萬(wàn)古霉素依賴性屎腸球菌的生物學(xué)特性觀察

韓清珍，徐杰，張險(xiǎn)峰，錢(qián)雪峰，章楊，史進(jìn)方，仇惠英

(1蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院臨床檢測(cè)中心，江蘇蘇州215006；2蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院江蘇省血液病研究所)

萬(wàn)古霉素依賴性屎腸球菌的生物學(xué)特性觀察

韓清珍1,2，徐杰1，張險(xiǎn)峰1，錢(qián)雪峰1，章楊1，史進(jìn)方1，仇惠英2

(1蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院臨床檢測(cè)中心，江蘇蘇州215006；2蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院江蘇省血液病研究所)

目的 觀察萬(wàn)古霉素依賴性屎腸球菌(VDEfm-1501)的生物學(xué)特性。方法 1株從1例血液病患者尿液中分離到的依賴萬(wàn)古霉素生長(zhǎng)的VDEfm-1501，先用VITEK 2細(xì)菌鑒定儀對(duì)其進(jìn)行菌種鑒定，之后用PCR法和VITEK MS質(zhì)譜鑒定法對(duì)其進(jìn)一步驗(yàn)證。E-test法檢測(cè)VDEfm-1501萬(wàn)古霉素依賴生長(zhǎng)特性及生長(zhǎng)所需的最低萬(wàn)古霉素濃度；K-B法檢測(cè)VDEfm-1501耐藥性；PCR法檢測(cè)VDEfm-1501耐藥基因；多位點(diǎn)序列分型法對(duì)VDEfm-1501進(jìn)行序列型(ST)分型；PCR法對(duì)VDEfm-1501的D-丙氨酸連接酶基因(ddl基因)進(jìn)行測(cè)序。結(jié)果 隨著VDEfm-1501傳代次數(shù)增多其萬(wàn)古依賴性逐漸減弱，傳至第5代時(shí)這種依賴性不再明顯，第6代時(shí)幾乎完全消失； VDEfm-1501正常生長(zhǎng)至少需要1.0 μg/mL的萬(wàn)古霉素。VDEfm-1501對(duì)氨芐青霉素、慶大霉素及環(huán)丙沙星耐藥，僅對(duì)利奈唑胺和四環(huán)素敏感；VDEfm-1501攜帶慶大霉素耐藥基因[ace(6′)-Ie-aph(2″)-la基因]。VDEfm-1501為耐萬(wàn)古霉素的腸球菌(VRE)ST型，屬于CC17克隆復(fù)合體。VDEfm-1501的ddl基因942 bps位置上插入了“GG”。結(jié)論 VDEfm-1501依賴萬(wàn)古霉素生長(zhǎng)的特性容易丟失，其生長(zhǎng)所需的最低萬(wàn)古霉素濃度為1.0 μg/mL。VDEfm-1501多重耐藥，攜帶耐藥基因ace(6′)-Ie-aph(2")-la基因。VDEfm-1501屬于VRE的ST型。ddl基因942 bps位置上“GG”的插入導(dǎo)致了VDEfm-1501的出現(xiàn)。

腸球菌；耐萬(wàn)古霉素的腸球菌；萬(wàn)古霉素依賴性腸球菌；屎腸球菌；萬(wàn)古霉素依賴性屎腸球菌；萬(wàn)古霉素；替考拉寧

萬(wàn)古霉素依賴性腸球菌(VDE)是指只有在萬(wàn)古霉素、替考拉寧等糖肽類抗生素存在的條件下才能生存的腸球菌，由耐萬(wàn)古霉素的腸球菌(VRE)突變而來(lái)。自1994年全球第1株VDE被報(bào)道以來(lái)[1]，先是美國(guó)、英國(guó)等發(fā)達(dá)國(guó)家報(bào)道[2]檢出VDE；近十幾年來(lái)相繼在印度、巴西等發(fā)展中國(guó)家也分離到了VDE[3,4]；近幾年隨著糖肽類抗生素的廣泛使用，VRE的檢出率不斷上升[5]。但到目前為止在我國(guó)還未見(jiàn)有關(guān)VDE的詳細(xì)報(bào)道。2015年6月，我們從1例血液病患者的尿液中培養(yǎng)分離到了1株依賴萬(wàn)古霉素生長(zhǎng)的屎腸球菌，命名為VDEfm-1501。我們對(duì)這株VDEfm-1501鑒定后，觀察了其物學(xué)特性?，F(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株來(lái)源 VDEfm-1501來(lái)自1例血液病患者的尿液，該患者為51歲女性，患骨髓增生異常綜合征，2015年6月20日因血細(xì)胞三系進(jìn)行性下降由外院轉(zhuǎn)入蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院。該患者入院前因發(fā)熱靜脈滴注亞胺培南11 d、替考拉寧6 d；本次入院后第1天的尿常規(guī)檢查提示白細(xì)胞(109/μL)升高(正常為0～28/μL)，疑為尿路感染，第2天送檢尿培養(yǎng)，同時(shí)靜脈滴注頭孢地嗪和左氧氟沙星、口服制霉素片；6月26日尿常規(guī)檢查結(jié)果恢復(fù)正常后停用左氧氟沙星，制霉素片和頭孢地嗪作為預(yù)防用藥一直沿用至7月15日；6月26日尿培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)了VDEfm-1501。

1.1.2 試劑和儀器 哥倫比亞血瓊脂平板，巧克力血瓊脂平板，MH藥敏試驗(yàn)瓊脂平板，藥敏紙片，自制菌株保藏基質(zhì)，甘油與蒸餾水混合配制15%甘油，核酸提取和純化試劑盒，Taq酶、DNA marker DL2000及其他PCR相關(guān)試劑。PCR引物合成、基因測(cè)序由上海生工生物工程有限公司完成。VITEK 2細(xì)菌鑒定儀，GeneAmp PCR System 9700 PCR儀。

1.2 方法

1.2.1 VDEfm-1501的鑒定及其抗生素敏感性試驗(yàn) 利用VITEK2細(xì)菌鑒定儀對(duì)VDEfm-1501進(jìn)行鑒定，同時(shí)利用K-B法進(jìn)行抗生素敏感性試驗(yàn)，質(zhì)控菌株為金黃色葡萄球菌ATCC25923(紙片擴(kuò)散法藥敏試驗(yàn)的質(zhì)控菌株)。之后，用PCR法和VITEK MS質(zhì)譜鑒定法進(jìn)一步對(duì)VDEfm-1501進(jìn)行驗(yàn)證。PCR簡(jiǎn)要步驟：用PCR試劑盒提取VDEfm-1501的核酸作為模板，借助屎腸球菌(E. faecium)和糞腸球菌(E. faecalis)的特異性鑒定引物用PCR方法進(jìn)一步驗(yàn)證[6]。

1.2.2 VDEfm-1501萬(wàn)古霉素依賴生長(zhǎng)特性及生長(zhǎng)需要的最低萬(wàn)古霉素濃度觀察 挑取VDEfm-1501菌落，配備0.5麥?zhǔn)蠞岫鹊木海坎挤▽⑵浣臃N于MH藥敏試驗(yàn)瓊脂平板，貼萬(wàn)古霉素紙片驗(yàn)證其萬(wàn)古霉素依賴生長(zhǎng)特性，并觀察傳代第3、4、5、6次的VDEfm-1501是否依然聚集在萬(wàn)古霉素紙片周圍生長(zhǎng)，判斷其萬(wàn)古霉素依賴生長(zhǎng)特性的穩(wěn)定性；同時(shí)利用萬(wàn)古霉素E-test紙條檢測(cè)VDEfm-1501生長(zhǎng)需要的最低萬(wàn)古霉素濃度。

1.2.3 VDEfm-1501耐藥性觀察及耐藥基因檢測(cè) K-B法檢測(cè)VDEfm-1501耐藥性，參照 CLSI 2015抗菌藥物敏感性試驗(yàn)紙片法執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)初步判定其耐藥情況。采用PCR法檢測(cè) VDEfm-1501的耐藥基因，包括糖肽類耐藥基因(vanA、vanB基因)、慶大霉素耐藥基因[(ace(6′)-Ie-aph(2″)-la基因]、四環(huán)素類耐藥基因(tetM基因)和金黃色葡萄球菌β-內(nèi)酰胺酶類耐藥基因(tem基因)[7]。

1.2.4 VDEfm-1501的分型 采用多位點(diǎn)序列分型(MLST)法。提取VDEfm-1501基因組DNA，PCR法分別擴(kuò)增7個(gè)管家基因，即腺苷酸激酶基因(adk基因)、ATP合成酶α亞基基因(atpA基因)、D-丙氨酸連接酶基因(ddl基因)、6-磷酸葡萄糖脫氫酶基因(gdh基因)、3-磷酸甘油醛脫氫酶基因(gyd基因)、磷酸腺苷結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)體基因(pstS基因)、磷酸核糖胺咪唑羧化酶基因(purk基因)[8]。PCR產(chǎn)物雙向測(cè)序，產(chǎn)物序列與屎腸球菌MLST數(shù)據(jù)庫(kù)(http://efaecium.mlst.net/)數(shù)據(jù)比對(duì)，依次獲得等位基因號(hào)、序列型(ST)。

1.2.5 VDEfm-1501的ddl基因突變分析 以Enterococcus faecium DO(NC_017960.1，VRE)基因組序列為參考，在ddl基因編碼框外側(cè)設(shè)計(jì)特異性引物ddl-O-F(5′-TGAACGATTTAGAATACAG-3′)、ddl-O-R(5′-ACGCAATCACTCCAGCCTC-3′)，以提取的VDEfm-1501 DNA為模板，擴(kuò)增ddl基因(1 141 bps)，PCR產(chǎn)物雙向測(cè)序，產(chǎn)物序列與美國(guó)國(guó)立生物信息中心數(shù)據(jù)庫(kù)(https://blast.ncbi.nlm.nihgov/Blast.cgi)數(shù)據(jù)比對(duì)。PredictProte(https://www.predictprotein.org/)生物信息軟件預(yù)測(cè)ddl蛋白的結(jié)構(gòu)。

2 結(jié)果

2.1 VDEfm-1501的鑒定結(jié)果 患者尿液接種過(guò)夜后，在血平板上發(fā)現(xiàn)了二十幾個(gè)類似腸球菌的菌落，VITEK 2鑒定為屎腸球菌，K-B法藥物敏感性試驗(yàn)顯示該菌圍繞萬(wàn)古霉素和替考拉寧紙片聚集生長(zhǎng)，遠(yuǎn)離這兩種紙片的部位幾乎無(wú)該菌生長(zhǎng)。PCR法和VITEK MS質(zhì)譜鑒定儀鑒定結(jié)果均為屎腸球菌。

2.2 VDEfm-1501萬(wàn)古霉素依賴生長(zhǎng)特性及生長(zhǎng)需要的最低萬(wàn)古霉素濃度 VDEfm-1501在普通血平板上生長(zhǎng)很差，菌落小且分布稀疏；VDEfm-1501在含萬(wàn)古霉素的巧克力平板上可以正常生長(zhǎng)；VDEfm-1501在MH藥敏平板上只圍繞萬(wàn)古霉素或者替考拉寧紙片生長(zhǎng)。在缺少萬(wàn)古霉素的血平板上，隨著傳代次數(shù)增加，VDEfm-1501的萬(wàn)古依賴性逐漸減弱；傳至第3代時(shí)菌落主要圍繞萬(wàn)古霉素和替考拉寧紙片周圍生長(zhǎng)，在遠(yuǎn)離紙片處只有稀疏的菌落；傳至第4代時(shí)仍然可以看出萬(wàn)古霉素紙片周圍菌落密度高于遠(yuǎn)離紙片的部位，第5代時(shí)這種特性不再明顯，第6代時(shí)這種特性幾乎完全失去，在缺少萬(wàn)古霉素的條件下VDEfm-1501可以正常生長(zhǎng)。VDEfm-1501正常生長(zhǎng)至少需要1.0 μg/mL的萬(wàn)古霉素。

2.3 VDEfm-1501的耐藥性及其耐藥基因 VDEfm-1501除了對(duì)糖肽類抗生素萬(wàn)古霉素和替考拉寧耐藥外，同時(shí)對(duì)多種抗生素(包括青霉素類的氨芐青霉素、氨基糖苷類的慶大霉素以及第三代喹諾酮類的環(huán)丙沙星)耐藥，僅對(duì)利奈唑胺和四環(huán)素敏感。VDEfm-1501屬于vanA型VRE，同時(shí)攜帶耐藥基因ace(6′)-Ie-aph(2″)-la基因(見(jiàn)圖1)。

注：aph即ace(6′)-Ie-aph(2″)-la基因

圖1 VDEfm-1501耐藥基因PCR產(chǎn)物電泳圖

2.4 VDEfm-1501分型 VDEfm-1501的7個(gè)管家基因atpA、ddl、gdh、purk、gyd、pstS、adk基因的等位基因號(hào)分別為15、1、1、1、1、1、1，ST型為ST78，是VRE常見(jiàn)的ST型，屬于CC17克隆復(fù)合體。

2.5 VDEfm-1501的ddl基因突變情況 與Enterococcus faecium DO參考基因組相比，VDEfm-1501的ddl基因在942 bps處有一個(gè)“GG”插入，“GG”的插入導(dǎo)致ddl蛋白在C端發(fā)生了一個(gè)16個(gè)氨基酸移碼和28個(gè)氨基酸缺失的突變(見(jiàn)圖2)。

圖2 VDEfm-1501 的ddl基因突變(A)和預(yù)測(cè)ddl蛋白的結(jié)構(gòu)(B)

3 討論

由于VRE的泛耐藥性、缺少有效藥物以及復(fù)雜的耐藥機(jī)制，造成治療手段非常有限[9]。而VDE的出現(xiàn)給腸球菌感染的診斷和治療帶來(lái)了更大的困難和挑戰(zhàn)。國(guó)內(nèi)萬(wàn)古霉素、替考拉寧等糖肽類抗生素的使用非常普遍，很容易導(dǎo)致萬(wàn)古霉素敏感型腸球菌(VSE)到VRE及VDE的突變。VDE的發(fā)現(xiàn)有兩種途徑：一是在利用含萬(wàn)古霉素的培養(yǎng)基進(jìn)行VRE篩查過(guò)程中發(fā)現(xiàn)[4]；二是在普通血平板(不含萬(wàn)古霉素)中偶然分離到幾個(gè)稀疏分布、長(zhǎng)勢(shì)很差的疑似腸球菌菌落，在后續(xù)的K-B紙片擴(kuò)散法進(jìn)行耐藥性檢測(cè)時(shí)發(fā)現(xiàn)菌落只圍繞萬(wàn)古霉素紙片生長(zhǎng)，而在普通血平板中繼續(xù)傳代培養(yǎng)非常難，仔細(xì)鑒定后確定為VDE[1]。VDEfm-1501的發(fā)現(xiàn)過(guò)程即屬于第二種情況，可能是在患者尿液中殘留的萬(wàn)古霉素幫助下，我們才能在原始平板中分離到幾個(gè)長(zhǎng)勢(shì)較差的菌落，又得益于K-B紙片擴(kuò)散法才發(fā)現(xiàn)其圍繞萬(wàn)古霉素紙片生長(zhǎng)的特性。但是，在國(guó)內(nèi)很多大型醫(yī)院的微生物診斷室傾向用MIC法檢測(cè)細(xì)菌耐藥性，即使恰巧分離到幾個(gè)VDE菌落，如果沒(méi)有相關(guān)的知識(shí)和相應(yīng)的技術(shù)很容易失去檢出VDE的機(jī)會(huì)。

VDE感染的實(shí)驗(yàn)室診斷很明確，在萬(wàn)古霉素存在條件下才能正常生長(zhǎng)的營(yíng)養(yǎng)缺陷型腸球菌即可鑒定為VDE，但在接種、分離、鑒定過(guò)程中要注意以下幾點(diǎn)：①對(duì)血液科、ICU等科室所有送檢的細(xì)菌培養(yǎng)標(biāo)本，要常規(guī)接種含萬(wàn)古霉素的巧克力平板及進(jìn)行萬(wàn)古霉素紙片試驗(yàn)；②對(duì)近期有萬(wàn)古霉素使用史的患者和應(yīng)用萬(wàn)古霉素治療無(wú)效的患者的標(biāo)本，如分離到少量腸球菌，不能主觀判斷為非致病菌或污染菌而失去檢出VDE的機(jī)會(huì)，因?yàn)閂DE有時(shí)候可能在標(biāo)本殘留的萬(wàn)古霉素作用下少量生長(zhǎng)，本研究中的VDEfm-1501在患者尿液中檢測(cè)到的數(shù)量?jī)H為4 000 cfu/mL，遠(yuǎn)小于有臨床意義的105cfu/mL，很容易漏檢；③VDE屬于較難培養(yǎng)的缺陷型細(xì)菌，使用快速生化儀和傳統(tǒng)的生化反應(yīng)鑒定菌種，以及使用紙片法或者M(jìn)IC法進(jìn)行耐藥性檢測(cè)時(shí)，均要添加萬(wàn)古霉素或者D-alanine-D-alanine[1]，有條件的實(shí)驗(yàn)室可以使用質(zhì)譜法或PCR法進(jìn)行菌種鑒定。

我們分離的這株VDEfm-1501為ST78，屬于常見(jiàn)的CC17克隆復(fù)合體，蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院中流行的VRE也是這個(gè)克隆群，推測(cè)VDEfm-1501可能是由VRE突變而來(lái)。VDE仍有很強(qiáng)的致病性，且仍保留了范耐藥性，不易根除。VDEfm-1501攜帶膠質(zhì)黏附素基因(acm基因)和明膠酶基因(gelE基因)兩個(gè)毒力基因，同時(shí)對(duì)青霉素類、氨基糖苷類、喹諾酮類等多種抗生素耐藥，直接證實(shí)了VDE的潛在致病性和泛耐藥性。但VDE感染的治療對(duì)策與VRE不同，一旦確診應(yīng)立即停止使用萬(wàn)古霉素等糖肽類抗生素[10]。本株VDEfm-1501來(lái)源者停用替考拉寧后尿路感染得到控制，其后續(xù)標(biāo)本中未再檢出腸球菌。僅停用萬(wàn)古霉素是否合理還需要更多研究證實(shí)，因?yàn)榘╒DEfm-1501在內(nèi)的VDE很容易突變回VRE，患者有可能是VRE和VDE的混合感染，或者交替感染[11]。對(duì)此有學(xué)者[12]建議停用萬(wàn)古霉素的同時(shí)，還要根據(jù)菌種和感染部位適當(dāng)選用利奈唑胺、達(dá)托霉素和奎奴普汀。

萬(wàn)古霉素主要是通過(guò)與肽聚糖前體末端的D-alanine-D-alanine結(jié)合而抑制腸球菌細(xì)胞壁的合成。VRE因?yàn)殡木厶乔绑w的D-alanine-D-alanine被其他形式(如D-alanyl-D-lactate，vanA型VRE)取代，使其與糖肽類抗生素親和力下降而產(chǎn)生耐藥。VSE只能合成正常的末端為D-alanine-D-alanine的肽聚糖，VRE不僅能合成以D-alanyl-D-lactate為末端的替代形式的肽聚糖，也保留了合成正常肽聚糖的能力，因此VRE在有無(wú)萬(wàn)古霉素的條件下都可以生長(zhǎng)。VDE菌株合成D-丙氨酸連接酶的ddl基因發(fā)生了突變，失去了合成正常肽聚糖前體的能力，只能依賴萬(wàn)古霉素誘導(dǎo)形成的另一種連接酶(vanA 或 vanB)合成以D-alanyl-D-lactate為末端的替代形式的肽聚糖。所以從VRE到VDE主要是由于ddl基因突變導(dǎo)致D-alanine-D-alanine 連接酶功能受損[4, 11～13]。VDEfm-1501的ddl基因一個(gè)“GG”的插入，引起DDL蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)、螺旋、疏水性、結(jié)構(gòu)域等發(fā)生改變，喪失了原有功能，從而導(dǎo)致萬(wàn)古霉素耐藥表型的改變，變成VDE。

從VSE到VRE到VDE的發(fā)展，無(wú)疑是在糖肽類抗生素作用下發(fā)生的，但在臨床感染病例中，腸球菌是惟一一種呈現(xiàn)依賴抗生素生長(zhǎng)特性的細(xì)菌，所以要重視VRE和VDE的防控。隨著萬(wàn)古霉素等糖肽類抗生素應(yīng)用越來(lái)越多，國(guó)內(nèi)可能會(huì)有更多VDE出現(xiàn)，這對(duì)腸球菌感染的實(shí)驗(yàn)室診斷和治療提出了挑戰(zhàn)。

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Biological characteristics of vancomycin-dependent enterococcus faecium

HANQingzhen1,XUJie,ZHANGXianfeng,QIANXuefeng,ZHANGYang,SHIJinfang,QIUHuiying

(1ClinicalTestingCenter,theFirstAffiliatedHospitalofSoochowUniversity,Suzhou215006,China)

Objective To observe the biological characteristics of a vancomycin-dependent enterococcus faecium (VDEfm-1501).Methods A strain of VDEfm-1501 was isolated from an urine specimen of a woman with blood system disease and was identified by VITEK 2, followed by PCR and VITEK MS. The VDEfm-1501 vancomycin-dependent growth characteristics and the minimum vancomycin concentration required for growth were tested by E-test. Its antibiotic resistance was analyzed by K-B disc diffusion. Drug resistance and virulence genes were amplified by PCR. The multilocus sequence typing (MLST) was applied in the sequence typing. Ddl sequencing of VDEfm-1501 was detected by PCR. Results VDEfm-1501 could only grow on the presence of 1.0 μg/mL vancomycin at least, but such characteristic could weaken with the increase of passage times, and no vancomycin-dependence was found in the sixth passage. VDEfm-1501 showed multi-drug resistance except linezolid and tetracycline, and carried resistant gene of ace(6')-Ie-aph(2")-la. VDEfm-1501 belonged to clonal complex 17 (CC17), which was the cause of most of the nosocomial VRE outbreaks globally. And its vancomycin dependence seemed to be associated with the insertion of 'GG' at nucleotide position 942 of the ddl gene.Conclusions The growth of VDEfm-1501 needs at least 1 μg/mL vancomycin, but such dependence is easy to lose. VDEfm-1501 displays multi-drug resistance and carrys the resistant gene of ace(6')-Ie-aph(2")-la. VDEfm-1501 belongs to ST of VRE. The insertion of 'GG' leads to the emergence of VDEfm-1501.

enterococcus; vancomycin-resistant enterococci; vancomycin-dependent enterococci; enterococcus faecium; vancomycin-dependent enterococcus faecium; vancomycin; teicoplanin

國(guó)家自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81501425)；江蘇省蘇州市“科教興衛(wèi)”青年科技項(xiàng)目(kjxw2014008)。

韓清珍(1984-)，女，助理研究員，主管檢驗(yàn)師，主要研究方向?yàn)楦腥拘约膊〉膶?shí)驗(yàn)室診斷。E-mail: gyhqz02@163.com

簡(jiǎn)介：仇惠英(1966-)，女，主任醫(yī)師，主要研究方向?yàn)檠翰〉脑\治及血液病患者感染的防治。E-mail: qiuhuiying@aliyun.com

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.43.008

R446.5

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1002-266X(2016)43-0026-04

2016-07-06)