■ 王 燕 文奇男 劉朝銀 劉 驥 郭建華 任 健 郭宏文 劉曉蘭*

（1.齊齊哈爾大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，黑龍江齊齊哈爾161006；2.遼寧省農(nóng)牧業(yè)機(jī)械研究所有限公司，遼寧沈陽110036）

隨著畜牧業(yè)的快速發(fā)展，蛋白質(zhì)資源嚴(yán)重匾乏， 血粉粗蛋白含量高（80%～90%），賴氨酸、亮氨酸等氨基酸豐富[1]，還含有多種微量元素、多種酶類和維生素，因此開發(fā)血粉既可解決血液的利用問題，又能緩解動(dòng)物蛋白飼料的緊缺。但是血粉適口性不好，氨基酸不平衡，因此大部分資源都浪費(fèi)了。另外，血液資源由于缺乏制備血粉的烘干等設(shè)備而將這些資源作為廢棄物排放掉，造成了嚴(yán)重的環(huán)境污染[2]。因此，血液資源的開發(fā)利用不僅緩解蛋白原料短缺的現(xiàn)狀，還有利于保障飼料工業(yè)的可持續(xù)發(fā)展，同時(shí)可有效地緩解其對(duì)環(huán)境的污染。因此，加強(qiáng)對(duì)畜禽血液資源的精深加工和綜合利用，研發(fā)出優(yōu)質(zhì)血粉產(chǎn)品對(duì)我國(guó)畜牧行業(yè)的可持續(xù)發(fā)展具有深遠(yuǎn)影響和重大意義。

目前血粉的加工方法主要有物理法、化學(xué)法、酶法和微生物法。物理方法包括膨化、噴霧干燥和高壓處理等，這些方法能提高營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的安全性和利用率，仍未能解決適口性差的問題，但對(duì)氨基酸構(gòu)成沒有改善[3]，并且存在著高耗能、高投資等，極大地增加了養(yǎng)殖成本，導(dǎo)致其在飼料生產(chǎn)上的推廣應(yīng)用受到了限制?；瘜W(xué)加工和酶解加工均可以改善血粉的營(yíng)養(yǎng)特性，但制成的成品中都含有血腥味，酶解血粉成本較高，推廣受到限制。微生物發(fā)酵方法是利用微生物產(chǎn)復(fù)合酶的特性將血粉大分子蛋白質(zhì)水解成氨基酸和肽等小分子物質(zhì)，并可以增加血粉中的游離氨基酸的含量，還能有效破壞血細(xì)胞膜，釋放血粉中的各種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)或者利用營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)合成菌體蛋白，還可以有效地利用載體中的纖維素、植酸等營(yíng)養(yǎng)成分[4]。利用此方法制備得到的產(chǎn)品其消化率和適口性得到改善，發(fā)酵血粉具有酒香味，適口性好，有效降解大分子蛋白，大大提高了血粉的消化率和適口性。另外，酶解處理后蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)會(huì)發(fā)生改變，蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)主要包括α-螺旋、β-折疊、β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)則卷曲，酶解處理之后，蛋白的各種二級(jí)結(jié)構(gòu)的含量會(huì)發(fā)生變化，導(dǎo)致功能特性的變化，動(dòng)物利用效果提高[5]。本項(xiàng)目采用復(fù)合微生物協(xié)同發(fā)酵法制備肽含量高的血粉，以期提高血粉的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和利用率，更有效地替代魚粉等優(yōu)質(zhì)蛋白飼料。

1 材料方法

1.1 試驗(yàn)菌種

米曲霉、枯草芽孢桿菌，齊齊哈爾大學(xué)生物工程實(shí)驗(yàn)室提供。①PDA培養(yǎng)基：土豆汁（30%濃度配制），2%葡萄糖，自然pH。②LB培養(yǎng)基：1%胰蛋白胨、0.5%酵母浸膏、1%氯化鈉，自然pH。

1.2 生長(zhǎng)曲線的繪制

依據(jù)單菌篩選出的菌種，挑選斜面上生長(zhǎng)良好的部位，各接種一環(huán)到裝有100 ml種子培養(yǎng)基的250 ml的三角瓶中，以37℃、180 r/min恒溫振蕩培養(yǎng)24 h。將培養(yǎng)好的種子液接入到裝有250 ml種子培養(yǎng)基的500 ml的三角瓶中，每瓶接入15 ml種子液，每種菌設(shè)置1個(gè)重復(fù)。將接種好的三角瓶于37℃、180 r/min恒溫振蕩培養(yǎng)，每隔4 h每瓶取5 ml菌液，5 000轉(zhuǎn)離心10 min，棄上清液。再往離心管內(nèi)加入40 ml蒸餾水，振蕩，使沉淀變成懸濁液，以蒸餾水為對(duì)照，在600 nm下測(cè)定吸光值。以培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo)，吸光值的平均值為縱坐標(biāo)，繪制生長(zhǎng)曲線。菌種計(jì)數(shù)采用平板計(jì)數(shù)法。好氧菌采用涂布平板法，兼性厭氧菌采用傾注平板法。

1.3 發(fā)酵條件的優(yōu)化

按照單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)，分別優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基的比例、物料比、發(fā)酵溫度、培養(yǎng)時(shí)間以及輔料添加比例，起始條件為菌種比例為1∶1，物料比為5∶5，溫度30℃，發(fā)酵時(shí)間64 h，料水比1∶2，pH值自然。酶活的測(cè)定方法參照國(guó)標(biāo)[6]。

2 結(jié)果與討論

2.1 米曲霉和枯草芽孢桿菌的生長(zhǎng)曲線(見圖1、圖2)

圖1 米曲霉生長(zhǎng)曲線

圖2 枯草芽孢桿菌生長(zhǎng)曲線的測(cè)定

由圖1可以看出，從0～8 h時(shí)菌體處于生長(zhǎng)延滯期，這一時(shí)期是菌體吸水膨脹、子囊消失的過程，8～24 h時(shí)菌體處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，在24～28 h時(shí)達(dá)到菌體生長(zhǎng)的穩(wěn)定期。對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期是菌體具有較高的繁殖能力的時(shí)期，所以選擇20 h為最佳的種子培養(yǎng)時(shí)間，此時(shí)的菌體濃度為23.60 mg/ml。

由圖2可以看出，0～12 h枯草芽孢桿菌生長(zhǎng)旺盛，12～16 h枯草芽孢桿菌生長(zhǎng)下降，16～20 h生長(zhǎng)緩慢上升，20～24 h又下降。所以可以看出生長(zhǎng)12 h時(shí)枯草芽孢桿菌生長(zhǎng)最旺盛，此時(shí)的菌體濃度最大，為12.53 mg/ml，所以選擇12 h為枯草芽孢桿菌的液體種子培養(yǎng)的最佳時(shí)間。

2.2 最佳發(fā)酵條件的優(yōu)化

2.2.1 最佳物料的優(yōu)化(見圖3)

圖3 血粉與輔料的最適比例

由圖3可知，物料比血粉與麥麩5∶5時(shí)發(fā)酵效果最好，這與麥麩本身的透氣性好有關(guān)。對(duì)于米曲霉這類好氧菌，添加麥麩能提高物料的通透性，使氧氣與菌種能充分反應(yīng)，促進(jìn)菌體的生長(zhǎng)和增殖。加入快速碳源一般應(yīng)加快反應(yīng)，但在本試驗(yàn)中，快速碳源（蔗糖）對(duì)產(chǎn)酶性能有一定的阻遏，可能是微生物胞外酶生物合成的分解代謝產(chǎn)物的阻遏效應(yīng)，在快速碳源存在的條件下，組成酶和誘導(dǎo)酶都有類似的現(xiàn)象。顯然，蔗糖對(duì)米曲霉和枯草芽孢桿菌產(chǎn)蛋白酶的阻礙屬于代謝產(chǎn)物阻礙。

2.2.2 最佳主輔料比的優(yōu)化(見圖4)

由圖4可知，血粉和麥麩的比例為5∶5時(shí)，蛋白酶活力最高。當(dāng)麥麩含量逐漸增加時(shí)，蛋白酶活力逐漸增加，這可能是由于麥麩一般情況除了增加物料的通透性，提供充足的氧氣外，還會(huì)提供碳源，此時(shí)的碳氮比能最大限度地增加微生物的增殖，隨著微生物數(shù)量的增加，產(chǎn)酶活力必然會(huì)逐漸加大，便于微生物發(fā)揮作用。

圖4 血粉和麥麩的比例優(yōu)化

2.2.3 最佳料水比的條件優(yōu)化(見圖5)

圖5 最適料水比的條件優(yōu)化

由圖5可知，料水比為1∶2時(shí)蛋白酶酶活力較高，且與1∶2.5、1∶3.5的比例的蛋白酶酶活無顯著差異，隨著水的增加，微生物的增殖能力和產(chǎn)酶能力都相應(yīng)提高。合適的濕度能改善物料的理化性質(zhì)，促進(jìn)菌體生長(zhǎng)，提高酶活，一般高于70%較為適宜，對(duì)于細(xì)菌，一般要求70%為宜，而真菌對(duì)濕度要求較高，20%～70%之間為宜。為了降低成本應(yīng)選擇1∶3.5作為最適比例。但是水含量過高，物料無法滿足微生物的營(yíng)養(yǎng)要求，會(huì)使蛋白酶活下降。

2.2.4 最佳發(fā)酵溫度的優(yōu)化(見圖6)

由圖6可知，隨著發(fā)酵溫度的增加，蛋白酶酶活呈現(xiàn)先增加后減小的趨勢(shì)，當(dāng)發(fā)酵溫度為36℃時(shí)，蛋白酶酶活達(dá)到最高值為4 114.93 U/g，溫度主要影響的是菌體生長(zhǎng)和底物濕度，溫度越高，相對(duì)濕度就越小。本文采用的微生物是米曲霉和枯草芽孢桿菌，米曲霉的最適溫度為30℃，細(xì)菌的最適溫度為37℃，兩種菌達(dá)到更好的生長(zhǎng)和產(chǎn)酶效果，最適溫度應(yīng)該介于兩者之間，這與本文得到的結(jié)論是一致的。隨著溫度的繼續(xù)增加，酶活力迅速下降。

圖6 隨發(fā)酵溫度的升高蛋白酶酶活的變化

2.2.5 最佳發(fā)酵時(shí)間優(yōu)化

從24～36 h，酶活變化較大，從36～48 h酶活變化不大，從培養(yǎng)36 h開始，產(chǎn)酶速度加快，到72 h達(dá)到產(chǎn)酶最高峰，然后開始下降，且下降幅度較大，說明發(fā)酵受到時(shí)間的影響較大。發(fā)酵時(shí)間主要影響菌體的生長(zhǎng)和酶活，在固態(tài)基料中傳質(zhì)較液態(tài)基料慢，由本文可以看出，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，蛋白酶酶活逐漸增加，72 h達(dá)到峰值，發(fā)酵到84 h反而酶活下降，可能是養(yǎng)料已經(jīng)消耗殆盡，產(chǎn)生了其他的副產(chǎn)物消耗了其中的蛋白酶。

圖7 隨發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)蛋白酶酶活變化

Wang等[7]采用米曲霉固態(tài)發(fā)酵豬血和麥麩的混合物，120 h后，肽的含量顯著增加，俞煒洋等[8]采用產(chǎn)朊假絲酵母、枯草芽孢桿菌和乳酸菌等多種蛋白酶使發(fā)酵產(chǎn)品具有醇香味，適口性得到改善，發(fā)酵后產(chǎn)生小肽和氨基酸。這些研究與本文得到的結(jié)論是一致的。方俊等[9]篩選到高產(chǎn)蛋白酶的菌株，通過米曲霉、釀酒酵母和芽孢桿菌使蛋白酶活力達(dá)到2 991.4 U/g，經(jīng)血粉發(fā)酵檢測(cè)，該混合菌有較強(qiáng)的蛋白分解能力，能降解血粉和羽毛粉中難以分解的大分子蛋白。張濱等[10]采用蠟樣芽孢桿菌、乳酸菌和酵母菌進(jìn)行多菌種混合發(fā)酵血粉，顯著提高了蛋白酶活力（5 113.4 U/g）。但是以上研究顯然酶活低于本試驗(yàn)的結(jié)果，這與選擇的菌種和發(fā)酵工藝條件有關(guān)。與單菌株單獨(dú)發(fā)酵相比，多個(gè)菌株協(xié)同生長(zhǎng)更快，發(fā)酵周期更短，多菌種混合發(fā)酵玉米蛋白粉能產(chǎn)生大量的發(fā)酵副產(chǎn)物，大大改善了血粉的氣味，提高了血粉的適口性。

3 結(jié)論

酶解血粉最佳的發(fā)酵工藝條件為最優(yōu)的物料是麥麩，血粉和麥麩比例是5∶5，料水比是1∶3.5，發(fā)酵溫度是36℃，發(fā)酵時(shí)間是72 h，達(dá)到最高酶活是6 122.08 U/g。