大劑量糖皮質激素應用過程中早期給予ACTH大鼠下丘腦-垂體-腎上腺軸的功能及病理變化

楊麗瀟，張碧麗，王文紅

(1天津醫(yī)科大學研究生院，天津300070；2天津市兒童醫(yī)院)

大劑量糖皮質激素應用過程中早期給予ACTH大鼠下丘腦-垂體-腎上腺軸的功能及病理變化

楊麗瀟1，張碧麗2，王文紅2

(1天津醫(yī)科大學研究生院，天津300070；2天津市兒童醫(yī)院)

目的 觀察大劑量糖皮質激素(GC)應用過程中早期給予促腎上腺皮質激素(ACTH)大鼠下丘腦-垂體-腎上腺(HPA)軸的功能及病理變化。方法 將30只健康雄性Wistar大鼠隨機分為正常組、對照組和治療組，每組10只。正常組予蒸餾水灌胃2周，對照組和治療組用大劑量醋酸潑尼松水溶液灌胃2周；之后治療組加用ACTH皮下注射2周，其余兩組灌胃方法不變。分別于實驗開始時、實驗滿2周時、實驗滿4周時測定大鼠血清皮質醇及ACTH；實驗滿4周時處死各組大鼠，測大鼠垂體、腎上腺質量并觀察其病理形態(tài)，計算大鼠臟器指數。結果 實驗開始時各組大鼠血清皮質醇及ACTH水平相近(P均>0.05)。實驗滿2周時，對照組和治療組大鼠血清皮質醇及ACTH水平相近(P均>0.05)。實驗滿4周時，治療組大鼠血清皮質醇和ACTH水平較對照組升高(P均<0.05)，且垂體和腎上腺的質量及其臟器指數也較對照組升高(P均<0.05)。實驗滿4周時，各組大鼠垂體遠側部未見明顯改變；正常組大鼠腎上腺皮質束狀帶結構清晰，對照組較正常組束狀帶變薄且結構紊亂；治療組與對照組相比束狀帶增厚、細胞核增多，但較正常組結構排列紊亂。結論 大劑量GC應用過程中早期給予ACTH可減輕GC對大鼠HPA軸的抑制作用，促進其皮質醇和ACTH的分泌，促進其垂體和腎上腺的增生，并能明顯改善其腎上腺皮質的萎縮情況。

促腎上腺皮質激素；糖皮質激素；下丘腦-垂體-腎上腺軸；原發(fā)性腎病綜合征；動物實驗

兒童原發(fā)性腎病綜合征(PNS)的主要治療藥物是糖皮質激素(GC)，尤其是頻繁復發(fā)和激素依賴的PNS需要通過延長GC療程或加用細胞毒藥物、免疫抑制劑治療，導致不良反應嚴重[1，2]。患兒長期使用大劑量外源性GC，可出現下丘腦-垂體-腎上腺(HPA)軸抑制，這是PNS出現頻繁復發(fā)和激素依賴的重要機制之一[3]。新近研究[4]發(fā)現，根據血清皮質醇、促腎上腺皮質激素(ACTH)水平可以在一定程度上預測激素敏感型PNS的復發(fā)風險。ACTH是由腦垂體分泌的一種多肽類激素，有類糖皮質激素樣作用，在皮質功能尚存時可刺激腎上腺皮質分泌皮質醇，對HPA軸功能有一定的調節(jié)作用。我們推測，早期補充外源性ACTH，有望減輕大劑量GC對大鼠HPA軸的抑制作用，減少不良反應的發(fā)生。2016年4月1日～6月1日，我們通過實驗觀察了大劑量GC應用過程中早期給予ACTH大鼠HPA軸的功能及病理變化。現將結果報告如下。

1 材料與方法

1.1 藥物、動物及試劑 醋酸潑尼松片(5 mg/片)，ACTH1-39(10 mg/支)。健康雄性Wistar大鼠30只，SPF級，日齡(40±5)d。皮質醇檢測試劑盒，ACTH檢測試劑盒。

1.2 方法

1.2.1 大鼠分組 30只雄性Wistar大鼠適應性喂養(yǎng)3 d，按照隨機數字表法將其隨機分為正常組、對照組和治療組，每組10只。

1.2.2 藥物配制及給藥方法 實驗開始時，正常組大鼠每日1次予4 mL/kg蒸餾水灌胃2周；對照組、治療組每日1次予大劑量(12.5 mg/kg，相當于兒童2 mg/kg)醋酸潑尼松水溶液灌胃，共2周[5]。實驗第3周起，正常組灌胃方法同前；對照組繼續(xù)每日1次予大劑量醋酸潑尼松水溶液灌胃2周；治療組在大劑醋酸潑尼松水溶液灌胃后每日1次皮下注射ACTH 200 μg/kg，共2周。本實驗共4周，清晨8時前灌胃、皮下注射完畢。實驗期間，每3 d稱大鼠體質量1次，以調整藥物用量。實驗過程中大鼠自由進食及飲水，觀察各組大鼠的生長發(fā)育、外觀、反應性、活動性、食欲、攝食量及體質量變化。

1.2.3 各組大鼠血清皮質醇及ACTH測定 分別于實驗開始時、實驗滿2周時、實驗滿4周時，在醋酸潑尼松水溶液灌胃前，于大鼠內眥取血約2 mL，高速離心后，測定血清皮質醇及ACTH。

1.2.4 各組大鼠垂體、腎上腺質量檢測及病理形態(tài)觀察 實驗滿4周時，將各組大鼠稱重后斷頭處死，迅速摘取其垂體和雙側腎上腺(去除腎上腺被膜周圍的脂肪及結締組織)，稱重后將其固定于10%甲醛溶液中，切片、HE染色后觀察病理形態(tài)。同時計算大鼠臟器指數(臟器質量/大鼠體質量)。

2 結果

實驗開始時，各組大鼠生長發(fā)育良好，皮毛光亮，反應靈敏，活動靈活。實驗過程中，正常組大鼠生長發(fā)育較快，皮毛有光澤，反應靈敏，活動敏捷，體質量增長穩(wěn)定；對照組大鼠生長發(fā)育較差，毛發(fā)無光澤、蓬亂、容易脫落，反應遲鈍，腰腹部肥胖，四肢消瘦明顯；治療組大鼠生長發(fā)育尚可，毛發(fā)稍有光澤，反應稍遲鈍，體質量增長緩慢。各組大鼠均無感染、死亡。

2.1 各組大鼠血清皮質醇及ACTH水平比較 實驗過程中不同時間點各組大鼠血清皮質醇及ACTH水平比較見表1。

2.2 各組大鼠體質量、垂體和腎上腺質量、臟器指數比較 實驗滿4周時各組大鼠體質量、垂體和腎上腺質量、臟器指數比較見表2。

2.3 各組大鼠腎上腺和垂體的病理變化 實驗滿4周時，各組大鼠垂體遠側部未見明顯改變。實驗滿4周時，正常組大鼠腎上腺皮質球狀帶、束狀帶、網狀帶及髓質結構顯示清楚，排列整齊(圖1A)；對照組腎上腺皮質束狀帶萎縮明顯，結構紊亂消失、輪廓模糊不清(圖1B)；治療組腎上腺皮質束狀帶與對照組相比有不同程度的增生，可見該區(qū)細胞核增多明顯，但結構較正常組紊亂(圖1C)。

表1 不同時間點各組大鼠血清皮質醇、ACTH水平比較

注：與正常組相比，aP<0.05；與對照組相比，bP<0.05；與實驗開始時相比，cP<0.05；與實驗滿2周時相比，dP<0.05。

表2 實驗滿4周時各組大鼠體質量、垂體及腎上腺質量和臟器指數比較( x±s)

注：與正常組相比，aP<0.05；與對照組相比，bP<0.05。

注：A為正常組，B為對照組，C為治療組。

圖1 大鼠腎上腺病理圖像(HE染色)

3 討論

目前GC仍然是PNS的一線治療藥物，但是長期大劑量使用GC出現的一系列不良反應[6]引起了學者們的重視，尤其是GC對患兒HPA軸抑制的研究日漸增多。國內研究[7]發(fā)現，不同中效GC對非頻繁復發(fā)PNS患兒血清皮質醇水平有影響，其中潑尼松對垂體功能的抑制作用較曲安西龍及甲潑尼龍持久。臨床上ACTH已用于慢性濕疹[8]、嬰兒痙攣[9～11]、晶狀體性關節(jié)炎[12]等疾病的治療，并有很好的療效，且比較安全。近年ACTH在治療腎病中的研究也較多，如在特發(fā)性膜性腎小球腎炎[13]、局灶節(jié)段性腎小球硬化(FSGS)[14]和免疫抑制劑治療失敗的難治性腎病[15]及其他腎小球疾病[16]中的應用呈現了一定的治療效果。因此，ACTH減輕GC對HPA軸的抑制作用，為臨床PNS患兒GC應用中減少頻繁復發(fā)和激素依賴的發(fā)生率是有意義的。

文獻[17,18]報道非頻繁復發(fā)PNS患兒在GC誘導緩解期即大劑量GC持續(xù)應用的過程中，血清皮質醇水平下降明顯，對HPA軸有明顯的抑制作用，這是PNS患兒出現頻繁復發(fā)和激素依賴的重要原因之一。在本研究中，實驗滿2周時，與正常組相比，對照組和治療組大鼠的血清皮質醇及ACTH水平明顯降低，且與同組實驗開始時相比亦明顯降低，表明大劑量的醋酸潑尼松應用早期對大鼠HPA軸就有明顯的抑制作用。實驗滿4周時，即ACTH治療2周后，治療組大鼠的血清皮質醇及ACTH水平明顯高于對照組，且較治療前升高明顯；治療組大鼠的垂體、腎上腺質量及臟器指數與對照組相比升高亦有統(tǒng)計學意義；病理檢查結果顯示，與對照組相比，治療組大鼠腎上腺皮質束狀帶增生明顯。ACTH治療過程中無明顯不良反應。上述結果表明ACTH應用2周即可明顯促進大鼠內源性皮質醇和ACTH的分泌，在一定程度上促進垂體和腎上腺的增生，并且能夠改善腎上腺皮質束狀帶的萎縮情況。研究[19]發(fā)現，PNS頻繁復發(fā)及激素依賴患兒應用ACTH有一定療效，可避免長期GC治療的不良反應，其機制可能與ACTH減輕GC對HPA軸的抑制作用有關。因此，臨床上在應用大劑量GC治療PNS早期即給予ACTH，可能會降低PNS患兒頻復發(fā)和激素依賴的發(fā)生率。

本研究對大鼠垂體的病理觀察不是很理想，這可能與實驗的周期較短，垂體病理改變不顯著有關。另外，實驗結束時治療組大鼠的體質量與對照組相比增長不明顯，這可能與ACTH減輕大劑量GC的不良反應、抑制脂肪的合成和重新分布有關。

總之，本研究從功能和形態(tài)兩方面進行觀察，發(fā)現大劑量GC應用過程中早期給予ACTH能夠促進大鼠垂體及腎上腺皮質束狀帶的增生和分泌，減輕大劑量GC對大鼠HPA軸的抑制作用。今后可進一步以PNS患兒作為觀察對象進行相關研究。

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Functional and pathological changes of HPA axis of rats in the early-stage application of ACTH during the process of using a large dose of glucocorticoid

YANGLixiao1,ZHANGBili,WANGWenhong

(1GraduateSchoolofTianjinMedicalUniversity,Tianjin300070,China)

Objective To observe the functional and pathological changes of hypothalamic-pituitary-adrenal (HPA) axis of rats in the early-stage application of adrenocorticotropic hormone (ACTH) during the process of using a large dose of glucocorticoid (GC).Methods Thirty male Wistar rats were randomly divided into the normal group, control group and ACTH treatment group, 10 rats in each group. Rats of the normal group were given distilled water by gavage for 2 weeks. Rats of the control group and ACTH treatment group were treated with high dose of prednisone acetate in aqueous solution by gavage for 2 weeks. After that, the ACTH treatment group was treated with subcutaneous injection of ACTH for 2 weeks, and the other two groups were treated with the same treatment as before. The levels of cortisol and ACTH in serum were measured respectively at the beginning of the experiment, at the end of 2 and 4 weeks after the experiment. When the experiment was over 4 weeks, the rats were killed, the quality of the pituitary and adrenal glands were measured, the pathological changes were observed, and organ index was calculated.Results At the beginning of the experiment, there was no difference in the serum cortisol and ACTH between the groups (P>0.05). At the end of 2 weeks after the experiment, there was no significant difference in serum cortisol and ACTH between the control group and the ACTH treatment group (P>0.05). At the end of 4 weeks after the experiment, the serum cortisol and ACTH levels in the ACTH treatment group were higher than those in the control group (allP<0.05), and the quality of pituitary, adrenal gland and organ index were higher than those of the control group (allP<0.05). At the end of 4 weeks after the experiment, no significant changes were found in the distal part of the pituitary of rats in each group. And the structure of adrenal cortex zona of rats in the normal group was clear. The structure of adrenal cortex zona of the control group was thinning and disordered as compared with that of the normal group. The structure of adrenal cortex zona of the ACTH treatment group was thickening and the nucleus increased at different degrees as compared with that of the control group, but it arranged in disorder as compared with that of the normal group.Conclusion Early application of ACTH in the process of using high dose GC can reduce the inhibitory effect of GC on HPA axis in rats, accelerate the adrenal cortex zona secretion, promote the proliferation of pituitary and adrenal gland, and improve the adrenal cortex zona atrophy in pathology significantly.

adrenocorticotropic hormone; glucocorticoid; hypothalamic-pituitary-adrenal axis; primary nephrotic syndrom; animal experiment

天津市中醫(yī)藥管理局中醫(yī)、中西醫(yī)結合科研專項基金資助項目(13127)。

楊麗瀟(1988-)，女，碩士研究生在讀，主要研究方向為兒科學。E-mail： 15369313972@163.com

簡介：張碧麗(1959-)，女，主任醫(yī)師，主要研究方向為小兒腎臟疾病。Email： zhangbili218@163.com

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.43.007

R725

A

1002-266X(2016)43-0022-04

2016-05-14)