高效液相色譜法測定飼料中五種核苷酸的含量

■蔡小明 吳少明 楊旺火 劉 芳 梁 敏 林 欽

（福建省產(chǎn)品質(zhì)量檢驗(yàn)研究院國家加工食品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)中心，福建福州350002）

核苷酸是一類由嘌呤堿或嘧啶堿基、核糖或脫氧核糖以及磷酸三種物質(zhì)組成的化合物。根據(jù)堿基的不同，又有腺嘌呤核苷酸（腺苷酸，AMP）、鳥嘌呤核苷酸（鳥苷酸，GMP）、胞嘧啶核苷酸（胞苷酸，CMP）、尿嘧啶核苷酸（尿苷酸，UMP）、胸腺嘧啶核苷酸（胸苷酸，TMP）及次黃嘌呤核苷酸（肌苷酸，IMP）等[1]。隨著動(dòng)物營養(yǎng)學(xué)研究深入，核苷酸在飼料中的功能和作用機(jī)理也逐步被人們重新認(rèn)識(shí)，在動(dòng)物生長過程中可提高免疫力，促進(jìn)鐵的吸收，參與脂蛋白的代謝，調(diào)節(jié)腸道菌群，有助組織生長和分化等[2-3]。

國內(nèi)對(duì)核苷酸檢測方法研究較少，特別是飼料中核苷酸檢測方法研究未見報(bào)道。目前，核苷酸的測定方法主要有：熒光法、毛細(xì)管電泳法、高效液相色譜法、離子交換色譜法及液相色譜-質(zhì)譜法等[4-6]。毛細(xì)管電泳法重現(xiàn)性較差，熒光法及離子交換色譜法存在較大的干擾，飼料基質(zhì)較為復(fù)雜，采用液相色譜-質(zhì)譜法基質(zhì)效應(yīng)強(qiáng)，準(zhǔn)確定量較為困難。因此，本文欲選用高效液相色譜建立飼料中五種核苷酸的測定方法。

1 試驗(yàn)部分

1.1 主要儀器和試劑

Alliance 2695高效液相色譜儀器（配二極管陣列檢測器）（美國Waters公司）、Milli-Q超純水純化系統(tǒng)（美國Millipore公司）、BT 224 S分析天平（德國賽多利斯公司）、DS-8510 DTH超聲波振蕩器（上海生析超聲儀器有限公司）、XH-B旋渦混均器（江蘇康健醫(yī)療用品有限公司）、0.45 μm尼龍濾膜（天津市津騰實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）。

五種核苷酸標(biāo)準(zhǔn)品：腺嘌呤核苷酸(AMP)、鳥嘌呤核苷酸(GMP)、胞嘧啶核苷酸(CMP)、尿嘧啶核苷酸(尿苷酸，UMP)及次黃嘌呤核苷酸(IMP)購于德國DR公司。試驗(yàn)用水為Milli-Q超純水，其余試劑均為色譜純。

1.2 色譜條件

色譜柱：Ultimate XB-C18(5 μm、4.6 mm×250 mm)；流動(dòng)相：甲醇-水溶液（含0.04%磷酸及0.7%三乙胺）；流速1.0 ml/min；柱溫：35℃；檢測波長（UV）255 nm；進(jìn)樣量10 μl。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

1.3.1 儲(chǔ)備液的配制

準(zhǔn)確稱取五種核苷酸標(biāo)準(zhǔn)品約25 mg（準(zhǔn)確至0.000 1 g），超純水溶解定容至25 ml（每個(gè)組分稱取的質(zhì)量都要校正水分和鈉鹽含量，以酸型計(jì)）。配制成濃度約為1.00 mg/ml的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)工作曲線的配制

準(zhǔn)確吸取適量標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，稀釋成濃度分別為2、5、10、20、50 μg/ml的標(biāo)準(zhǔn)系列。

1.4 樣品處理

準(zhǔn)確稱取5 g樣品于100 ml錐形瓶中，加入40 ml超純水、0.1 g EDTA超聲提取15 min后，0.1 mol/l鹽酸調(diào)節(jié)pH值至3.0，轉(zhuǎn)移至50 ml容量瓶，超純水定容，充分混勻，離心后過0.45 μm濾膜，供HPLC分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 檢測波長的選擇

將五種核苷酸儲(chǔ)備液稀釋成適量濃度上機(jī)測試，在208～384 nm波長進(jìn)行全掃描，結(jié)果如圖1所示，五種核苷酸最大吸收峰在245.8～277.8 nm之間，試驗(yàn)結(jié)果表明，在255 nm處，五種核苷酸響應(yīng)均較好，且無明顯干擾，因此本文選擇255 nm作為五種核苷酸的檢測波長。

2.2 流動(dòng)相的選擇

核苷酸類物質(zhì)通常采用液相色譜檢測，其流動(dòng)相中需加入離子對(duì)試劑才能實(shí)現(xiàn)基線分離，本試驗(yàn)選用甲醇/水作為流動(dòng)相，分別加入三乙胺、四丁基硫酸氫銨、四丁基氯化銨3種離子對(duì)試劑，考察其對(duì)5種核苷酸分離度的影響，試驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，三乙胺的結(jié)果最優(yōu)。此外，本試驗(yàn)還考察了流動(dòng)相的pH值對(duì)5種核苷酸保留能力的影響，分別在水相中加入0.01%、0.02%、0.03%、0.04%、0.05%磷酸，結(jié)果顯示加入0.04%的磷酸時(shí)5種核苷酸的保留時(shí)間較為理想，基線分離的同時(shí)又節(jié)約分析時(shí)間。

圖1 五種核苷酸光譜圖

2.3 前處理?xiàng)l件優(yōu)化

飼料基質(zhì)較為復(fù)雜，其所含的蛋白質(zhì)、脂肪及重金屬離子等均會(huì)對(duì)檢測造成影響。因此，本文采用調(diào)節(jié)pH值沉淀蛋白、加入EDTA絡(luò)合重金屬離子。分別采用甲酸、0.1 mol/l鹽酸、冰乙酸及0.1%三氯乙酸溶液調(diào)pH值，結(jié)果表明當(dāng)采用0.1 mol/l鹽酸試驗(yàn)，調(diào)節(jié)pH值至3.0，蛋白沉淀較全，干擾最小，且回收率較優(yōu)；而EDTA的量太少，金屬離子去除不完全，過多則會(huì)影響色譜柱的使用壽命，分別采用不同量的EDTA（0.05、0.10、0.15、0.20 g）進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果顯示，當(dāng)EDTA的量達(dá)到0.10 g及以上時(shí)，結(jié)果較好。因此，本文選用0.1 mol/l鹽酸作為酸度調(diào)節(jié)劑，采用0.10 g EDTA作為絡(luò)合劑。

2.4 線性范圍和檢測限

在2.0～50.0 μg/ml范圍內(nèi)配制五個(gè)不同濃度水平標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行試驗(yàn)，以目標(biāo)物的峰面積作為y軸，濃度作為x軸進(jìn)行線性回歸，得出線性回歸方程。檢測限以3倍信噪比計(jì)，定量限以10倍信噪比計(jì)(結(jié)果見表1)，5種核苷酸線性關(guān)系良好（R2值均大于0.999），檢測限在2～4 mg/kg之間，定量限在6～12 mg/kg之間，滿足分析要求。

表1 線性方程、線性參數(shù)及線性范圍

2.5 精密度與準(zhǔn)確度

以陰性飼料樣品作為基質(zhì)，進(jìn)行10、50、200 mg/100 g三種水平加標(biāo)回收試驗(yàn)，每種水平平行試驗(yàn)6次，結(jié)果見表2。由表2可知，5種核苷酸平均回收率在95.1%～109.0%之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）在0.6%～2.8%之間，滿足方法學(xué)要求。

表2 回收率與精密度（n=6）

2.6 實(shí)際樣品檢測

隨機(jī)購買市售三種不同類型飼料，每種選取10家不同品牌樣品進(jìn)行5種核苷酸的測定。結(jié)果見表3。濃縮料中5種核苷酸均有檢出，含量在84～10 589 mg/100 g之間；配合飼料檢出4種核苷酸，含量在25～1 938 mg/100 g之間；魚粉中檢出3種核苷酸，含量在2 547～22 401 mg/100 g之間，說明所建立方法適用于飼料中5種核苷酸的檢測。

表3 飼料中五種核苷酸含量范圍（mg/100 g）

3 結(jié)語

本文建立了飼料中五種核苷酸的高效液相色譜的測定方法，該方法操作簡單、檢測限低、重現(xiàn)性好，并成功將該方法應(yīng)用于實(shí)際樣品的檢測，為飼料中核苷酸檢測提供參考。