硫氫化鈉對肝硬化大鼠肝細胞凋亡及肝組織Bax、Bcl-2表達的影響

劉浩，陳衛(wèi)剛，鄭勇

(石河子大學醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院，新疆石河子832008)

硫氫化鈉對肝硬化大鼠肝細胞凋亡及肝組織Bax、Bcl-2表達的影響

劉浩，陳衛(wèi)剛，鄭勇

(石河子大學醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院，新疆石河子832008)

目的 探討硫氫化鈉(NaHS)對肝硬化大鼠的肝保護作用及其機制。方法 選擇雌性SD大鼠40只，隨機分為正常對照組、肝硬化組、炔丙基甘氨酸(PPG)組、NaHS組，每組10只。肝硬化組、PPG組、NaHS組采用四氯化碳復合因素法制備肝硬化模型。PPG組腹腔注射PPG 30 mg/(kg·d)，NaHS組腹腔注射NaHS 56 μmol/(kg·d)，正常對照組和肝硬化組腹腔注射等量生理鹽水，共注射7天。末次注射次日處死大鼠，留取肝組織，免疫組化法檢測肝組織Bax、Bcl-2表達,脫氧核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶介導缺口末端標記法測定肝細胞凋亡指數(shù)(AI)。結果 肝組織Bax、Bcl-2蛋白均定位于細胞質(zhì)，染色后呈棕黃色顆粒狀，凋亡肝細胞細胞核呈棕黃色或黃褐色。與正常對照組比較，肝硬化組AI明顯升高(P<0.05)；與肝硬化組比較，NaHS組Bax表達及AI均明顯降低(P均<0.05)，PPG組Bax表達及AI均明顯升高(P均<0.05)；各組間Bcl-2表達比較差異均無統(tǒng)計學意義(P均>0.05)。結論 NaHS對肝硬化大鼠具有肝保護作用，可抑制肝細胞凋亡；其機制可能與下調(diào)Bax表達有關。

肝硬化；硫氫化鈉；硫化氫；細胞凋亡；Bax；Bcl-2

硫化氫(H2S)是繼NO、CO之后發(fā)現(xiàn)的第三種新型氣體信號分子，在體內(nèi)主要通過細胞胱硫醚β合成酶(CBS)、細胞胱硫醚γ裂解酶(CSE)催化L-半胱氨酸而產(chǎn)生，具有擴張血管、心肌保護、抗炎等作用[1～4]。近年研究發(fā)現(xiàn)，其在肝纖維化及門脈高壓的發(fā)生、發(fā)展過程中具有重要作用[5～9]。本課題前期研究證實，腹腔注射硫氫化鈉(NaHS)可改變大鼠體內(nèi)H2S的含量。2013年6月～2014年1月，我們觀察了NaHS對肝硬化大鼠肝細胞凋亡及肝組織Bax、Bcl-2表達的影響，現(xiàn)分析結果，探討NaHS在肝硬化發(fā)生、發(fā)展中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料 健康、SPF級、雌性SD大鼠40只，體質(zhì)量(210±10)g，購自新疆醫(yī)科大學實驗動物中心，為同期出生的純種系。飼養(yǎng)環(huán)境：溫度20～25 ℃，濕度50%左右。主要儀器：RM2135型石蠟切片機，德國LEICA公司；免疫組化圖像分析系統(tǒng)，日本OLYMPUS株式會社。主要試劑：兔抗鼠Bcl-2多克隆一抗，英國Abcam公司；兔抗鼠Bax多克隆一抗，武漢博士德生物工程有限公司；脫氫核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶介導缺口端標記(TUNEL)試劑盒，瑞士Roche公司；二抗檢測試劑盒，北京中杉金橋有限責任公司；硫氫化鈉(NaHS)、炔丙基甘氨酸(PPG)，美國Sigma公司；其余試劑為國產(chǎn)分析純。

1.2 模型制備及干預 將40只大鼠隨機分為正常對照組、肝硬化組、PPG組、NaHS組，每組10只。肝硬化組、PPG組、NaHS組采用四氯化碳復合因素法制備肝硬化模型：大鼠適應性喂養(yǎng)1周，皮下注射40%四氯化碳植物油溶液，首次劑量為0.5 mL/100 g，以后每隔4天注射1次，劑量為0.3 mL/100 g，共注射13次。造模期間各組以30%乙醇溶液作為惟一飲用液體；前2周用20%豬油+80%玉米面飼養(yǎng)，之后用0.5%膽固醇粉+玉米面飼養(yǎng)至造模結束。正常對照組同期皮下注射等量生理鹽水，喂養(yǎng)飼料為復合飼料，飲用水為自來水。52天后處死大鼠，肝硬化組、PPG組、NaHS組均造模成功。造模結束PPG組腹腔注射PPG 30 mg/(kg·d)，NaHS組腹腔注射NaHS 56 μmol/(kg·d)，正常對照組、肝硬化組同期腹腔注射等量生理鹽水，共注射7天。

1.3 相關指標觀察

1.3.1 肝組織Bax、Bcl-2蛋白表達 采用免疫組化法。末次注射次日采用頸椎脫臼法處死大鼠，取部分肝組織置于10%甲醛溶液中固定，石蠟包埋，4 μm厚切片。切片常規(guī)脫蠟至水，3%雙氧水甲醇中浸泡10 min。枸櫞酸修復液微波爐中高火修復至冒泡后再低火修復20 min，冷卻至室溫，加Bax、Bcl-2一抗，置于4 ℃冰箱過夜。次日PBS沖洗5 min×3次，滴加二抗(兩步法)，37 ℃孵育30 min，PBS沖洗，DAB顯色，蘇木素復染，脫水，透明，中性樹膠封片，顯微鏡下觀察。Bax、Bcl-2蛋白表達陽性部位在細胞質(zhì)，顯棕黃色。每張標本切片隨機選擇5個高倍視野區(qū)域，計數(shù)陽性細胞數(shù)和總細胞數(shù)，計算陽性表達率。陽性表達率=陽性細胞數(shù)/總細胞數(shù)×100%。

1.3.2 肝細胞凋亡指數(shù)(AI) 石蠟切片常規(guī)脫蠟至水，3%雙氧水甲醇中浸泡10 min，PBS沖洗5 min×3次；蛋白酶K(15 μg/mL)37 ℃溫箱中孵育7 min；20%胎牛血清室溫下封閉20 min；用濾紙吸去殘留液后滴加反應液50 μL(TdT 3 μL，熒光素連接的核苷酸混合緩沖液47 μL，陰性對照片不加TdT)，37 ℃溫箱中孵育45 min，PBS沖洗5 min×3；20%山羊血清室溫下封閉20 min，加POD轉(zhuǎn)換劑(原液1∶2稀釋)，置于37 ℃溫箱中孵育30 min，顯微鏡下DAB顯色，蘇木素復染，脫水，透明，封片。陽性部位在細胞核，顯棕黃色或棕褐色。計數(shù)5個高倍鏡視野下100個肝細胞核中陽性細胞的個數(shù)，取其均值為AI。

2 結果

各組肝組織Bax、Bcl-2蛋白均定位于細胞質(zhì)，染色后呈顆粒狀棕黃色。見插頁Ⅰ圖4、5。與正常對照組比較，肝硬化組AI明顯升高(P<0.05)；與肝硬化組比較，NaHS組Bax表達及AI均明顯降低(P均<0.05)，PPG組Bax表達及AI均明顯升高(P均<0.05)；各組間Bcl-2表達比較差異無統(tǒng)計學意義(P均>0.05)。見表1。

表1 各組肝細胞AI及肝組織Bax、Bcl-2陽性率比較

注：與正常對照組比較，*P<0.05；與肝硬化組比較，#P<0.05。

3 討論

腹腔注射NaHS可改變體內(nèi)H2S含量。早期研究發(fā)現(xiàn)，H2S是一種存在于腦內(nèi)的神經(jīng)遞質(zhì)，對神經(jīng)系統(tǒng)海馬的長時程增強功能具有調(diào)節(jié)作用；隨著研究的深入，人們陸續(xù)發(fā)現(xiàn)其對自發(fā)性高血壓、阿爾茨海默病及肝硬化等疾病均具有調(diào)節(jié)作用。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，H2S在肝硬化的發(fā)生、發(fā)展過程中及調(diào)節(jié)門靜脈壓力方面發(fā)揮重要的保護性作用[5～10]。有報道顯示，H2S作為第三種氣體信號分子與NO、CO氣體信號分子存在相互作用[11]。

肝細胞凋亡是肝臟疾病最重要的發(fā)病原因之一，在正常肝臟發(fā)育及多種肝臟疾病的發(fā)生過程中具有重要作用[12，13]。肝臟在受到損傷因素，如病毒感染、酒精刺激等作用時，原本存在于體內(nèi)的肝細胞死亡程序可能被激活，進而引起肝細胞的程序性死亡(凋亡)，并產(chǎn)生大量的凋亡小體。凋亡小體被肝臟中主要吞噬細胞-枯否細胞吞噬后產(chǎn)生大量的促炎癥因子和凋亡受體，可進一步促進肝細胞的凋亡并能引發(fā)炎癥反應；凋亡小體還可通過以下途徑激活肝星狀細胞：①直接刺激肝星狀細胞的激活；②刺激枯否細胞活化而間接刺激肝星狀細胞的活化；③刺激MMP-2/9活性而間接刺激肝星狀細胞活化；活化后的肝星狀細胞可產(chǎn)生大量的細胞外基質(zhì)及膠原蛋白，最終導致肝纖維化的形成。因此認為，肝細胞病理性凋亡和肝纖維化發(fā)生密切相關，病理性肝細胞凋亡啟動并促進了肝纖維化的發(fā)生。

Bcl-2家族是目前研究較多的凋亡相關基因，其家族成員包括兩類：一類是凋亡促進基因，包括Bax、Bad、Bak等；另一類是以Bcl-2為代表的凋亡抑制基因。Bcl-2蛋白主要分布在線粒體外膜、細胞膜內(nèi)表面、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜及核膜等。Bax的表達更為廣泛，可出現(xiàn)在肝細胞、血管平滑肌細胞等。研究發(fā)現(xiàn)，Bax與Bcl-2的比例(Bax/Bcl-2)關系是決定其對細胞凋亡抑制作用強弱的關鍵因素。有研究表明，H2S可通過影響B(tài)ax的表達發(fā)揮其對心肌缺血再灌注損傷的保護性作用[14]；H2S在肝臟缺血再灌注損傷時通過抑制肝細胞凋亡發(fā)揮其保護性作用[15]。本研究結果顯示，各組肝組織中均有Bax、Bcl-2表達，但Bax陽性率遠高于Bcl-2，表明Bcl-2在肝臟中表達較少，甚至有研究認為其在肝組織中無表達。與肝硬化組比較，NaHS組Bax表達明顯降低，PPG組Bax表達明顯升高；各組間Bcl-2表達比較差異無統(tǒng)計學意義。此外，肝硬化組肝細胞凋亡增加，NaHS組肝細胞凋亡減少，PPG組肝細胞凋亡增加。與正常對照組比較，肝硬化組AI明顯升高；與肝硬化組比較，NaHS組AI明顯降低，PPG組AI明顯升高；進一步證實了上述觀點。

綜上所述，NaHS在大鼠肝硬化的發(fā)生、發(fā)展過程中具有保護性作用，其作用機制可能為下調(diào)Bax表達。

[1] Melnik AV, Voloshchouk NI, Pentyuk NO. Role of hydrogen sulfide and sulfur-containing amino acids in regulation of tone of smooth muscles of the vascular wall in rats[J]. J Neurophysiol, 2010,42(2):104-109.

[2] Chuah SC, Moore PK, Zhu YZ. S-allylcysteine mediates cardioprotection in an acute myocardial infarction rat model via a hydrogen sulfide-mediated pathway[J]. Am Physiol Heart Circ Physiol, 2007,293(5):H2693-H2701.

[3] Sidhapuriwala JN, Ng SW, Bhatia M. Effects of hydrogen sulfide on inflammation in caerulein-induced acute pancreatitis[J]. J Inflamm (Lond), 2009(6):35.

[4] Hirata I, Naito Y, Takagi T, et al. Endogenous hydrogen sulfide is an anti-inflammatory molecule in dextran sodium sulfate-induced colitis in mice[J]. Dig Dis Sci, 2011,56(5):1379-1386.

[5] 張寧，鄭勇，陳衛(wèi)剛，等.內(nèi)源性硫化氫在不同時期大鼠肝硬化中的作用[J].世界華人消化雜，2009，17(3)：307-311.

[6] 何春萍，田德安，王波，等.硫化氫供體對實驗性門靜脈高壓及內(nèi)源性一氧化氮/一氧化氮合酶體系的影響[J].胃腸病學和肝病學雜志，2007，16(6)：572-575.

[7] 陳衛(wèi)剛，鄭勇，宋麗秀，等.內(nèi)源性H2S對大鼠實驗性肝硬化門脈高壓的影響[J].世界華人消化雜志，2011，19(5)：467-471.

[8] 劉維國，鄭勇，李文娟，等.硫化氫對大鼠實驗性肝硬化門靜脈壓力的影響[J].山東醫(yī)藥，2010，50(24)：39-40.

[9] 陳衛(wèi)剛，鄭勇，張寧，等.硫化氫對肝硬化大鼠門靜脈壓力及肝細胞增殖的影響[J].山東醫(yī)藥，2013，53(6)：18-20.

[10] 張寧，鄭勇，李睿，等.不同時期肝硬化大鼠門靜脈血與下腔靜脈血中內(nèi)源性硫化氫的比較[J].石河子大學學報：自然科學版，2009，27(1)：51-54.

[11] 宋麗秀，鄭勇，陳衛(wèi)剛，等.大鼠肝硬化形成中氣體信號分子一氧化氮、一氧化碳對硫化氫/胱硫醚-γ-裂解酶體系的影響[J].現(xiàn)代生物醫(yī)學進展，2010，10(7)：1213-1216.

[12] Kilicarslan A, Kahraman A, Akkiz H, et al. Apoptosis in selected liver diseases[J]. Turk J Gastroenterol, 2009,20(3):171-179.

[13] Guicciardi ME, Gores GJ. Apoptosis as a mechanism for liver disease progresssion[J]. Semin Liver Dis, 2010,30(4):402-410.

[14] 黃曉偉，姚玲玲，朱依純，等.外源性H2S在大鼠心肌缺血再灌注損傷中的作用[J].復旦學報：醫(yī)學版，2008，35(2)：216-219.

[15] 康凱，姜洪池，趙鳴雁，等.胱硫醚-γ-裂解酶/硫化氫系統(tǒng)在大鼠肝臟缺血再灌注損傷中的保護作用[J].中華外科雜志，2010，48(12)：294-298.

國家自然科學基金資助項目(81170402)。

鄭勇(E-mail： zy2850@126.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.44.012

R575.2

A

1002-266X(2016)44-0038-03

2015-11-30)