三脈紫菀有效組分配比的平喘作用及其毒性研究

康林之，朱建成，任 剛，羅 云，張 婧，劉榮華，楊 明，王 芳，何小汝，趙海平△

(江西中醫(yī)藥大學(xué):1.護(hù)理學(xué)院;2.藥學(xué)院;3.現(xiàn)代中藥制劑教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南昌 330004)

三脈紫菀有效組分配比的平喘作用及其毒性研究

目的 研究三脈紫菀抗慢支組分平喘作用的最佳配比及其毒性。方法 合格豚鼠72只，體質(zhì)量(300±20)g，雄性，分為空白組、氨茶堿組(0.047 g/kg)、三脈紫菀總皂苷與總黃酮不同配比組(8∶1、4∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶4、1∶8，0.38 g/kg)。各組連續(xù)灌胃給藥3 d，每天1次，采用His-Ach霧化引喘法通過誘咳引喘儀優(yōu)選最佳配比；制備豚鼠離體氣管環(huán)標(biāo)本，采用Powerlab生物信號(hào)采集系統(tǒng)，考察豚鼠平滑肌條在正?？耸弦簵l件下加入氯化乙酰膽堿(Ach)后的收縮變化，以及其他組分別在Ach致平滑肌收縮最明顯時(shí)，加入氨茶堿(1.25 mg/mL)后的平滑肌舒張百分率。采用經(jīng)典的小鼠急性毒性實(shí)驗(yàn)方法，考察三脈紫菀總皂苷、總黃酮及其1∶2配比的急性毒性。結(jié)果 較之空白組，氨茶堿組、其他各給藥組的致喘潛伏期延長顯著(P<0.05)，其中1∶1、1∶2、1∶4組與其他配比組均有顯著差異(P<0.05)，但又以1∶2組引喘潛伏期最長。氨茶堿組與各配比組均能明顯松弛Ach導(dǎo)致收縮的豚鼠氣管平滑肌，其中氨茶堿組舒張百分率最大(24.12±1.20)%，各配比組舒張百分率不及氨茶堿組(P<0.05)，但以1∶2組與之最接近。三脈紫菀總皂苷、總黃酮及其1∶2配比對(duì)小鼠的最大耐受量分別為300、345、325 g/kg。結(jié)論 在給藥總量恒定的情況下，三脈紫菀總皂苷與總黃酮1∶2平喘解痙作用明顯，其總黃酮、總皂苷及1∶2配比的急性毒性實(shí)驗(yàn)未顯示明顯的毒性作用，安全性相對(duì)良好。

三脈紫菀；皂苷類；黃酮類；平喘；急性毒性

一味中藥就是由其自身有效組分構(gòu)成的“小復(fù)方”，其臨床效應(yīng)是“復(fù)方”體系對(duì)病變黑箱(患者)產(chǎn)生的總體效應(yīng)，而組分構(gòu)成比例變化是藥物總體效應(yīng)強(qiáng)弱的關(guān)鍵。三脈紫菀(Aster ageratoides Turcz．)為菊科(Compositae)紫菀屬植物的干燥全草或根。曾在1971年被定為全國18種防治慢性氣管炎有效藥物之一[1-6]。據(jù)報(bào)道其地上部分主含黃酮苷，根部主含皂苷，此外還含有萜類、甾類等成分。其中黃酮類成分、皂苷類成分是其抗慢支的主要藥效物質(zhì)基礎(chǔ)[7-8]。本課題組前期從祛痰止咳角度開展了其有效組分的最佳配比研究[9]，基于此，本研究擬進(jìn)一步采用豚鼠探討三脈紫菀有效組分平喘的最佳配比，并初步考察其相應(yīng)的安全性，以期為其抗慢支機(jī)制及創(chuàng)制新藥制提供有力支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藥品 實(shí)驗(yàn)用三脈紫菀采集于南昌市近郊，經(jīng)江西中醫(yī)藥大學(xué)中藥資源與民族藥研究中心鑒定為三脈紫菀。

1.1.2 試劑 氨茶堿片(太原市振興制藥有限責(zé)任公司，批號(hào)20111206)；氯化乙酰膽堿(Ach)與磷酸組胺(His,上?？笊锛夹g(shù)有限公司，批號(hào)2012116與2012116)。改良Krebs液[10]：NaCl 7.5 g，CaCl20.24 g，MgCl20.05 g，KCl 0.35 g，NaHCO31.15 g，NaH2PO40.1 g，葡萄糖1.0 g配于1 000 mL蒸餾水。實(shí)驗(yàn)前用5% O2和CO2混合氣體飽和。其他試劑均為化學(xué)純。

1.1.3 儀器 YLS-8A多功能誘咳引喘儀(濟(jì)南益延科技發(fā)展有限公司)；AUTOMATIC ORGAN BATH(Panlab)；Powerlab生物系號(hào)采集系統(tǒng)(ML141 sptrometer，ML132 Bto Amp)。

1.1.4 動(dòng)物 KM種小鼠[清潔級(jí)，江西中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物中心，SCXK(贛)，2011-0001]；豚鼠[普通級(jí)，上海生旺實(shí)驗(yàn)動(dòng)物養(yǎng)殖有限公司，SCXK(滬)，2012-0007]。

1.2 方法

1.2.1 藥品制備 參照前期三脈紫菀制備工藝[7,11-12]?？傇碥詹课恢苽洌喝「?00 g，經(jīng)70%、95%乙醇浸提，大孔吸附樹脂處理濾液，濃縮干燥，得浸膏3.99%。總黃酮部位制備：取莖葉500 g，經(jīng)70%、95%乙醇浸提，大孔吸附樹脂處理濾液，濃縮干燥，得浸膏1.477%。保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 劑量設(shè)定 參照前期劑量設(shè)計(jì)方法[13-14]，確定總皂苷、總黃酮部位的總量，參照藥典及其他文獻(xiàn)等資料設(shè)定兩類成分的配比。其中，按一定梯度一類成分遞減的同時(shí)，另一類成分遞增，反之亦然。配比如下(質(zhì)量比)：總皂苷與總黃酮以8∶1、4∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶4、1∶8。

1.2.3 平喘實(shí)驗(yàn)研究

1.2.3.1 豚鼠篩選實(shí)驗(yàn) 72只雄性豚鼠體，質(zhì)量(300±20)g，接通多功能誘咳引喘儀后，分別對(duì)每只豚鼠進(jìn)行篩選，將配制好的引喘液(2.0×10-2g/mL Ach和1.0×10-3g/mL His等體積混合液)噴入儀器7 s，每只豚鼠的引喘潛伏期一般小于150 s，如大于150 s者，不予選用組內(nèi)。豚鼠因吸入引喘液出現(xiàn)痙攣抽搐，立刻打開儀器取出，必要時(shí)人工輔助呼吸，避免窒息死亡[15]。

1.2.3.2 對(duì)豚鼠的平喘實(shí)驗(yàn) 將篩選出的72只豚鼠分為9組，每組8只。灌胃給藥，每只0.2 mL/10 g，每天1次，共3 d。氨茶堿組豚鼠灌胃氨茶堿0.047 g/kg，空白組豚鼠灌胃等量的生理鹽水，各給藥組按設(shè)定劑量給藥。第3次給藥1 h后，將豚鼠放入儀器內(nèi)，噴7 s引喘液，觀察記錄其出現(xiàn)哮喘性痙攣抽搐的潛伏期(即引喘潛伏期)。如2 min內(nèi)未出現(xiàn)喘息，視其潛伏期為120 s[15]。

1.2.4 對(duì)豚鼠離體氣管平滑肌的舒張實(shí)驗(yàn) 用木棒擊豚鼠后腦致昏后，在頸部腹面正中切開皮膚及皮下組織，分離氣管，剪下甲狀軟骨下至氣管分叉處的部分，長約20 mm，制備平滑肌環(huán)，固定于離體氣管儀器內(nèi)，基值調(diào)整3 g，置換Kerb液1次/20 min，穩(wěn)定約1 h，曲線穩(wěn)定后，對(duì)9個(gè)組別分別開始實(shí)驗(yàn)。對(duì)Ach組，于氣管條平衡穩(wěn)定后，加入5×10-4g/mL Ach 0.4 mL，并記錄數(shù)據(jù)。其他8組分別于Ach致收縮曲線上升至最明顯時(shí)，加入氨茶堿(1.25×10-3g/mL)及各組的配比藥液(0.02 g/mL)0.4 mL。觀察并記錄實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，計(jì)算舒張百分率。舒張百分率=(給藥前曲線最大值-給藥后曲線最小值)/ 給藥前曲線最大值×100%[10,15]。

1.2.5 急性毒性實(shí)驗(yàn)研究

1.2.5.1 預(yù)實(shí)驗(yàn) 健康KM小鼠36只，體質(zhì)量(20±2)g，雌雄各半，分成9組，每組4只。即總皂苷高、中、低組，總黃酮高、中、低組，總皂苷與總黃酮1∶2配比高、中、低組，實(shí)驗(yàn)前12 h禁食不禁水。將總皂苷、總黃酮及其1∶2配比分別配制成最大濃度(0.75、0.86、0.81 g/mL)，且等比(1∶0.85)稀釋，得到其他劑量。各組按最大體積0.4 mL/10 g容量，一次性灌胃，連續(xù)觀察7 d，記錄期間小鼠死亡數(shù)和一般情況[16-17]。結(jié)果表明，各組小鼠精神與活動(dòng)狀態(tài)良好，無死亡。提示各組藥物的急性毒性較小，無法測(cè)得其半數(shù)致死量(LD50)，故改為測(cè)定各組藥物的小鼠最大耐受量(Maximum tolerated dose，MTD) 。

1.2.5.2 MTD實(shí)驗(yàn) 健康KM小鼠80只，雌雄各半，體質(zhì)量(20±2)g，分為4組，每組20只，即：空白組、總皂苷組(0.75 g/mL)、總黃酮(0.86 g/mL)、總皂苷與總黃酮1∶2配比組(0.81 g/mL)，實(shí)驗(yàn)前12 h禁食不禁水。各組給藥1次，0.4 mL/10 g，空白組給予等體積蒸餾水。給藥后連續(xù)觀察14 d[10,16-17]，期間詳細(xì)觀察記錄實(shí)驗(yàn)動(dòng)物每天的反應(yīng)及體質(zhì)量變化、攝食量變化、中毒反應(yīng)及死亡情況等。觀察期結(jié)束后，處死小鼠進(jìn)行尸體解剖檢查。

2 結(jié) 果

2.1 豚鼠的平喘實(shí)驗(yàn) 與空白組比較，氨茶堿組與其他各給藥組的引喘潛伏期延長顯著(P<0.05)；其中1∶1、1∶2、1∶4組與其他配比組均有顯著差異(P<0.05)，但又以1∶2組引喘潛伏期最長。見表1。

表1 各組對(duì)豚鼠的平喘作用

*:P<0.05,#:P<0.01,與空白組比較;△:P<0.05，與其他各給藥比較；-：此項(xiàng)無數(shù)據(jù)。

2.2 豚鼠離體氣管平滑肌舒張作用的實(shí)驗(yàn) 氨茶堿組與各配比組均能明顯松弛Ach導(dǎo)致收縮的平滑肌。其中，氨茶堿組舒張百分率最大，各配比組舒張百分率不及氨茶堿組(P<0.05)，但尤以1∶2組作用明顯。見表2。

2.3 急性毒性實(shí)驗(yàn) 本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，總皂苷、總黃酮及其1∶2配比對(duì)小鼠單次灌胃給藥的MTD分別為300、345、325g/kg。觀察期間，各給藥組灌胃后2h內(nèi)個(gè)別動(dòng)物出現(xiàn)自主活動(dòng)減少、反應(yīng)遲鈍，其余未見異常現(xiàn)象；給藥后第2天起，所有動(dòng)物飲食正常，精神狀態(tài)良好，皮毛光澤、活動(dòng)靈活積極，體質(zhì)量正常增長；繼續(xù)觀察14d后無動(dòng)物死亡。處死并解剖各組小鼠，未見心、肝、脾、肺、腎等主要臟器出現(xiàn)異常。

表2 各組對(duì)豚鼠離體氣管平滑肌的影響

*：P<0.05，#：P<0.01，與氨茶堿組比較。

3 討 論

中藥有效組分配伍是目前中藥配伍的新興模式之一，而厘清各有效組分配伍間的協(xié)同、拮抗等機(jī)制，則是優(yōu)選科學(xué)配比的關(guān)鍵一環(huán)[1-6]。毒性研究是反映藥物對(duì)機(jī)體安全性的初始資料[17]，在其綜合的安全性評(píng)價(jià)體系中具有極其重要的地位和作用。

本研究數(shù)據(jù)顯示，在確定三脈紫菀總皂苷、總黃酮部位總量的情況下，各配比組可使豚鼠的引喘潛伏期延長顯著(P<0.05)，且平喘作用隨總黃酮比例增加而增強(qiáng)，1∶1、1∶2、1∶4組與其他配比組差異顯著(P<0.05)，但又以1∶2組引喘潛伏期最長。表明各配比組的平喘作用與總皂苷和總黃酮的配比密切相關(guān)，且存有協(xié)同增效的可能。豚鼠氣管平滑肌分布的受體主要有H1、M和β2等，其中興奮H1、M受體可發(fā)生收縮，興奮β2受體可發(fā)生舒張。Ach致氣管平滑肌收縮模型，是由Ach作用于M受體，使鈣通道(ROC)和VDC開啟，發(fā)生鈣內(nèi)流，并水解細(xì)胞膜上磷酸肌醇，生成二酯基甘油(DAG)與肌醇三磷酸(IP3)，使內(nèi)鈣釋放，氣管平滑肌收縮[18-19]。研究結(jié)果顯示氨茶堿組與各配比組均能明顯松弛Ach導(dǎo)致收縮的平滑肌，氨茶堿組舒張百分率最大(24.12±1.20)%，其中雖各配比組不及氨茶堿組(P<0.05)，但尤以1∶2組舒張作用明顯，而抑制Ca2+內(nèi)流可能是其主要機(jī)制。三脈紫菀總皂苷、總黃酮及其1∶2配比的急性毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，各組藥物對(duì)小鼠單次灌胃給藥的MTD分別為300、345、325g/kg(分別相當(dāng)于成人用量25、28.75、27.08g/kg)，各組動(dòng)物活動(dòng)飲食正常，觀察結(jié)束后無死亡，主要臟器肉眼觀亦未見異常。提示各組藥物對(duì)小鼠幾乎無急性毒性損害。

目前，國內(nèi)外均有文獻(xiàn)報(bào)道[20-21]，黃酮及皂苷類物質(zhì)具有多種生物活性及藥理作用。三脈紫菀作為抗慢支的有效藥物之一，加強(qiáng)其有效組分配比的優(yōu)化研究，可為今后的開發(fā)利用提供數(shù)據(jù)支撐。然而，也有報(bào)道稱[22-23]，諸如沙青子總黃酮、盾葉薯蕷皂苷及七葉皂苷等組分對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有毒性作用?？梢?，對(duì)于不同來源的黃酮或皂苷類物質(zhì)，其安全性不能一概而論。所以，今后也有待于結(jié)合組分間相互作用、體內(nèi)轉(zhuǎn)化代謝及長毒觀察等方面深入探討。

[1]張會(huì)宗,孟莉,劉晶,等.中藥細(xì)辛自身活性組分配比優(yōu)化研究[J].世界中西醫(yī)結(jié)合雜志,2011,6(11):944-946,967．

[2]肖紅斌,劉艷秋,王莉,等.基于成分相互作用的中藥復(fù)方組分配伍研究[J].世界科學(xué)技術(shù)-中醫(yī)藥現(xiàn)代化,2011,13(2):240-243．

[3]高會(huì)麗,于成瑤,李連達(dá).中藥復(fù)方配伍規(guī)律研究概況[J].中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志,2006,12(9):60-63．

[4]張伯禮,王永炎,商洪才.組分配伍研制現(xiàn)代中藥的理論和方法[J].繼續(xù)醫(yī)學(xué)教育,2006,20(19):89-91．

[5]陳建萍,吳偉康,張敏生,等．中藥復(fù)方配伍規(guī)律研究的思路與方法[J].中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志,2000,6(1):1-4．

[6]苗明三,馬霄,王燦．中藥有效組分配伍研究的探討[J].中藥新藥與臨床藥理,2009,20(5)：487-490．

[7]何小汝.三脈紫菀總黃酮、總皂苷制備工藝及其化痰止咳功效研究[D].南昌：江西農(nóng)業(yè)大學(xué),2012.

[8]劉可越,趙昱波.紫菀屬植物化學(xué)成分與生物活性研究進(jìn)展[J].現(xiàn)代藥物與臨床,2009,24(5):276-278.

[9]趙海平,康林之,任剛,等.基于紅管藥祛痰止咳有效組分的最佳配比研究[J].中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志,2013,19(3):163-166.

[10]陳奇.中藥藥理研究方法學(xué)[M].2版.北京:人民衛(wèi)生出版社,2006:323．

[11]劉愛紅,袁金斌,劉榮華,等.三脈紫菀總皂苷的提取工藝研究[J].江西中醫(yī)藥,2013(12):55-57.

[12]周志望,黃慧蓮,邵峰,等.三脈紫菀總黃酮的提取純化工藝優(yōu)選[J].中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志,2012,18(18):7-10.

[13]靳康,闞紅衛(wèi),石靜麗,等．雙丹組分對(duì)大鼠離體血管和急性心肌缺血再灌注損傷的影響[J].中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志,2010,16(17):197-201．

[14]楊金果,李珩,李運(yùn)倫.中藥有效組分配伍的研究進(jìn)展[J].上海中醫(yī)藥雜志,2012,46(3):89-92．

[15]李文宏,徐國良,王躍生,等.麻杏石甘湯平喘量-效關(guān)系研究[J].中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志,2014,20(9):171-174．

[16]李津,覃永長,李桂勇,等．薏苡莖、葉提取物的急性毒性[J]．中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志,2015,21(5):178-181．

[17]周立國.藥物毒理學(xué)[M].北京：中國醫(yī)藥科技出版社,2003:146-162.

[18]周欽海,朱美華,朱敏敏,等.不同濃度的咪唑安定對(duì)兔離體氣管平滑肌收縮的影響[J].臨床麻醉學(xué)雜志,2007,23(8):670-672.

[19]屈會(huì)化,趙琰,張晗睿,等.加味三拗湯對(duì)離體豚鼠氣管平滑肌的解痙作用[J].北京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào),2008,31(4):251-253.

[20]田永利,許志宇,葛林,等.總黃酮類化合物含量測(cè)定方法和藥理作用研究進(jìn)展[J].河北醫(yī)藥,2010,32(15):2094-2096.

[21]馬生堂,寇俊萍,余伯陽．植物中皂苷類成分的毒性研究近況[J]．藥學(xué)進(jìn)展,2012,36(3):110-115．

[22]陳慧,寧明剛,劉宇,等．沙冬青種子總黃酮對(duì)小鼠急性毒性作用研究[J]．甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2013,48(3):14-18．

[23]QinY,WuX,HuangW,etal.Acutetoxicityandsub-chronictoxicityofsteroidalsaponinsfromDioscoreazingiberensisC.H.Wrightinrodents[J].JEthnopharmacol,2009,126(3):543-550.

Study on the effective compositions of Aster ageratoides Turcz for relieving asthma and its toxicity*

KangLinzhi1,Zhujiancheng2,RenGang3,LuoYun3,ZhangJing3,LiuRonghua2,YangMing3,WangFang2,HeXiaoru3,ZhaoHaiping2△

(1.SchoolofNursing;2.CollegeofPharmacy;3.KeyLaboratoryofModernPreparationofTCM,MinistryofEducation,JiangxiUniversityofTraditionalChineseMedicine,Nanchang，Jiangxi330004,China)

Objective To study the effective composition of Aster ageratoides Turcz for relieving asthma and its toxicity.Methods Seventy-two qualified male guinea pigs,body mass(300±20)g,were randomly divided into the control group,aminophylline group(0.047 g/kg) and different ratio group of total saponins and total flavonoids(8∶1,4∶1,2∶1,1∶1,1∶2,1∶4,1∶8).Every group received at dose of 0.38 g/kg once a day for 3 days by intragastric administration.The effect of relieving asthma was taken as the indicators for the optimization of compositions,which was detected by observing the latent period of asthma induced by acetylcholine-histamine in guinea rats.The relaxation percentage of smooth muscle retracted by acetylcholine was detected by Powerlab biological signal collecting system when aminophylline(1.25 mg/mL) and different matching drugs(0.02 g/mL) were added in Krebs′ solution.The acute toxicities of total saponins,total flavonoids and mixture of total saponins with total flavonoids(ratio of 1∶2) were detected by classical acute toxicity test of mice.Results Compared with the control group,aminophylline group,each group latent period of inducing asthma significantly or very significantly prolonged (P<0.05),among them,1∶1,1∶2,1∶4 group and other matching group were significantly different(P<0.05),but 1∶2 group cited the longest incubation period.Aminophylline group and the ratio could significantly relaxe guinea pig tracheal smooth muscle retracted by acetylcholine.Aminophylline group diastolic percentage was the largest(24.12±1.20)%,all the groups were less than the percentage of diastolic aminophylline group(P<0.05),but in 1∶2 group with the closest.Aster ageratoides Turcz,tatarian aster total saponins,total flavonoids and the ratio of 1∶2 to mice maximum tolerance was respectively 300,345,325 g/kg.Conclusion For the same total dosage,the relieving asthma effects of proportions of 1∶2 Aster ageratoides Turcz were obvious.There are no abnormal changes in the acute toxicity trila with total flavonoids,total saponins，as well as the ratio of 1∶2,safety is relatively good.

Aster ageratoides Turcz;saponins;flavone;antiasthma；acute toxicity

??·基礎(chǔ)研究

10.3969/j.issn.1671-8348.2016.36.005

十一五重大新藥創(chuàng)制資助項(xiàng)目(2009ZX09310-005);江西省科技廳資助項(xiàng)目(20111BBG70005-4);江西中醫(yī)藥大學(xué)?；鹳Y助項(xiàng)目(Y027)。 作者簡介：康林之(1979-)，講師,碩士，主要從事中西醫(yī)結(jié)合的臨床研究。△

康林之1，朱建成2，任 剛3，羅 云3，張 婧3，劉榮華2，楊 明3，王 芳2，何小汝3，趙海平2△

(江西中醫(yī)藥大學(xué):1.護(hù)理學(xué)院;2.藥學(xué)院;3.現(xiàn)代中藥制劑教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南昌 330004)

TQ461

A

1671-8348(2016)36-5056-03

2016-07-18

2016-09-26)