 650224；2.山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹研究所，山西 太原 030031)

印度黃檀莖段腋芽誘導(dǎo)培養(yǎng)研究

杜 婷1，牛慈瓊2，石 雷1*，廖懷建1

(1.中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院資源昆蟲研究所，云南 昆明 650224；2.山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹研究所，山西 太原 030031)

為建立有效的印度黃檀組培快繁技術(shù)，本研究采用優(yōu)樹嫁接苗的腋芽莖段作為外植體，闡明不同消毒方法、不同基礎(chǔ)培養(yǎng)基、不同植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑和活性炭濃度對(duì)誘導(dǎo)培養(yǎng)的影響，以期為獲得能夠保持母株優(yōu)良性狀的無性系苗木奠定基礎(chǔ)。結(jié)果表明，最佳的消毒方法是，外植體先用75%酒精浸泡30 s，然后用0.1 %升汞浸泡10 min，此時(shí)污染率最低，腋芽萌發(fā)率最高，污染率和存活率分別為(16.67±2.03)%和(70.33±2.03)%；相對(duì)于B5和WPM基礎(chǔ)培養(yǎng)基，使用MS培養(yǎng)基對(duì)外植體進(jìn)行培養(yǎng)，萌芽率和苗高最高，分別為(85.00±2.89)%和(22.03±0.09)mm；培養(yǎng)基中植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑6-BA和NAA的濃度及兩者濃度比率均對(duì)腋芽誘導(dǎo)產(chǎn)生顯著影響；當(dāng)NAA濃度(0.01～0.02 mg/L)較低時(shí)，在0.2～0.3 mg/L范圍內(nèi)提高6-BA的濃度有利于植株生長(zhǎng)，且兩者濃度比率達(dá)到20～30時(shí)，最適宜腋芽誘導(dǎo)；在最適激素濃度條件下，添加0.5 g/L活性炭，能夠有效提高外植體萌芽率，降低玻璃化率。綜上所述，印度黃檀莖段腋芽誘導(dǎo)的最適培養(yǎng)基為MS+0.3 mg/ L 6-BA+0.01 mg/L NAA+0.5 g/L。

印度黃檀;消毒;腋芽;誘導(dǎo)培養(yǎng)

印度黃檀(DalbergiasissooRoxb)屬蝶形花科(Fabaceae)黃檀屬(Dalbergia)多用途速生木本植物,主要分布于印度、巴基斯坦和尼泊爾等國(guó)家[1-2]。印度黃檀木材具有優(yōu)良的堅(jiān)固性和彈性，可用于制作家具、櫥柜、樂器和膠合板；而根、干和葉均可入藥，且性辛、溫，有活血行淤，止血止痛的功效，主治風(fēng)濕性腰腿痛、支氣管炎、跌打腫痛、胃痛、疝氣痛、冠心病等[3]。印度黃檀不僅木材和藥用價(jià)值非常高，而且耐干旱耐脊薄，是一種值得推廣的珍貴樹種[4]。印度黃檀常規(guī)的繁殖方式，一般通過種子進(jìn)行有性繁殖，或者吸根、莖段扦插進(jìn)行無性繁殖[5]。通過有性繁殖產(chǎn)生的子代，苗木參差不齊，無法保持母株的優(yōu)良特性[6]；通過扦插或嫁接等無性繁殖方法進(jìn)行繁殖，費(fèi)時(shí)費(fèi)力，且繁殖系數(shù)較低，嚴(yán)重影響良種推廣進(jìn)程；而采用組織培養(yǎng)快繁技術(shù)，可在短時(shí)間內(nèi)獲得大量保持母株優(yōu)良性狀的無性系苗木，能夠滿足規(guī)?；炝謱?duì)印度黃檀優(yōu)良種苗的需求。目前在印度黃檀組織培養(yǎng)方面，國(guó)外已有很多采用組織培養(yǎng)方法獲得再生植株的成功案例，主要有2種方法：利用子葉[7]、莖段[8]或懸浮細(xì)胞[9]培養(yǎng)得到的愈傷，進(jìn)一步誘導(dǎo)獲得再生芽；直接利用莖段[10-12]誘導(dǎo)腋芽得到再生芽，最終通過再生芽增殖獲得再生植株。不過，國(guó)內(nèi)針對(duì)印度黃檀離體培養(yǎng)至今鮮見報(bào)道。因此，本研究以印度黃檀嫁接苗的莖段作為外植體，探索適合腋芽誘導(dǎo)的培養(yǎng)基配方，旨在為印度黃檀組培快繁體系的建立奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

外植體于2014年3-6月采自中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院資源昆蟲研究所元江試驗(yàn)站印度黃檀采穗圃中優(yōu)樹嫁接苗。

1.2 不同消毒方法對(duì)外植體污染的影響

選取生長(zhǎng)健壯，無病蟲害植株的當(dāng)年生幼嫩枝條，去除葉片，流動(dòng)清水洗去表面塵垢后，將幼嫩枝條剪成長(zhǎng)為3～4 cm含腋芽的莖段。置于盛有1 000 mL洗衣粉溶液的燒杯中浸泡20 min后，用紗布封住燒杯口，以流動(dòng)清水沖洗30～60 min，在無菌條件下消毒處理。

外植體的消毒方法見表1。選取3種較常用的消毒劑：2 %的次氯酸鈉、75 %的酒精、0.1 %升汞溶液。莖段消毒方法主要有2種：將清洗過的外植體置于盛有2 %次氯酸鈉溶液的燒杯中浸泡5 min后將外植體分別置于盛有0.1 %升汞溶液燒杯內(nèi)浸泡8、10和12 min，重復(fù)3次，每個(gè)重復(fù)有20個(gè)莖段；將清洗過的外植體分成3份分別先置于75 %酒精中浸泡20、30和40 s，重復(fù)3次，每個(gè)重復(fù)有20個(gè)外植體，然后置于盛有0.1 %升汞溶液的燒杯內(nèi)浸泡10 min后，將外植體用無菌水沖洗5～6次。然后接種到添加有植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑0.3 mg/L 6-BA、0.01 mg/L NAA，蔗糖30 g/L和瓊脂粉7 g/L，pH值為6.0的MS培養(yǎng)基中，置于溫度(26±2)℃、光照強(qiáng)度1500 lx，光照時(shí)間12 h/d的條件下培養(yǎng)。于培養(yǎng)第10天查看外植體污染情況，并記錄污染數(shù)量，以此計(jì)算污染率；并于培養(yǎng)第20天查看外植體存活數(shù)量，以此計(jì)算存活率。

1.3 不同培養(yǎng)基對(duì)外植體萌芽的影響

1.3.1 基礎(chǔ)培養(yǎng)基對(duì)外植體萌芽的影響 選取木本植物組織培養(yǎng)中常用的MS、B5和WPM 3種基礎(chǔ)培養(yǎng)基。選取經(jīng)75 %酒精浸泡30 s后，0.1 %升汞浸泡10 min方法消毒的外植體分別培養(yǎng)于MS、B5和WPM培養(yǎng)基中，置于溫度(26±2) ℃、光照強(qiáng)度1500 lx，光照時(shí)間12 h/d的條件下培養(yǎng)，每種培養(yǎng)基3個(gè)重復(fù)，每重復(fù)20個(gè)外植體。在培養(yǎng)后每隔2 d觀察1次，查看外植體芽苗生長(zhǎng)情況剔除污染的外植體，第20天記錄萌芽的外植體數(shù)量，計(jì)算萌芽率，同時(shí)測(cè)量芽苗長(zhǎng)度。

1.3.2 誘導(dǎo)培養(yǎng)基對(duì)外植體萌芽的影響 以MS為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，添加不同濃度的植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑(6-BA：0.1、0.2、0.3 mg/L；NAA：0.01、0.05、0.07 mg/L)進(jìn)行外植體誘導(dǎo)培養(yǎng)，誘導(dǎo)培養(yǎng)條件參見1.3.1，具體濃度配比試驗(yàn)設(shè)計(jì)見表4，每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)20個(gè)外植體。在培養(yǎng)后每隔2 d觀察1次，查看外植體芽苗生長(zhǎng)情況剔除污染的外植體，第20天記錄萌芽的外植體數(shù)量，計(jì)算萌芽率，同時(shí)測(cè)量芽苗長(zhǎng)度。

表1 外植體消毒方法

表2 外植體各種消毒組合試驗(yàn)效果

注：數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤，同列數(shù)據(jù)后的大寫字母不同表示差異顯著。下同。

Notes:Data were mean±SE, which followed by different capital letters in the same column indicate significant difference. The same as below.

1.3.3 抗玻璃化培養(yǎng)基對(duì)外植體萌芽的影響 以MS為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，添加不同濃度的植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑(6-BA：0.1、0.2、0.3 mg/L；NAA：0.01、0.02、0.03 mg/L)及抗玻璃化添加劑(活性炭：0、0.5、1.0 mg/L)，采用3因素3水平的正交設(shè)計(jì)，具體試驗(yàn)設(shè)計(jì)見表5，培養(yǎng)條件參見1.3.1。每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)20個(gè)外植體。在培養(yǎng)后每隔2 d觀察1次，查看外植體芽苗生長(zhǎng)情況剔除污染的外植體，第20天記錄萌芽的外植體數(shù)量，計(jì)算萌芽率，同時(shí)測(cè)量芽苗長(zhǎng)度。

所有培養(yǎng)基中均添加蔗糖30 g/L和瓊脂粉7 g/L，調(diào)節(jié)pH值為6.0，并在121 ℃、131 kPa條件下滅菌20 min。

1.4 數(shù)據(jù)分析

經(jīng)不同消毒方法消毒后及不同培養(yǎng)基培養(yǎng)后的外植體萌芽率、存活率和玻璃化率均代入sqrt(x+1)進(jìn)行轉(zhuǎn)換，使其盡量符合正太齊性，然后采用單因素方差檢驗(yàn)不同消毒方法以及不同培養(yǎng)基間的差異，若差異達(dá)到顯著水平，則采用Duncan's multiple-range test方法進(jìn)行檢驗(yàn)。不同培養(yǎng)基培養(yǎng)后的外植體苗高的差異采用單因素方差分析方法檢驗(yàn)，差異達(dá)到顯著水平，則采用Duncan's multiple-range test方法檢驗(yàn)。采用所有數(shù)據(jù)分析均在SAS 9.0中進(jìn)行。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同消毒方法對(duì)外植體污染的影響

不同消毒方法顯著影響外植體的污染率和存活率(表2)。經(jīng)S1和S4消毒方法消毒的外植體污染率最高，分別為(40.33±2.03)%和(33.33±1.76)%，其它消毒方法間無顯著差異(F5,12=4.52,P=0.015)。經(jīng)S5消毒方法消毒的外植體存活率最高，其次為S4、S2和S6，最差的是S1和S3(F5,12=3.74,P=0.015)。綜合顯示，經(jīng)不同消毒方法消毒后外植體的污染率和存活率，S5消毒方法表現(xiàn)最優(yōu)，其次為S6。采用75 %酒精浸泡30 s后，0.1 %升汞浸泡10 min的方法消毒印度黃檀外植體。

2.2 基礎(chǔ)培養(yǎng)基對(duì)外植體萌芽的影響

基礎(chǔ)培養(yǎng)基顯著影響外植體的腋芽誘導(dǎo)(表3)。經(jīng)MS培養(yǎng)基培養(yǎng)后外植體的萌芽率和苗高均顯著提高(萌芽率：F2,6=18.57,P=0.0027；苗高：F2,177=72.41,P<0.0001)，分別為(85.00±2.89)%和(22.03±0.09)mm；此時(shí)，生長(zhǎng)出的新芽健壯，新葉嫩綠，且葉片伸展正常；經(jīng)WPM培養(yǎng)基培養(yǎng)后外植體的萌芽率表現(xiàn)最差，為(61.67±1.67)%，此時(shí)新芽細(xì)弱，新葉發(fā)黃，且葉片細(xì)小；B5培養(yǎng)基居于中間，不過其生長(zhǎng)的新芽細(xì)弱，葉片伸展雖然正常，但新葉發(fā)黃(表3)。綜上表明，經(jīng)MS基礎(chǔ)培養(yǎng)基培養(yǎng)的外植體表現(xiàn)最好，適合作印度黃檀外植體培養(yǎng)的基礎(chǔ)培養(yǎng)基。

表3 不同基礎(chǔ)培養(yǎng)基對(duì)外植體生長(zhǎng)的影響

表4 不同植物調(diào)節(jié)劑配比對(duì)誘導(dǎo)培養(yǎng)的影響

2.3 誘導(dǎo)培養(yǎng)基對(duì)外植體萌芽的影響

不同濃度生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑及配比顯著影響外植體的腋芽誘導(dǎo)(表4)。經(jīng)C3培養(yǎng)基培養(yǎng)后的外植體的萌芽率和苗高均顯著提高(萌芽率：F4,10=63.77，P<0.0001；苗高：F4,295=65.97，P<0.0001)，分別為)(84.33±0.67)%和(22.9±1.20)mm；其次為C2和C5，最差的是C1。另外根據(jù)植株生長(zhǎng)顯示，過高濃度的6-BA和NAA配合會(huì)導(dǎo)致植株出現(xiàn)玻璃化、發(fā)黃落葉的現(xiàn)象。綜合考慮，處理C3最利于印度黃檀的誘導(dǎo)培養(yǎng)，但絕大多數(shù)植株有玻璃化現(xiàn)象，需要進(jìn)一步篩選印度黃檀誘導(dǎo)培養(yǎng)階段的抗玻璃化培養(yǎng)基。

2.4 抗玻璃化培養(yǎng)基對(duì)外植體萌芽的影響

抗玻璃化添加劑活性炭顯著緩解了誘導(dǎo)出的芽苗的玻璃化狀況(表5)。經(jīng)V4培養(yǎng)基培養(yǎng)后的外植體萌芽率最高(F8,18=1153.23，P<0.0001)，為(100±0)%，其次為V5、 V6和V7，最差的是V3。經(jīng)V4培養(yǎng)基培養(yǎng)后的芽苗玻璃化率(F8,18=197.10，P<0.0001)最低，為(5.17±0.44)%，V2和V3表現(xiàn)次之，V6表現(xiàn)最差；經(jīng)V2培養(yǎng)基培養(yǎng)后的苗高顯著提高(F8,531=142.67，P<0.0001)，為(26.40±0.21)mm，其次為V1和V4，最差的是V5。綜合顯示，經(jīng)不同培養(yǎng)基誘導(dǎo)后外植體的萌芽率、玻璃化率和苗高，V4表現(xiàn)最優(yōu)，因此V4培養(yǎng)基即MS+6-BA 0.1 mg/L+NAA 0.02 mg/L+C 0.5 g/L可作為印度黃檀外植體誘導(dǎo)的培養(yǎng)基。

3 討 論

無菌外植體是離體快繁體系建立的基礎(chǔ)，外植體的表面消毒既要求將外植體表面的微生物徹底殺死，又要求盡可能減少對(duì)外植體組織和表皮細(xì)胞的傷害。單獨(dú)使用一種消毒劑很難獲得較好的消毒效果，即使殺毒效果最好的升汞單獨(dú)使用2～8 min，污染率仍在60 %以上[13]，在花梨木莖段腋芽誘導(dǎo)培養(yǎng)中，林妃[14]采用單一一種消毒劑進(jìn)行試驗(yàn)，得到的最佳消毒方法：0.2%升汞處理，污染率高達(dá)54.2 %；10 %次氯酸鈉處理，污染率為44.3 %。有研究者對(duì)辣木[15]、油茶[16]等莖段外植體消毒試驗(yàn)中采用酒精和升汞的組合能將污染率控制在30 %以下，因此采用消毒劑的組合處理外植體能達(dá)到更好的消毒效果。本研究通過3種不同消毒劑組合消毒，篩選出印度黃檀外植體消毒的最佳方法是：將外植體先用75 %酒精浸泡30 s，利用酒精滲透壓吸收細(xì)菌水分，使其快速失水死亡；然后再用0.1 %升汞浸泡10 min，升汞中所含重金屬離子可使含有巰基、氨基、羥基的酶受到損傷，甚至失去活性，喪失功能，從而殺死外植體表面細(xì)菌，在培養(yǎng)后第10天觀察到外植體污染率為(16.67±2.03)%，存活率高達(dá)(70.33±2.03)%。

表5 不同植物調(diào)節(jié)劑和添加劑配比對(duì)誘導(dǎo)培養(yǎng)的影響

植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)器官的分化調(diào)節(jié)起重要作用，NAA能促進(jìn)細(xì)胞分裂與擴(kuò)大，誘導(dǎo)形成不定芽；6-BA能促進(jìn)芽的分化、側(cè)芽的生長(zhǎng)[19]，而細(xì)胞分裂素和生長(zhǎng)素的配比是誘導(dǎo)器官發(fā)生的關(guān)鍵因子[20]。本試驗(yàn)中，不同生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑具有明顯促進(jìn)腋芽萌發(fā)的作用，且濃度和濃度比率不同，誘導(dǎo)效果存在顯著差異。保持NAA濃度(0.01～0.02 mg/L)較低時(shí)，在0.2～0.3 mg/L內(nèi)提高6-BA的濃度有利于植株生長(zhǎng)。在囊狀紫檀[19]、紫薇[20]、印度黃檀[21]等木本植物的研究中也得到了相同的結(jié)論，低濃度生長(zhǎng)激素與細(xì)胞分裂素的配合可促進(jìn)再生芽的生長(zhǎng)。此外，芽的誘導(dǎo)不僅僅取決于生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的濃度，還與細(xì)胞分裂素和生長(zhǎng)素濃度的比率有關(guān)，比率達(dá)到適宜范圍內(nèi)，才能使萌芽率提高。當(dāng)6-BA/NAA比率在20～30時(shí)，印度黃檀外植體的腋芽萌發(fā)率較高，此時(shí)苗高也顯著高于其它6-BA/NAA比值。同時(shí)，在闊葉黃檀[17]、美國(guó)黑核桃[22]和臭椿[23]等植物的莖段腋芽誘導(dǎo)試驗(yàn)中也得到了相似的結(jié)果。

玻璃化現(xiàn)象主要出現(xiàn)在植物培養(yǎng)的增殖階段，誘導(dǎo)階段很少會(huì)出現(xiàn)玻璃化的現(xiàn)象。植物組織培養(yǎng)過程中出現(xiàn)玻璃苗的現(xiàn)象很普遍，目前已報(bào)道出現(xiàn)玻璃化的植物達(dá)70多種[24]。一些研究者在羅漢果[25]和藍(lán)莓[26]的增殖培養(yǎng)中發(fā)現(xiàn)，在培養(yǎng)基中添加了0.5 g/L活性炭，能夠促進(jìn)壯苗生長(zhǎng)和玻璃化緩解。本研究發(fā)現(xiàn)將活性炭添加培養(yǎng)基，在誘導(dǎo)過程中，能夠有效緩解玻璃化現(xiàn)象的產(chǎn)生，在適宜外源激素濃度下，腋芽誘導(dǎo)和生長(zhǎng)的最適活性炭濃度為0.5 g/L。不過，外源激素水平過高，高濃度的活性炭反而會(huì)誘發(fā)玻璃化現(xiàn)象的產(chǎn)生。因此使用活性炭緩解玻璃化，應(yīng)該在適宜的激素濃度下，采取適宜活性炭濃度，才能最大程度的提高外植體的萌芽率，降低玻璃化率。

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(責(zé)任編輯 王家銀)

Study on Axillary Buds Induction from Stem Segments ofDalbergiasissooRoxb

DU Ting1, NIU Ci-qiong2, SHI Lei1*, LIAO Huai-jian1

(1.Research Institute of Resource Insects, Chinese Academy of Forestry, Yunnan Kunming 650224, China;2.Research Institute of Fruit Tree, Shanxi Academy of Agricultural Sciences, Shanxi Taiyuan 030031, China)

In order to establish effective rapid propagation technique forDalbergiasissooRoxb, axillary buds from stem segments of selected tree grafted seedlings were used as explants in this paper. Effects of different disinfection methods, different basic medium component, and different concentration of plant growth regulator and the activated carbon on its germination of axillary buds were studied for attaining clone seedlings maintained mother plants’ excellent characters. The results showed that the time of 75 % alcohol disinfection was 30 seconds and the time of 0.1 % HgCl2disinfection was 10 minutes, in this treatment, the lowest pollution rate was (16.67±2.03)% and the highest germination rate of the bud was (70.33±2.03)%. Compared with B5and WPM, MS was the optimal culture medium with the highest germination rate (85.00±2.89)%and seedling height(22.03 mm±0.09 mm). The concentration and proportion of 6-BA and NAA had the influence on the explants bud induction. When the concentration of NAA was low (0.01-0.02 mg/L), increasing 6-BA concentration in the range from 0.2 to 0.3 mg/L was beneficial to plant growth. And the proportion of 6-BA and NAA in the range from 20 to 30 was advantageous to the axillary bud induction. Under the condition of the optimal concentration of plant growth regulator, adding 0.5 g/L activated carbon in the medium could effectively improve the germination rate of explants and reduce the rate of vitrification. In conclusion, this study suggested that the medium composition of MS+0.3mg/L 6-BA+0.01mg/L NAA+0.5g/L was the optimum for axillary buds induction from stem segments ofDalbergiasissooRoxb.

DalbergiasissooRoxb; Sterilization methods; Basal medium; Axillary buds induction; Vitrification

1001-4829(2016)12-2959-06

10.16213/j.cnki.scjas.2016.12.034

2016-01-05

國(guó)家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目(2012BAD01B05)；國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目(2016YFD06006005)

杜 婷(1988-)，女，白族，云南麗江人，碩士，助理研究員，主要研究方向?yàn)橹参锝M培，E-mail：duting_x_y@163.com，*為通訊作者，E-mail：leishi@139.com。

S772.3+7

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