有氧運動訓(xùn)練前后循環(huán)血液中microRNA-146a和222的動態(tài)變化及其對心血管功能的調(diào)節(jié)作用

曲振琳，李 萌，劉 凱

(1.山東外貿(mào)職業(yè)學(xué)院基礎(chǔ)教學(xué)部，山東青島 266100；2.山東省青島市第八人民醫(yī)院心內(nèi)科 266000；3.山東省青島市市立醫(yī)院運動醫(yī)學(xué)康復(fù)中心 266000)

有氧運動訓(xùn)練前后循環(huán)血液中microRNA-146a和222的動態(tài)變化及其對心血管功能的調(diào)節(jié)作用

曲振琳1，李 萌2，劉 凱3

(1.山東外貿(mào)職業(yè)學(xué)院基礎(chǔ)教學(xué)部，山東青島 266100；2.山東省青島市第八人民醫(yī)院心內(nèi)科 266000；3.山東省青島市市立醫(yī)院運動醫(yī)學(xué)康復(fù)中心 266000)

目的 探討有氧運動訓(xùn)練對運動員循環(huán)血液中特異微小RNAs(miRNAs)的影響，研究關(guān)鍵miRNA在心血管對運動適應(yīng)過程中的調(diào)節(jié)作用。方法 選取10名大學(xué)新生作為研究對象進行為期8周的有氧運動訓(xùn)練，另外在有氧運動訓(xùn)練前后研究對象分別進行一次急性力竭運動。在訓(xùn)練前后的急性力竭運動中測定研究對象心血管功能相關(guān)指標，同時測定研究對象訓(xùn)練前后靜息狀態(tài)及急性力竭運動后循環(huán)血液中miR-133a、miR-21、miR-146a、miR-199a、miR-15a和miR-222 6個心血管功能相關(guān)的miRNA的水平。結(jié)果 有氧運動訓(xùn)練后，研究對象靜息狀態(tài)miR-146a、miR-222、miR-21、miR-15a和miR-199a水平均顯著高于訓(xùn)練前(P<0.05)；與有氧運動訓(xùn)練前后的靜息狀態(tài)相比，急性力竭運動使miR-146a和miR-222顯著升高(P<0.05)；有氧運動訓(xùn)練前，急性力竭運動使miR-21和miR-15a顯著升高(P<0.05)，但是有氧運動訓(xùn)練后急性力竭運動與靜息狀態(tài)的miR-21和miR-15a水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；訓(xùn)練前后靜息狀態(tài)和急性力竭運動中研究對象miR-133a水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。進一步線性相關(guān)分析發(fā)現(xiàn)研究對象血漿中miR-146a表達量與VO2max水平呈正相關(guān)(r=0.842，P<0.01)，miR-222表達改變量與EF改變量呈正相關(guān)(r=0.920，P<0.01)。結(jié)論 運動員循環(huán)血液中動態(tài)變化的miRNAs可以作為反映訓(xùn)練效果的標志物，miR-146a和miR-222在機體有氧運動訓(xùn)練的心血管功能適應(yīng)起著生理調(diào)節(jié)介質(zhì)的作用。

有氧運動；心血管；微RNAs

長期有氧運動訓(xùn)練會使運動員心血管系統(tǒng)發(fā)生適應(yīng)性改變，包括心肌細胞線粒體合成增多、心肌細胞重構(gòu)及心肌血管增生[1-3]。運動員訓(xùn)練過程中心血管的適應(yīng)程度直接影響著訓(xùn)練的效果及能力的發(fā)揮。因此，改善和提高訓(xùn)練過程中運動員的心血管適應(yīng)效果是運動醫(yī)學(xué)專家關(guān)注的關(guān)鍵問題。雖然很多研究已經(jīng)闡述了長期有氧運動訓(xùn)練對機體運動能力及身體健康的作用，但是造成這種適應(yīng)改變的深層次細胞和分子機制還尚不明朗。

微小核糖核酸(miRNA)雖然只占人類基因總數(shù)的 2%，卻調(diào)控著人類 30%以上的基因表達[4-5]。至今，研究者們在各物種中發(fā)現(xiàn)了7 597種miRNA，其中，在人體中發(fā)現(xiàn)并已經(jīng)通過實驗研究證實的就有 692 種[6]。對miRNA的發(fā)現(xiàn)使研究者們對基因表達調(diào)控有了全新的認識，目前已是生物科學(xué)領(lǐng)域頗受關(guān)注的焦點。近來，研究者在運動醫(yī)學(xué)領(lǐng)域發(fā)現(xiàn)微小RNAs(microRNAs，miRNAs)在運動員對訓(xùn)練的適應(yīng)過程中起著非常重要的細胞內(nèi)固有調(diào)節(jié)作用，包括血管增生、炎性反應(yīng)、線粒體代謝、心肌和骨骼肌收縮、組織細胞肥大等等[7-9]。Zhang等[7]研究認為循環(huán)血液中miRNAs在心血管疾病的發(fā)生和發(fā)展中起著重要的作用，同時某些miRNAs還可以作為預(yù)測心血管疾病的標志物和治療的靶位點。Cheng等[10]發(fā)現(xiàn)運動可以使機體各組織和器官細胞缺血、缺氧產(chǎn)生應(yīng)激，細胞應(yīng)激可以誘導(dǎo)特異性miRNA的表達，這些miRNA可以被釋放到血液循環(huán)中并隨著血液循環(huán)到達靶器官，通過對靶基因的調(diào)控來影響機體對運動的適應(yīng)。

本研究在前人研究的基礎(chǔ)上猜測長期有規(guī)律的有氧運動可以誘導(dǎo)機體產(chǎn)生特異表達的miRNA，它們通過對靶器官的調(diào)節(jié)作用影響機體心血管功能。由此，首先通過閱讀相關(guān)參考文獻篩選出6個候選基因，它們是心肌和骨骼肌收縮相關(guān)的miR-133a[11]和miR-21[12]，細胞缺氧適應(yīng)相關(guān)的miR-146a[13]和miR-15a[6]，血管生成相關(guān)的miR-199a[14]和miR-222[6]作為候選分析miRNAs，再用實時定量的PCR來測定機體在不同有氧運動訓(xùn)練前后它們的表達量。最后通過miRNA與心血管功能指標表達的相關(guān)分析，找出有氧運動訓(xùn)練后反映機體心血管適應(yīng)能力的標志物，同時為研究機體對有氧運動訓(xùn)練適應(yīng)的分子機制提供新的思路。

1 資料與方法

1.1 一般資料 研究對象為某大學(xué)2013年9月剛?cè)雽W(xué)的非運動專業(yè)的男性新生，漢族。試驗開始前排除以前有長期有氧運動訓(xùn)練史、有生活環(huán)境而導(dǎo)致的長期耐力性活動史、有家族性心肺疾病史及近期有服用合成類固醇代謝藥物者，并無吸煙史、高血壓且已熟練掌握蛙泳技術(shù)，可以能夠進行長時間的有氧運動。共招收15名受試者參加，因試驗的周期較長(持續(xù)8周)，直至試驗結(jié)束后，實際完成人數(shù)為10名。研究對象的年齡(19.3±0.5)歲，身高(174.3±7.8)cm，體質(zhì)量(69.4±3.3)kg，在試驗期間，研究對象未患任何疾病，沒有進行其他任何大強度、大運動量的訓(xùn)練。本研究得到青島大學(xué)附屬醫(yī)院倫理委員會的批準，受試者在試驗前已得知本次研究的目的及內(nèi)容，并且是自愿參加。

1.2 方法

1.2.1 有氧運動訓(xùn)練方案 有氧訓(xùn)練方案根據(jù)劉佳[15]、高歡[16]的訓(xùn)練研究方法適當(dāng)調(diào)整進行。有氧運動持續(xù)時間為10周，其中有包括適應(yīng)性訓(xùn)練2周和8周有氧運動訓(xùn)練。研究對象首先要通過嚴格的身體機能、泳姿與游泳水平等項目的篩選，檢測合格者進入每周3次、共2周的適應(yīng)性訓(xùn)練。由本次試驗的負責(zé)人向受試者講解自我控制運動強度、心率的測量、動作劃頻等與試驗相關(guān)的問題并指導(dǎo)參與者盡快熟練掌握。研究對象要在訓(xùn)練前后的靜息狀態(tài)及隨后的急性力竭運動后立即抽取4 mL靜脈血,使用EDTA進行抗凝，將各裝取血液樣本的試管在4 ℃、2 000 g轉(zhuǎn)速下離心10 min，分離試管上層的血漿于-80 ℃的冰箱里保存?zhèn)溆?。所有參與者除了每次訓(xùn)練課必要的準備和整理活動之外，水中的有效鍛煉量為1 200 m，運動強度為60%～70%心率儲備(HRR),每次訓(xùn)練課前對研究對象進行安靜時血壓與心率的測量，以監(jiān)測研究對象機體狀態(tài)情況。研究對象除了這項運動訓(xùn)練，不再安排進行其他的運動訓(xùn)練。

1.2.2 生理學(xué)指標的測定

1.2.2.1 一般生理指標的測定 受試者身高、體質(zhì)量、動脈血壓、靜脈血壓和心率在訓(xùn)練前后各測定一次，具體標準參照中國國民體質(zhì)測量標準要求實施，兩次測試時的條件基本一致，并且由同一運動人體科學(xué)專業(yè)的研究生完成。

1.2.2.2 最大耗氧量(VO2max)和心血管功能指標的測定 有氧運動訓(xùn)練前后各進行一次急性力竭運動，同時在運動中測定研究對象VO2max及相應(yīng)的心肺功能指標，其具體方法簡要敘述如下：(1)調(diào)整跑臺(Quasar 專業(yè)級運動跑臺，德國)坡度為0，讓所有受試者空腹在跑臺上試跑5 min，以適應(yīng)跑臺的運動方式；(2)正式試驗時，采用遞增運動負荷的方式，0～1 min，跑臺坡度保持為0，速度逐漸增加至7.5 km/h，受試者由自然散步逐步變?yōu)榕懿?，保? min；(3)從第3分鐘開始，跑臺速度增至10.0 km/h，坡度仍為0，保持2 min；(4)從第5分鐘開始，跑臺速度增至12.0 km/h，此速度為適宜的極限下負荷速度，坡度還為0，保持5 min；(5)從第10分鐘開始，跑臺速度增至12.5 km/h，同時跑臺坡度增加2%；(6)從第11分鐘往后，跑臺坡度每分鐘遞增2%，并且速度每分鐘遞增0.5 km/h，直至受試者精疲力竭無法再堅持下去[17]。在此過程中分別使用氣體代謝分析系統(tǒng)(Moxus，美國)測定攝氧量絕對值(VO2)、通氣閾(VE)，使用超聲心動圖儀(ALOKA，型號：SSC-290，中日合資)測定最大心率(HRmax)、心臟最大每搏輸出量(SVmax)、心臟最大輸出量(COmax)、心臟最大射血分數(shù)(EFmax)和心臟最短射血時間(ETmin)。在急性力竭試驗中，當(dāng)連續(xù)兩次吸氧量變化在5%或在150 mL/min或2 mL·kg-1·min-1以下，呼吸商接近1.1，受試者筋疲力盡再也無法跟上跑臺速度時的VO2即定義為VO2max。

1.2.3 實時定量PCR檢測候選miRNA的表達量 選用6個候選miRNA，分別為miR-133a、miR-21、miR-146a、miR-199a、miR-15a和miR-222。每個研究對象不同時間點的血漿樣品是用血漿提取總RNA，因為血漿是保存在-80 ℃中，因此在提取前應(yīng)該首先在37 ℃的溫度下解凍，隨后采用TRIzol試劑(產(chǎn)品編號：R0016，碧云天生物技術(shù)有限公司)說明書的步驟，提取出血漿中的總RNA[18-24]。應(yīng)用紫外分光光度計測定總RNA的吸光度A260值和A280值，用A260值計算總RNA濃度，計算A260/A280值檢測提取的總RNA的純度；最后用瓊脂糖凝膠電泳進一步檢測RNA質(zhì)量。

接下來以每個樣本血漿總RNA 2 μg作為初始模板，按照說明書配制總反應(yīng)體系20 μL，應(yīng)用第一鏈cDNA合成試劑盒(60906-10型，上?？婆d生物科技有限公司)在核酸擴增儀(ABI9700型，上海智巖科學(xué)儀器有限公司)進行逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。隨后取1 μL上述合成的cDNA為模板，以U6作為內(nèi)參，每個檢測樣本做3個復(fù)孔，在實時熒光定量PCR系統(tǒng)(7900HT Fast，美國ABI公司)進行實時定量PCR，具體步驟嚴格按照說明書進行。試驗中所用引物均由美國ABI公司合成。采用2-ΔΔCT法計算樣品中miRNA的相對含量(倍數(shù))，CT代表PCR反應(yīng)檢測到的熒光強度值顯著大于背景值的循環(huán)數(shù)，ΔCt代表樣本Ct值減去同一種樣本內(nèi)參基因Ct所得的差值，ΔΔCt代表上述試驗樣本ΔCt減去對照樣本ΔCt的差值。

2 結(jié) 果

2.1 研究對象的基本情況 有氧運動訓(xùn)練前后，研究對象BMI和動脈血壓方面差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；有氧運動訓(xùn)練后研究對象安靜狀態(tài)下靜脈血壓和心率(HR)均低于訓(xùn)練前，其中靜脈血壓下降了10.4%，HR下降了11.9%，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表1 研究對象有氧運動訓(xùn)練前后的基本情況

2.2 有氧運動訓(xùn)練前后研究對象心血管功能狀況 訓(xùn)練前后研究對象VE、HRmax、COmax和ETmin差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；訓(xùn)練后研究對象VO2max、SVmax和EFmax均高于訓(xùn)練前，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。最大攝氧量的相對值訓(xùn)練前后分別為52.07±12.31、60.76±11.89，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.126)。見表2。

表2 研究對象有氧運動訓(xùn)練前后急性力竭運動過程中心肺功能指標水平

2.3 有氧運動訓(xùn)練前后研究對象循環(huán)血液中miRNA動態(tài)變化情況 有氧運動訓(xùn)練前，研究對象急性力竭運動后循環(huán)血液中miR-146a、miR-222、miR-21和miR-15a表達水平與靜息狀態(tài)相比差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，而miR-199a和miR-133a差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。在有氧運動訓(xùn)練后，研究對象靜息狀態(tài)下，循環(huán)血液中miR-146a、miR-222、miR-21、miR-15a和miR-199a表達水平均高于訓(xùn)練前(P<0.05)，同時與訓(xùn)練前急性力竭運動后水平相當(dāng)。miR-133a在訓(xùn)練前后靜息狀態(tài)下差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。有氧運動訓(xùn)練后，研究對象進行急性力竭運動發(fā)現(xiàn)循環(huán)血液中miR-146a、miR-222表達水平均顯著高于訓(xùn)練前后靜息狀態(tài)(P<0.05)；miR-21、miR-15a和miR-199a表達水平均顯著高于訓(xùn)練前靜息狀態(tài)(P<0.05)，但是與訓(xùn)練后靜息狀態(tài)比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；miR-133a與訓(xùn)練前靜息狀態(tài)比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表3。

表3 有氧運動訓(xùn)練前后研究者循環(huán)血液中miRNA水平

2.4 研究對象循環(huán)血液中miRNA與心血管功能指標的相關(guān)關(guān)系 結(jié)果發(fā)現(xiàn)，研究對象血漿中miR-146a表達量與其VO2max水平呈正相關(guān)(P<0.01)，miR-222表達改變量與EF改變量呈正相關(guān)(P<0.01)。見圖1、2。

圖1 訓(xùn)練前后循環(huán)血液中miR-146a水平與VO2max的相關(guān)關(guān)系

圖2 訓(xùn)練前后循環(huán)血液中miR-222改變量與EF改變量的相關(guān)關(guān)系

3 討 論

本研究探討了有氧運動訓(xùn)練對運動員循環(huán)血液中特異miRNAs的影響，以及關(guān)健miRNA在心血管對運動適應(yīng)過程中的調(diào)節(jié)作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)運動員循環(huán)血液中動態(tài)變化的miRNAs可以作為反映訓(xùn)練效果的標志物，miR-146a和miR-222在機體有氧運動訓(xùn)練的心血管功能適應(yīng)起著生理調(diào)節(jié)介質(zhì)的作用。

Safdar等[25]在大鼠中研究發(fā)現(xiàn)miRNAs通過基因轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)作用參與了大鼠耐力訓(xùn)練中的骨骼肌適應(yīng)。Nielsen等[26]在10名年輕健康男性中研究發(fā)現(xiàn)在12周耐力訓(xùn)練前急性運動會導(dǎo)致miR-133a和miR-1表達增加，但是12周耐力訓(xùn)練后研究者再進行急性運動，上述肌肉特異性miRNAs并沒有發(fā)生變化。Davidsen等[8]發(fā)現(xiàn)抗阻訓(xùn)練會導(dǎo)致特異miRNAs在肌肉組織中富集從而使肌肉組織增生肥大。然而迄今為止，在有氧運動訓(xùn)練中探討運動員循環(huán)血液中的miRNAs的調(diào)節(jié)作用和功能的研究很少。本研究發(fā)現(xiàn)運動會導(dǎo)致機體循環(huán)血液中miRNAs表達量發(fā)生變化，并且這種變化不僅與單次急性力竭運動有關(guān)，還和長期有氧運動訓(xùn)練有關(guān)聯(lián)。

本研究中選擇心肌和骨骼肌收縮相關(guān)的miR-133a和miR-21，細胞缺氧適應(yīng)相關(guān)的miR-146a和miR-15a，血管生成相關(guān)的miR-199a和miR-222作為候選分析miRNAs，并且檢測了它們在循環(huán)血液中的表達量。miR-133a表達量均較低，為低表達水平miRNAs；miR-15a、miR-146a和miR-222表達量均較高，為中等表達水平miRNAs；miR-21、miR-199a表達量最高，為高表達水平miRNAs。這與Mitchell等[27]在健康非運動員人群中檢測到的范圍是一致的，同時與Fichtlscherer等[28]在冠心病隊列人群中檢測的范圍也在人群正常變異范圍內(nèi)一致。這就保證了筆者檢測方法的正確性，為接下來分析不同時間點下相關(guān)miRNAs的動態(tài)變化打下了基礎(chǔ)，雖然可能具有種族差異，但是僅在本研究數(shù)據(jù)反映來看，是非常一致的，這只是從一個側(cè)面上支持與反映筆者本次的研究檢測是正確的。研究中發(fā)現(xiàn)急性力竭運動使運動員循環(huán)血液中miR-146a和miR-222表達量顯著增加，這可能是因為急性力竭運動使機體骨骼肌和心肌細胞缺氧產(chǎn)生應(yīng)激，從而誘導(dǎo)機體骨骼肌或心肌細胞產(chǎn)生大量miR-146a，miR-146a可以通過結(jié)合到靶基因腫瘤壞死因子受體相關(guān)蛋白6(TRAF6)和白細胞介素-1受體相關(guān)激酶1(IRAK1)上抑制相關(guān)炎性蛋白的表達，從而發(fā)揮抗細胞缺氧造成的炎性反應(yīng)[24]；同時,會降低細胞周期調(diào)節(jié)蛋白基因的表達,從而在促進機體血管生成中發(fā)揮重要作用[29]。本研究還發(fā)現(xiàn)，研究對象血漿中miR-146a表達量與其VO2max水平顯著正相關(guān)，這可能是因為受試者循環(huán)血液中miR-146a水平越高者更容易耐受運動造成細胞缺氧，同時促進機體產(chǎn)生適應(yīng)性變化更大程度的攜帶氧。訓(xùn)練前后血漿中miR-222表達改變量與EF改變量顯著正相關(guān)，這可能是因為miR-222在機體內(nèi)起著促進血管增生的作用[29]。有氧運動訓(xùn)練后miR-222產(chǎn)生越多者，其越能促進心肌組織中血管增生，從而使心肌細胞獲得足夠的氧氣和能量，這樣心肌細胞在運動中收縮得更有力，因此EF也就越大。

通過檢測有氧運動訓(xùn)練前后運動員靜息和急性力竭狀態(tài)下循環(huán)血液中miRNAs表達水平，筆者發(fā)現(xiàn)：運動員循環(huán)血液中miRNAs在生理應(yīng)激和運動適應(yīng)過程中呈現(xiàn)不同的表達水平。因此，運動員循環(huán)血液中動態(tài)變化的miRNAs可以作為反映運動適應(yīng)和應(yīng)激的標志物。miR-146a和miR-222在機體有氧運動訓(xùn)練的心血管功能適應(yīng)起著生理調(diào)節(jié)介質(zhì)的作用。這項研究結(jié)果為使運動員的心血管系統(tǒng)更好地適應(yīng)高強度有氧運動訓(xùn)練及保護運動員免受急性運動損傷提供了新的思路和方向。

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Dynamic change of microRNA-146a and 222 in blood circulation before and after aerobic exercise and its regulation role to cardiovascular function

QuZhenlin1,LiMeng2,LiuKai3

(1.DepartmentofBasicEducation,ShandongForeignTradeVocationalCollege,Qingdao,Shandong266100,China; 2.DepartmentofCardiology,theEighthPeople′sHospitalofQingdaoCity,Qingdao,Shandong266000,China; 3.SportsMedicineandRehabilitationCenter,QingdaoMunicipalHospital,Qingdao,Shandong266000,China)

Objective To explore the effects of aerobic exercise training on the circulating miRNAs and their roles in cardiovascular adaption induced by aerobic exercise training.Methods Ten freshmen were enrolled.All subjects performed an 8 weeks swimming training.VO2maxand cardiovascular function were measured in acute exhaustive before and after the aerobic endurance training.The key circulating miRNs (miR-133a,miR-21,miR-146a,miR-199a,miR-15a and miR-222) were measured at rest and immediately following acute exhaustive exercise in competitive male freshmen before and after the aerobic training.Results Distinct patterns of c-miRNA response to exercise were observed and adhere to 4 major profiles:after aerobic exercise training,the levels of miR-146a,miR-222,miR-21,miR-15a and miR-199a at rest were significant higer than before training(P<0.05).The levels of miR-146a and miR-222 were up-regulated by acute exercise before and after aerobic exercise training(P<0.05).Before the aerobic training,acute exhaustive exercise increased miR-21 and miR-15a significantly(P<0.05),however,there was no difference between the miR-21 and miR-15a levels in acute exhaustive exercise and resting state after aerobic exercise training (P>0.05).There was no difference in the level of miR-133a between resting state and acute exhaustive exercise before and after training (P>0.05).Further linear correlation analysis showed that the miR-146a expression in plasma was significantly positively correlated with VO2maxlevel (r=0.842,P<0.01),the change of miR-222 expression in plasma before and after training was significantly positively correlated with EF (r=0.920,P<0.01).Conclusion MiRNAs can be used as a marker to reflect the effect of training,miR-146a and miR-222 play a role in physiological regulation of the cardiovascular function of aerobic exercise training in the body.

aerobic exercise;cardiovascular;microRNAs

曲振琳(1977-)，講師，碩士，主要從事體育教學(xué)與訓(xùn)練研究。

??·臨床研究

10.3969/j.issn.1671-8348.2016.36.013

R

A

1671-8348(2016)36-5081-04

2016-07-18

2016-10-16)