響應(yīng)面法在超聲提取懷菊總黃酮條件優(yōu)化中的應(yīng)用*

羅 陽，楊 敏，唐嘉熙，王朝霞，李婷婷△

1.成都醫(yī)學(xué)院 藥學(xué)院(成都 610083)；2.河北灤縣婦幼保健計(jì)劃生育服務(wù)中心(灤縣 063700)

·論 著·

響應(yīng)面法在超聲提取懷菊總黃酮條件優(yōu)化中的應(yīng)用*

羅 陽1，楊 敏2，唐嘉熙1，王朝霞1，李婷婷1△

1.成都醫(yī)學(xué)院 藥學(xué)院(成都 610083)；2.河北灤縣婦幼保健計(jì)劃生育服務(wù)中心(灤縣 063700)

目的 研究超聲法提取懷菊中總黃酮的優(yōu)化工藝。方法 利用響應(yīng)面法，分析懷菊和乙醇的料液比、乙醇濃度、提取溫度、提取時(shí)間和提取次數(shù)對懷菊提取物中總黃酮含量的影響，得出最佳參數(shù)組合并建立多元回歸模型。結(jié)果 最佳提取工藝為：懷菊與乙醇的料液比1∶14、乙醇濃度65%、置于55 ℃下的恒溫超聲儀中提取3次。結(jié)論 響應(yīng)面法可以用于懷菊總黃酮提取條件的優(yōu)化。

懷菊；總黃酮；超聲提取；響應(yīng)面法

藥用菊花，以產(chǎn)于河南焦作的“懷菊”Chrysan-themummorifoliumRamat．最為有名，是四大懷藥之一，具有疏風(fēng)清熱、平肝明目、解毒之功效。近年研究[1]發(fā)現(xiàn)，其含有豐富的黃酮類化合物，具有明顯的抗炎、抗菌、抗脂質(zhì)過氧化、抗衰老、清除自由基、增加機(jī)體免疫力和擴(kuò)張冠狀動脈等作用。用懷菊浸出物治療冠心病，有效率達(dá)58%以上，尤其對伴有高血壓、心絞痛的患者有很好的療效。近年來黃酮類化合物的研究更多涉及到提取工藝的應(yīng)用研究、黃酮類化合物的含量測定及制劑制備上[2]。目前黃酮提取方法主要為有機(jī)溶劑回流法、超聲法和微波提取等。超聲提取能加速提取成分的擴(kuò)散、釋放，并能與溶劑充分混合而利于提取, 具有提取時(shí)間短、溫度較低、收率高、適用性廣、有效成分易于分離純化、操作簡單和成本低等優(yōu)勢[3-9]。影響超聲法提取懷菊中黃酮的因素有：懷菊和提取溶劑乙醇的料液比、乙醇濃度、提取溫度、提取時(shí)間和提取次數(shù)等，各因素影響大小不同，且存在一定的相互作用。本研究采用響應(yīng)面分析法(response surface method,RSM)將統(tǒng)計(jì)設(shè)計(jì)與實(shí)驗(yàn)技術(shù)相結(jié)合，給出因素間相互作用的直觀圖形，得出優(yōu)化工藝條件及回歸模型[3]。

1 材料與方法

1.1 儀器和試劑

SHZ-D(Ⅲ)循環(huán)水式真空泵(鞏義市予華儀器廠)； DHG-9104A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海一恒科學(xué)儀器有限責(zé)任公司)；Biomate 3S雙光束紫外可見分光光度計(jì)(東南科儀)；SC-3614型低速離心機(jī)(科大創(chuàng)新股份有限公司中佳分公司)；HH-S66水浴鍋(金壇市精達(dá)儀器制造廠)；KQ-300DE型數(shù)控超聲波清洗機(jī)(昆山市超聲儀器有限公司)；BSA124S電子天平(賽多利斯科學(xué)儀器有限公司)。

0.2 mg/mL蘆丁對照品：精密稱取干燥至恒重的蘆丁對照品20.00 mg，置于100 mL容量瓶中，加入30%乙醇70 mL，水浴微熱，使之溶解，自然冷卻，再加入30%乙醇定容至刻度，搖勻備用。其中蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品(生化試劑)購于成都曼思特生物科技有限公司，其余所用試劑均為市售分析純，試驗(yàn)用水為超純水，懷菊采用市售普通懷菊，經(jīng)成都醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心秦琴實(shí)驗(yàn)師鑒定為生藥懷菊。

1.2 方法

根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，懷菊的用量為3.00 g，改變提取溶劑乙醇的用量和濃度(40%～80%)，提取溫度50～70 ℃，提取時(shí)間40～80 min，提取次數(shù)1～3次。利用 Design-Expert 7.1.6 軟件，以A代表懷菊和乙醇的料液比，B代表乙醇濃度，C代表提取溫度，D代表提取時(shí)間，E代表提取次數(shù)，Y代表提取物總黃酮含量(吸光度值)作為響應(yīng)指標(biāo)，由Box-Behnken中心組合進(jìn)行五因素三水平實(shí)驗(yàn)，并優(yōu)化其提取條件。

1.2.1 懷菊中總黃酮的超聲波提取 精密稱取干燥粉碎后的懷菊3.00 g于250 mL錐形瓶中，按照實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)(表1)加入一定量對應(yīng)濃度的乙醇，置于相應(yīng)溫度下的恒溫超聲儀中，提取相應(yīng)的時(shí)間和次數(shù)。抽濾，將濾液離心30 min(3 500 r/min)后用0.45 μM濾膜過濾，量取2 mL于10 mL的容量瓶中，用相應(yīng)濃度的乙醇定容至刻度，搖勻，得到供試液。

1.2.2 懷菊總黃酮的含量測定 以蘆丁為標(biāo)準(zhǔn)品，采用NaNO2-Al(NO3)3比色法繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。精密量取蘆丁對照品溶液0.0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0 mL，分置25 mL容量瓶中，各加入5%NaNO2溶液0.3 mL搖勻，放置6 min；加入10%Al(NO3)3溶液0.3 mL搖勻，放置6 min；加4%NaOH溶液2 mL， 并分別加60%乙醇定容至刻度，搖勻、靜置10 min，以吸光度為縱坐標(biāo)，濃度(μg/mL)為橫坐標(biāo)，在505 nm波長處進(jìn)行測定，其含量與吸光值呈正比，得吸收曲線方程如式(1)，將懷菊供試液用上述方法在505 nm波長處測定吸光度，總黃酮含量按式(1)計(jì)算。

y=0.0113x+0.0284R2=0.9991

(1)

式中：y為對應(yīng)的吸光度值；x為總黃酮的含量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

本研究采用Design Expert V10軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。采用單因素方差分析確定提取條件的取值水平，用響應(yīng)面法建立多因素回歸模型，確定最佳提取條件。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α設(shè)定為0.05。

2 結(jié)果

2.1 模型的適應(yīng)性分析

表1設(shè)計(jì)了46個實(shí)驗(yàn)點(diǎn)，其中11，13，17，19，31，44號為零點(diǎn)實(shí)驗(yàn)，用來估算隨機(jī)誤差實(shí)驗(yàn)，其余40個點(diǎn)為析因?qū)嶒?yàn)點(diǎn)。對實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析，得到提取物總黃酮含量(吸光度值，Y)與料液比(A)、乙醇濃度(B)、提取溫度(C)、提取時(shí)間(D)、提取次數(shù)(E)之間的二次多項(xiàng)回歸模型方程：

Y=0.27+0.034A-4.188E-003B-5.438E-003C-2.250E-003D+0.037E+0.015AB-4.500E-003AC+4.250E-003AD-1.250E-003AE+1.500E-003BC-6.000E-003BD+7.000E-003BE-8.750E-003CD+1.500E-003CE+2.000E-003DE-0.015A2-0.022B2-0.016C2+8.333E-005D2-9.667E-003E2

(2)

對回歸方程進(jìn)行方差分析和顯著性檢驗(yàn)，結(jié)果表明：模型的P<0.000，說明該回歸模型極顯著；失擬項(xiàng)的P=0.346，差異不顯著，說明該模型擬合程度良好；決定系數(shù)(R2)和調(diào)整系數(shù)(adj.R2)分別為0.934和0.882，具有較好的一致性，表明該模型的準(zhǔn)確性和適用性較好(表2)。因此，可以用該模型來分析和預(yù)測懷菊中總黃酮的超聲波提取工藝。

2.2 不同因素及其交互作用對超聲法提取懷菊中總黃酮的影響

料液比、提取次數(shù)、料液比的平方、乙醇濃度的平方、提取溫度的平方、提取次數(shù)的平方以及料液比和乙醇濃度的交互作用均對懷菊中總黃酮的超聲波提取有顯著性的影響，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)?；貧w模型系數(shù)表明，提取次數(shù)對提取物中總黃酮含量的影響最大，料液比的影響次之，其他因素的影響很小，且料液比和提取次數(shù)與總黃酮含量呈正相關(guān)。

圖1-圖10表明，提取物總黃酮含量(吸光度值，Y)隨著料液比(A)增大而增加，呈現(xiàn)正交互作用，前半段增幅明顯，后半段增幅較小。這是由于料液比擴(kuò)大可增加懷菊與溶劑的接觸面積，使黃酮類物質(zhì)更充分地溶解出來；當(dāng)提取溶劑乙醇足量后，細(xì)胞內(nèi)外溶液中被溶解的化學(xué)成分濃度達(dá)到平衡，繼續(xù)增大乙醇量而其提取液中黃酮含量無明顯增加；料液比過大時(shí)會造成雜質(zhì)過多溶出，使得進(jìn)一步的濃縮消耗更多的能量和時(shí)間，同時(shí)也會阻礙黃酮的溶出[4]。因此，最適宜的料液比為1∶14。

表1 Box-Behnken中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表2 回歸模型的方差分析及顯著性檢驗(yàn)

隨著乙醇濃度(B)的升高，吸光度也隨著升高，當(dāng)乙醇濃度達(dá)到65%時(shí)，吸光度達(dá)到最大值；再增加乙醇濃度，吸光度下降。這可能是由于隨乙醇濃度的增大，提取液中除黃酮外其他物質(zhì)的提取率也隨之提高，從而影響黃酮類物質(zhì)的提取，造成懷菊總黃酮的提取率下降。因此，最適宜的乙醇濃度為65%。

隨著提取溫度(C)的升高，吸光度也隨著升高，當(dāng)溫度達(dá)到55 ℃時(shí)，吸光度也達(dá)到最大值，再升高溫度，吸光度下降。因?yàn)槿軇┩ㄟ^浸泡擴(kuò)散作用將中藥所含的化學(xué)成分逐漸溶解，使其擴(kuò)散到溶劑中。滲透、溶解、擴(kuò)散能力隨溫度升高而增大，從而提高提取率。但溫度過高會破壞懷菊中的黃酮，溫度的加大也會增加雜質(zhì)的溶出。因此，最佳溫度應(yīng)為55 ℃。

隨著提取時(shí)間(D)的延長，吸光度值緩慢升高，但增加的趨勢不明顯。當(dāng)提取時(shí)間為80 min時(shí)，吸光度達(dá)到最大值，再增加提取時(shí)間，黃酮可能分解或揮發(fā)。因此，最適宜的提取時(shí)間為80 min。

隨著提取次數(shù)(E)的增加，吸光度也隨著升高，當(dāng)提取次數(shù)為3次時(shí)，吸光度達(dá)到最大值。因此，最適宜的提取次數(shù)為3次。

圖1 Y=f(A,B)的響應(yīng)曲面

圖2 Y=f(A,C)的響應(yīng)曲面

圖3 Y=f(A,D)的響應(yīng)曲面

圖4 Y=f(A,E)的響應(yīng)曲面

圖5 Y=f(B,C)的響應(yīng)曲面

圖6 Y=f(B,D)的響應(yīng)曲面

圖7 Y=f(B,E)的響應(yīng)曲面

圖8 Y=f(C,D)的響應(yīng)曲面

圖9 Y=f(C,E)的響應(yīng)曲面

圖10 Y=f(D,E)的響應(yīng)曲面

2.3 模型驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

為驗(yàn)證模型預(yù)測的準(zhǔn)確性，在A為1∶14、B為65%、C為55、D為80和E為3的條件下做3組平行實(shí)驗(yàn)，所得Y分別為0.320(25.81 μg /mL)，0.318(25.63 μg /mL)，0.321(25.89 μg /mL)，可見模型的預(yù)測效果較好。

3 討論

黃酮類物質(zhì)被包裹在細(xì)胞壁內(nèi)，因此，要提高黃酮類物質(zhì)的提取率，應(yīng)先破壞細(xì)胞壁[1]。超聲波獨(dú)具的物理特性能促使植物細(xì)胞組織破壁或變形，促進(jìn)提取溶劑乙醇溶液直接進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部，降低黃酮類物質(zhì)溶出的阻力，縮短提取時(shí)間，提高黃酮類物質(zhì)的溶出速率。

相對傳統(tǒng)正交設(shè)計(jì)而言，響應(yīng)面法可對影響因素組合進(jìn)行更加精確的預(yù)測，從而得到更好的效果。采用響應(yīng)面法優(yōu)化懷菊中總黃酮的超聲提取工藝，結(jié)果得出最佳工藝條件為：懷菊與乙醇的料液比1∶14、乙醇濃度65%、置于55 ℃下的恒溫超聲儀中提取3次，每次80 min。此條件下進(jìn)行3次平行實(shí)驗(yàn)，平均提取黃酮含量為25.78 μg /mL，與理論預(yù)測值吻合。該研究結(jié)果可為懷菊開發(fā)成天然抗氧化功能性產(chǎn)品提供理論基礎(chǔ)和科學(xué)依據(jù)。

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The Application of the Response Surface Method in the Ultrasonic Extraction of Total Flavonoids from Huai Flos Chrysanthemum

LuoYang1,YangMin2,TangJiaxi1,WangChaoxia1,LiTingting1△.

1.SchoolofPharmacy,ChengduMedicalCollege,Chengdu610083,China; 2.MaternalandChildHealthCareandFamilyPlanningServiceCenterofLuanxian,Luanxian063700,China

Objective To study the optimization of the process in the ultrasonic extraction of total flavonoids from Huai Flos Chrysanthemum. Methods The response surface method was adopted to analyze the effect of the Chrysanthemum-ethanol ratio, ethanol concentration, extraction temperature, extraction time and extraction times on the content of total flavonoids in chrysanthemum extraction. The obtained optimal parameter combination was used to establish the multiple regression model. Results The optimal extraction process was as follows: Chrysanthemum-ethanol ratio at 1:14, ethanol concentration at 65%, extraction temperature at 55℃ and exaction for 3 times. Conclusion The response surface method can be used to optimize the extraction conditions of total flavonoids from Huai Flos Chrysanthemum.

Huai Flos Chrysanthemum; Total flavonoids; Ultrasonic extraction; Response surface method

http://www.cnki.net/kcms/detail/51.1705.R.20161222.1043.004.html

10.3969/j.issn.1674-2257.2016.06.022

成都醫(yī)學(xué)院“大學(xué)生創(chuàng)新實(shí)驗(yàn)計(jì)劃”(No:CXJS201305)；成都醫(yī)學(xué)院自然科學(xué)基金(No:CYZ13-009)

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△通信作者：李婷婷，E-mail：93897556@qq.com