C-myc基因調(diào)控COPD大鼠氣道重塑及苗藥對其干預(yù)的研究

徐丹 徐新毅 葛正行 劉友琴

﹙1貴陽中醫(yī)學(xué)院，貴州 貴陽 550002﹔2貴陽中醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院呼吸科，貴州 貴陽 550003﹔3貴州省人民政府機(jī)關(guān)門診部，貴州 貴陽 550004﹚

C-myc基因調(diào)控COPD大鼠氣道重塑及苗藥對其干預(yù)的研究

徐丹1徐新毅2△葛正行2劉友琴3

﹙1貴陽中醫(yī)學(xué)院，貴州 貴陽 550002﹔2貴陽中醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院呼吸科，貴州 貴陽 550003﹔3貴州省人民政府機(jī)關(guān)門診部，貴州 貴陽 550004﹚

目的 觀察慢性阻塞性肺疾病(COPD)大鼠氣道重塑模型中原癌(C-myc)基因mRNA及蛋白的表達(dá)情況，探討C-myc基因與氣道重塑的關(guān)系及苗藥對COPD大鼠氣道重塑的干預(yù)。方法 90只雄性wistar大鼠隨機(jī)分為正常組、COPD模型組、苗藥組方干預(yù)組各30只。COPD大鼠氣道重塑的模型制作采用熏煙法，并每月2次在氣管內(nèi)注射脂多糖的方法建立；苗藥組方干預(yù)組大鼠于造模成功后給予灌胃治療。處死大鼠后，分別運(yùn)用實(shí)時(shí)熒光定量法﹙RT-qPCR﹚、免疫組化法檢測各組大鼠氣道及肺組織中原癌基因mRNA及蛋白的表達(dá)情況。結(jié)果 與正常組相比較，COPD模型組與苗藥組方干預(yù)組氣道及肺組織中原癌基因mRNA含量及蛋白陽性表達(dá)率明顯增高﹙P<0.05﹚；與COPD模型組相比，苗藥組方干預(yù)組原癌基因mRNA及蛋白陽性表達(dá)率明顯降低(P<0.05)。結(jié)論 COPD大鼠氣道重塑這一病理變化可能受C-myc基因的調(diào)控；苗藥對COPD大鼠氣道重塑模型的建立有一定程度的干預(yù)，苗藥組方的應(yīng)用可在一定程度上抑制C-myc基因和蛋白的表達(dá)。

C-myc； 慢性阻塞性肺疾病； 氣道重塑； 苗藥

慢性阻塞性肺疾病(COPD)是一種以氣道重塑、肺實(shí)質(zhì)和肺血管的慢性炎癥為主要病理變化的疾病。目前認(rèn)為主要參與氣道重塑的細(xì)胞有成纖維細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞。煙霧及有毒顆粒的吸入可引發(fā)炎癥并直接導(dǎo)致氣道及肺組織的損傷，其主要原因可能與某些基因及細(xì)胞因子的異常表達(dá)有關(guān)。相關(guān)研究表明，原癌基因(C-myc)在成纖維細(xì)胞增殖中呈過度表達(dá)，顯示成纖維細(xì)胞中C-myc受到激活，它可能參與了成纖維細(xì)胞的分化、增殖和表型轉(zhuǎn)化[1-2]。因此，我們采用兩種不同的實(shí)驗(yàn)方法，通過觀察大鼠氣道及肺組織中C-myc mRNA及蛋白的表達(dá)情況，探討COPD氣道重塑的發(fā)病機(jī)制及有效的治療方法。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物分組及處理

健康雄性wistar大鼠90只，由重慶滕鑫生物技術(shù)有限公司提供，SPF級(jí)，動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK(渝)2012-0006；鼠齡8～9周，體質(zhì)量(200±10)g，隨機(jī)分為正常組、COPD模型組及苗藥組方干預(yù)組各30只。

1.2 儀器及試藥

一抗兔抗大鼠抗體(美國Santa Cruz生物有限公司提供)；免疫組化試劑盒(PV-9001)(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司提供)；Star ScriptⅡFirst-strand cdna Synthesis kit合成試劑盒(北京康潤誠業(yè)生物有限公司提供)。主要儀器：ABI7500實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀。

1.3 COPD大鼠模型制備及給藥

COPD組、苗藥組方干預(yù)組采用市面出售的帝豪牌過濾嘴香煙，按文獻(xiàn)[3]方法復(fù)制COPD大鼠氣道重塑模型：大鼠分置于60 cm×45 cm×50 cm自制的有機(jī)玻璃箱，箱頂部有4個(gè)2 cm大小的通氣孔，每個(gè)煙熏箱內(nèi)一次放置10只大鼠，每日2次，每次共20只香煙，時(shí)間持續(xù)30 min,連續(xù)28 d，第1天和第14天在氣管內(nèi)注射脂多糖，每次200 μg/200 μL,注射脂多糖當(dāng)天不熏煙。正常組注入相同體積的0.9﹪氯化鈉溶液。苗藥組方干預(yù)組大鼠從造模成功后第2天起苗藥灌胃(每只大鼠給予枇杷葉、紫金牛、巖白菜、鼠曲草、鐵掃帚各9 g的劑量煎湯，含生藥50 g/100 mL, 每天2次，每次2 mL，連續(xù)灌胃，療程為30 d)，30 d后處死大鼠。

1.4 支氣管及肺組織C-myc蛋白免疫組化檢測

造模成功后的90例標(biāo)本均經(jīng)4﹪多聚甲醛固定，石蠟包埋、切片，選用鏈霉親和素過氧化酶(SP)法進(jìn)行。石蠟切片脫水，微波加熱法修復(fù)抗原，封閉非特異性抗原后加一抗，次日加二抗加辣根過氧化酶工作液，DAB雙氧水顯色，蒸餾水洗滌，蘇木素復(fù)染，中性樹脂封片。每組切片任選1張用pbs液代替一抗作陰性對照，采用已知陽性切片作為陽性對照，檢測C-myc蛋白的表達(dá) 。其一抗稀釋比例為1︰100(美國Santa Cruz公司)。免疫組化結(jié)果判定：DAB顯色強(qiáng)度分為陰性、弱陽性、陽性、強(qiáng)陽性，分別記為0、1、2、3分。陽性細(xì)胞比例評(píng)分:每例標(biāo)本各取4張切片,于光鏡下每張切片隨機(jī)選取5個(gè)高倍視野，至少計(jì)數(shù)500個(gè)細(xì)胞，算出陽性細(xì)胞比例。計(jì)分：陽性細(xì)胞比例0%～1%為0分,2%～ 10%為1分，11%～50%為2分,51%～80%為3分，81%～100%為4分。陽性染色細(xì)胞數(shù)占總細(xì)胞數(shù)的百分比與染色強(qiáng)度得分相乘，<2分為陰性(-); 2～3分為弱陽性(+);4～5分為中度陽性(++);≥6分為強(qiáng)陽性(+++)。

1.5 支氣管及肺組織中C-myc基因含量的測定

開胸后取大鼠的氣道及右下葉肺組織，將其分成小于100 mg的小塊，置于有組織保存液的1.5 mL離心管中備用。正式實(shí)驗(yàn)后，把組織移入裝有1 mL Trizol 的新的EP管中，并用組織勻漿器充分對組織進(jìn)行勻漿，室溫靜置5 min, 并于4 ℃ 12 000轉(zhuǎn)離心15 min, 離心后吸取上層無色透明的液體置于一個(gè)新的1.5 mL的EP管中，加入氯仿200 μL，劇烈震蕩15 s,室溫放置15 min。12 000轉(zhuǎn)離心15 min,小心吸取上層的液體置于一個(gè)新EP管中，加入等體積異丙醇，顛倒混合均勻，室溫靜置10 min ,看到白色沉淀在EP管底，4 ℃ 12 000轉(zhuǎn)離心1 min，棄上清，用1 mL 75%乙醇洗滌1次，棄乙醇，在超凈臺(tái)上晾干，測其濃度并加入適量DEPC水。根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒的要求，將所有試劑在冰上解凍后，配置反應(yīng)體系，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。其引物由上海生工生物工程服務(wù)有限公司合成，C-myc基因:上游：5′-TGTCCGTTCAAGCAGATGAG-3′，下游：5′-TCACTTCCGGTCAGTTTAGTC-3′，引物長度245bp；GAPDH:上游:5′-ACAGCAACAGGGTGGTGGAC -3′，下游:5′-TTTGAGGGTGCAGCGAACTT-3′，引物長度37bp 。熒光定量PCR擴(kuò)增體系為50 μL ，擴(kuò)增條件：95 ℃預(yù)變性10 min ，95 ℃變性15 s,60 ℃退火15 s,72 ℃延伸35 s，共40個(gè)循環(huán)。用2-△△CT法計(jì)算目的基因錄水平的差異。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié) 果

C-myc蛋白的陽性表達(dá)位于細(xì)胞質(zhì)，呈棕黃色顆粒狀改變，在支氣管和肺上皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞均有部分表達(dá),其中強(qiáng)烈表達(dá)于成纖維細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞。與正常組相比較，COPD模型組與苗藥組方干預(yù)組氣道及肺組織中原癌基因mRNA含量及蛋白陽性表達(dá)率明顯增高(P<0.05)；與COPD模型組相比，苗藥組方干預(yù)組原癌基因mRNA及蛋白陽性表達(dá)率明顯降低(P<0.05)。見表1、表2、圖1～3。

組別-+++～+++ 陽性率(%)正常組246016%COPD模型組1551050%*苗藥組方干預(yù)組214530%**

注：與正常組比較，*P<0.05：與COPD組比較，**P<0.05。

表2 各組大鼠氣道及肺組織C-myc 免疫組化結(jié)果(n=30)

注：與正常組比較*P<0.05：與COPD組比較**P<0.05。

圖1 正常組C-myc組化染色(×200) 圖2 模型組C-myc組化染色(×200) 圖3 苗藥組方干預(yù)組C-myc組化染色 (×200)

3 討 論

盡管氣道炎癥[4]、氧化損傷[5]、感染等假說均在COPD發(fā)病中占據(jù)相當(dāng)重要的地位，但其具體的發(fā)病機(jī)制至今仍未明了。己知關(guān)于COPD發(fā)生發(fā)展與體內(nèi)多種基因、多條信號(hào)通路、細(xì)胞因子等密切相關(guān)。針對COPD氣道壁結(jié)構(gòu)這一點(diǎn)，其主要病理變化仍是氣道重塑[6]。

C-myc基因是存在于正常細(xì)胞中能編碼關(guān)鍵性調(diào)控蛋白的一類基因，其基因結(jié)構(gòu)具有獨(dú)特性，其表達(dá)與細(xì)胞生長、分化及啟動(dòng)細(xì)胞的增殖活性密切相關(guān)。不僅如此，C-myc基因還是Wnt的靶基因，Wnt靶基因是多樣化的產(chǎn)品，其生物學(xué)效應(yīng)多樣，如控制細(xì)胞周期的進(jìn)程、細(xì)胞增生、抑制凋亡、調(diào)節(jié)胚胎的發(fā)育和細(xì)胞的分化等[7-8]。劉穎格等[9]在研究中發(fā)現(xiàn)，C-myc基因的過量表達(dá)，還可以導(dǎo)致多種炎癥介質(zhì)的釋放，這是氣道重塑的主要原因 。阻斷其表達(dá)，可控制患者氣道重塑的癥狀，延長患者生命。以上研究結(jié)果均表明C-myc基因可能是參與調(diào)控COPD氣道重塑的主要基因之一。本研究發(fā)現(xiàn)，正常組C-myc基因mRNA有少量表達(dá)，而COPD模型組C-myc基因mRNA較正常組和干預(yù)組表達(dá)增強(qiáng)﹙P<0.05﹚，這與COPD模型組大鼠氣道成纖維細(xì)胞的增殖密切相關(guān)，其主要原因是氣道成纖維細(xì)胞受C-myc基因的調(diào)控，細(xì)胞增殖引起COPD大鼠氣道重塑。與COPD模型組相比，干預(yù)組C-mycmRNA及蛋白陽性表達(dá)率均明顯降低(P<0.05﹚，說明苗藥組方對COPD大鼠氣道重塑模型的建立有一定程度的干預(yù)。

苗族居住區(qū)大量出產(chǎn)苗藥，是我們可以利用的寶貴資源，其種類多達(dá)1 000多種。本研究主要精選枇杷葉、紫金牛、巖白菜、鼠曲草、鐵掃帚等止咳抗炎苗藥?，F(xiàn)代研究結(jié)果表明：枇杷葉中三萜酸類成分有抗炎鎮(zhèn)咳的功效[10]；據(jù)藥典記載，枇杷葉具有清肺止咳、降逆止嘔的功效。紫金牛屬于民間中草藥，具有止咳化痰、活血化瘀等作用，主要用于肺結(jié)核、慢性支氣管炎[11]等疾病的治療。巖白菜的有效成分為巖白菜素，在中醫(yī)臨床上常被用來治療咳嗽、吐血等，在西醫(yī)臨床上主要治療呼吸道炎癥、肺炎等；不僅如此，它還有消炎、保肝等功效[12]。鼠曲草具有化痰止咳、祛風(fēng)平喘之效，藥食兼用，是一種不可多得的野生植物資源[13]。俞冰等[14]動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究表明，鼠曲草水提取液有較好的排痰和止咳祛痰功效。鐵掃帚具有止咳祛痰、清熱解毒化濕的功效。周洵等[15]相關(guān)研究證實(shí)，苗藥結(jié)合西藥治療COPD急性發(fā)作期有明顯的療效。本資料中經(jīng)苗藥灌胃治療后大鼠氣道及肺組織C-myc基因mRNA及蛋白陽性表達(dá)率均較COPD模型組明顯減少，提示苗藥可能通過多種途徑抑制氣道和肺成纖維細(xì)胞的增殖，進(jìn)而緩解COPD病情的發(fā)展。

總之，本課題通過對C-myc基因與COPD氣道重塑發(fā)病機(jī)制的研究，進(jìn)一步明確基因調(diào)控細(xì)胞增殖在COPD發(fā)病過程中的作用，為COPD的治療提供了新的思路和可能的、有效的治療靶點(diǎn)；同時(shí)苗藥的應(yīng)用，讓我們從民族醫(yī)藥中找到了有效的調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、抑制氣道重塑的新方法。

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Study on the effects of Miao Nationality's Herbs And C-myc on airway redmeling of COPD rats

XuDan1,XuXinyi2,LiuYouqin3.

1.ChineseTraditionalMedicineCollegeofGuiyang,Guiyang550002,China. 2.TheSecondHospitalAffiliatedtoChineseTraditionalMedicineCollegeofGuiyang,Guiyang550003,China. 3.DepartmentofClinicsofGuizhouProvincialGovernment,Guiyang550004,China.

Objective To observe the level changes of C-myc mRNA and protein in the rats' lung tissue, and to explore the relationship between C-myc and airway remodeling, and explaining the effect of Miao nationality's herb on the airway remodeling. Methods 90 wistar male rats were randomly divided into NS group, COPD group, Miao nationality′s herb treatment group, and 30 in each group. The COPD rat model was built with compound factors: cigarette smoke plus intratracheal instillation of lipopolysaccharide (LPS). After duplicating the mold, the rats in Miao nationality ′s herb treatment group were treated by stomach. All animals were put to death and samples were collected. The expression of C-myc mRNA and protein content in the rats' lung tissue were detected in both groups by immunohistochemistry and RT-qPCR. Results Compared with NS group, the expression of C-myc mRNA and protein content in COPD group and Miao nationality's herb treatment group showed a increasing trend, the difference was statistically significant (P<0.05). Compared with COPD group, the expression of C-myc mRNA and protein content in Miao nationality's herb treatment group showed a decreasing trend (P<0.05). Conclusion C-myc may play a role in airway remodeling in COPD rats. Miao nationality′s herb was effective in both reducing airway remodeling and decreasing the expression of C-myc mRNA and protein content.

C-myc； COPD； Airway remodeling； Miaonationality 's herb

R-332

A

1000-744X(2016)02-0139-04

2015-07-16)

△通信作者，E-mail：954449965@qq.com