黑麥CenH3基因克隆及其在小麥1BL/1RS易位染色體中的定位

李亞莉，聶園軍，楊 峰，孫 玉，董艷輝，任永康，唐朝暉

（1.山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究中心，山西太原030031；2.中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所，北京100101；3.山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)資源與經(jīng)濟研究所，山西太原030006；4.山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院小麥研究所，山西臨汾041000；5.山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所，山西太原030031）

黑麥CenH3基因克隆及其在小麥1BL/1RS易位染色體中的定位

李亞莉1，2，聶園軍3，楊 峰4，孫 玉5，董艷輝1，任永康5，唐朝暉1

（1.山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究中心，山西太原030031；2.中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所，北京100101；3.山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)資源與經(jīng)濟研究所，山西太原030006；4.山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院小麥研究所，山西臨汾041000；5.山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所，山西太原030031）

黑麥屬蘊藏著豐富的遺傳變異和改良小麥品質(zhì)的優(yōu)良基因，將其導(dǎo)入小麥能夠拓寬小麥的遺傳基礎(chǔ)、豐富小麥的遺傳變異。研究采用分子克隆技術(shù)獲得黑麥CenH3基因的部分片段，并進行探針標記；同時，利用基因組原位雜交技術(shù)，篩選出32份1BL/1RS易位系；應(yīng)用FISH技術(shù)，檢測篩選出的32份1BL/1RS易位系，所有1BL/1RS易位系材料中均未發(fā)現(xiàn)黑麥CenH3基因的信號。但是，應(yīng)用小麥和黑麥特異著絲粒DNA序列進行FISH檢測，2個信號均出現(xiàn)在所有被檢測的1BL/1RS易位系材料中。說明1BL/1RS易位染色體在不同小麥背景和山羊草屬背景中均能穩(wěn)定遺傳，1RS的著絲粒DNA序列對1BS的著絲粒DNA序列有很好的補償性，與小麥CenH3蛋白相互作用指導(dǎo)易位染色體正確分離且穩(wěn)定遺傳。

黑麥；CenH3基因；熒光原位雜交；1BL/1RS易位系

在六倍體小麥的育種研究中，小麥的近緣種屬是改良小麥品種的一個巨大基因庫，將這些優(yōu)良基因?qū)肫胀ㄐ←?，對小麥的遺傳學(xué)研究和育種工作都具有重要的意義。黑麥屬作為小麥的三級基因源，蘊藏著豐富的遺傳變異和改良小麥品質(zhì)的優(yōu)良基因，育種學(xué)家通過創(chuàng)制附加系、代換系和易位系等育種材料，已成功地將黑麥的這些抗性和豐產(chǎn)性基因?qū)胄←溨小Ｆ渲?，小?黑麥1BL/1RS易位系應(yīng)用最為廣泛，通過1RS易位到小麥染色體中，將其攜帶的Lr26，Sr31，Yr9，Pm8等抗病性、豐產(chǎn)性和適應(yīng)性相關(guān)的基因?qū)氲叫←溒贩N中[1]，同時1RS在能夠很好地補償1BS缺失引起的負效應(yīng)[2]，成為迄今為止世界范圍內(nèi)應(yīng)用最成功的易位系[3]。但是，目前許多推廣品種中，1RS臂上的抗性基因逐漸喪失抗性，且易位系攜帶的黑麥堿基因又導(dǎo)致小麥品質(zhì)下降。因此，創(chuàng)制抗性和品質(zhì)優(yōu)良的小麥-黑麥新易位系是擺在小麥育種工作者面前的首要任務(wù)[4]。

植物著絲粒指染色體主縊痕處的特殊分化區(qū)域，主要由富含重復(fù)序列的異染色質(zhì)組成。這些高度甲基化的DNA序列與蛋白質(zhì)形成的著絲粒動粒蛋白復(fù)合體直接參與細胞分裂過程。因此，著絲粒對染色體遺傳和基因組穩(wěn)定具有重要作用[5]。在細胞有絲分裂和減數(shù)分裂過程中，著絲粒區(qū)特異的組蛋白H3變體（植物中稱為CENH3，動物中稱為CENPA）與動粒蛋白結(jié)合，在紡錘絲的牽引下正確移動至細胞兩極。CenH3是較早發(fā)現(xiàn)的功能著絲粒的基本蛋白質(zhì)，其與典型組蛋白H3的分子序列和蛋白結(jié)構(gòu)差異較大，即使在親緣關(guān)系密切的近緣種之間，尤其在N末端的長度和氨基酸組成方面存在顯著差異[6-7]。CenH3蛋白不僅能導(dǎo)致細胞有絲分裂的紊亂，而且還和外源染色體在寄主基因組中的去留有著千絲萬縷的聯(lián)系，在大麥×球莖大麥[8]和小麥×玉米[9]研究中均發(fā)現(xiàn)，由于父本CenH3蛋白在合子中失活導(dǎo)致有絲分裂錯誤。除了這些著絲粒特異的組蛋白，還有另一類著絲粒DNA分子，這些DNA分子序列保守性很低，其類型和排列方式基本相似，一般由夾雜排列的衛(wèi)星DNA串聯(lián)重復(fù)陣列（tandemrepeat，R）和著絲粒專一的反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子（centromereretrotransposons，CRs）構(gòu)成。著絲粒DNA序列雖然功能上高度保守，但在序列水平上卻高度不保守，這成為著絲粒研究中的一個未解之謎[10]。著絲粒反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子能夠定位包含CenH3的核小體的分布方式[11]，甚至在CenH3失活或者缺失時，染色體依然能正常分離[12]，推測著絲粒反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子起主要作用，這種推測在隨后關(guān)于Holocentricity的研究中得到證實，在動物和植物中都發(fā)現(xiàn)，部分物種中著絲粒缺失CenH3，但著絲粒還能正常行使其功能，正是由于密集分布的反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子替代CenH3的功能協(xié)助染色體正確分離[13]。

本研究利用黑麥KingII和不同的小麥背景和山羊草屬背景的1BL/1RS易位系為研究材料，克隆了黑麥的CenH3基因的部分片段，應(yīng)用順序熒光原位雜交（Fluorescence in situ hybridization,FISH）分析，發(fā)現(xiàn)在所檢測的32份1BL/1RS易位系中，均未檢測到黑麥的CenH3基因信號，但檢測到黑麥的著絲粒特異重復(fù)序列，初步探討該易位染色體不僅將黑麥的整臂易位過來，著絲粒區(qū)域也有黑麥的DNA序列，在易位染色體的正確分離中，小麥的CenH3可能起了重要的作用，這些分子和細胞學(xué)方面的實驗結(jié)果可為進一步探討該易位染色體在不同小麥背景中的穩(wěn)定遺傳機制提供理論支持。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

試驗材料來自小麥1BL/1RS易位系親935、晉春13等45份小麥細胞質(zhì)的易位系，由山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所小麥室保存。小麥K型不育系豫麥3和豫麥21以及黑麥品種King II由中國科學(xué)院遺傳研究所韓方普教授提供。

大腸桿菌DH5α，RT-PCR試劑盒，T1 DNA連接酶，PeasyT1載體，反轉(zhuǎn)錄試劑盒One-StepAMV RT-PCR Kit和DL 2000購自寶生物工程（大連）有限公司；通用型DNA純化回收試劑盒、無內(nèi)毒素質(zhì)粒大提試劑盒購自生工生物工程（上海）股份有限公司。引物合成和測序由生工生物工程（上海）股份有限公司完成。氯仿、無水乙醇、硼酸、瓊脂糖、Tris堿、異丙醇等常規(guī)試劑采用國產(chǎn)分析純或進口分裝。

1.2 試驗方法

1.2.1 DNA提取 植物總DNA的提取采用CTAB法[14]，利用微量紫外分光光度計檢測樣品DNA濃度，并統(tǒng)一稀釋至終濃度為100ng/μL。

1.2.2 總RNA提取、cDNA第1鏈的合成、cDNA和gDNA序列擴增 黑麥材料盆栽，待苗長到第3片葉完全展開時取樣，利用Tiangen公司RNA提取試劑盒，提取葉片總RNA，經(jīng)檢測RAN未降解，質(zhì)量較高。然后，利用Tiangen公司的反轉(zhuǎn)錄酶進行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，獲得第1條鏈cDNA，具體的操作流程按照說明書進行。根據(jù)近緣種CenH3保守結(jié)構(gòu)域設(shè)計引物：

acting-F：GTTCCA ATCTATGAGGGATACACG C；acting-R：GAACCTCCACTGAGAACAACATTAC C；WC1-F：GCGCTGAAGGGGCAACTGGG；WC1-R：TGCACCCCCAATACATAAAACATCTCC；WG2-F：G CGACGACGGAGACGAAGAA；WG2-R：GAGCAAAGCAGGGAGGTCAG。

以反轉(zhuǎn)錄所得cDNA以及提取的gDNA為模板進行PCR擴增。擴增總體積為50.0μL，擴增體系為：cDNA 1.0～1.5 μL，上、下游引物（10 μmol/L）各1.0μL，10×PCR buffer2.5μL，KOD-Plus聚合酶1.0～1.5μL，25mmol/L Mg2+2μL，dNTP（40mmol/L）0.5μL，PCR補足水50.0 μL。

反應(yīng)程序為：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性1 min，56～62℃退火1 min，68℃延伸1 min，35個循環(huán)；72℃延伸10min；10℃保溫。

1.2.3 PCR產(chǎn)物回收純化、T-載體克隆與陽性克隆篩選 在1%瓊脂糖凝膠上進行檢測可知，cDNA產(chǎn)物條帶大小為500 bp左右，DNA產(chǎn)物條帶大小為3 000 bp左右。將目的條帶回收純化后連接到PeasyT1載體上，并轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞中。挑選白色單菌落于涂布含有IPTG和X-gal的氨芐LB固體平板上擴大培養(yǎng)。對菌體進行PCR擴增，篩選陽性克隆。

1.2.4 序列測定與比較分析 將陽性克隆進行測序（生工生物工程（上海）股份有限公司完成）。序列分析利用GeneTool軟件進行。

1.2.5 原位雜交 采用GISH和FISH方法對所有材料的根尖細胞中期染色體進行分析鑒定。挑選籽粒飽滿的種子在墊有濕濾紙的培養(yǎng)皿中發(fā)芽，待根長長到2～3 cm時，剪取發(fā)芽種子的根尖。根尖細胞中期染色體的制備、探針標記方法以及原位雜交程序均按照Han等[15]描述的方法進行。GISH分析中，以中國春基因組DNA作為封阻，以黑麥基因組DNA利用地高辛（Digoxigenin-11-Dutp，DIG；Roche，Germany）缺口平移法標記探針。FISH鑒定以重復(fù)序列pAs1（標記為紅色）、來自黑麥的重復(fù)序列pSc119.2[16-17]和黑麥基因組DNA（標記為綠色）為探針進行FISH分析篩選易位系；以來自黑麥著絲粒重復(fù)序列pAWRC.1[18]（標記為綠色）為探針檢測易位染色體的著絲粒DNA序列組成。用細胞學(xué)鏡檢采用OLYMPUSBX60熒光顯微鏡觀察，用PhotometricsSenSysCCD成像。

2 結(jié)果與分析

2.1 CenH3基因cDNA片段的獲得和部分gDNA序列克隆

根據(jù)小麥CenH3基因保守區(qū)設(shè)計引物，以黑麥cDNA為模板，擴增出500 bp左右的條帶，將PCR產(chǎn)物從1%的瓊脂糖中回收純化，再與PeasyT1載體連接，重組T載體轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌DH5α菌株、培養(yǎng)基培養(yǎng)，將菌液進行PCR檢測，將陽性克隆的菌液送至生工生物工程（上海）股份有限公司進行測序。測序結(jié)果表明，擴增獲得的cDNA序列長度為537bp，將所得序列與NCBI中黑麥近緣種小麥、燕麥等進行同源比對，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與這些近緣種的CenH3基因在序列上相似度較高，可以確認該片段是黑麥CenH3基因的部分片段。結(jié)合小麥CenH3基因的序列，重新設(shè)計引物，采用同樣的方法在黑麥基因組DNA中擴增出一條3 000 bp左右的片段，經(jīng)測序去載體后，獲得黑麥2 617 bp的序列。

2.2 細胞學(xué)篩查小麥 1BL/1RS易位染色體及1RS斷裂點分析

著絲粒是真核生物染色體正確分離和傳遞所必需的染色體區(qū)域，在細胞有絲分裂和減數(shù)分裂過程中起重要作用。在遠緣雜交、回交后代群體中可檢測到自發(fā)產(chǎn)生的易位，這種自發(fā)產(chǎn)生的易位大多是由外源單價體著絲粒錯分裂形成的整臂易位[19]。小麥1BL/1RS易位系是在全球應(yīng)用最廣泛的易位系，外源染色體在不同小麥背景中都能穩(wěn)定遺傳，為此，本試驗檢測1BL/1RS易位染色體著絲粒的組成。首先，采用GISH和順序FISH的方法篩選1BL/1RS易位系，以重復(fù)序列pAsI和黑麥基因組DNA為探針進行GISH，F(xiàn)ISH分析（圖1）。

在159份材料中篩選出28份不同小麥背景的1BL/1RS易位系以及4份K型1BL/1RS不育系和保持系。這些1BL/1RS易位染色體無論在小麥背景中還是山羊草屬背景中都能穩(wěn)定遺傳。其次，選取其中32份1BL/1RS易位系以重復(fù)序列pAs1和pSc119.2為探針進行 FISH分析，結(jié)果表明，1BL/1RS易位染色體的著絲粒區(qū)域出現(xiàn)2個信號，小麥和黑麥著絲粒DNA序列的信號均被檢測到（圖2）。

根據(jù)FISH檢測結(jié)果，在本研究篩選到的32份1BL/1RS易位系材料中，繼續(xù)用小麥著絲粒重復(fù)序列pAs1標記紅色探針，黑麥特異著絲粒標記為綠色探針，可以看出，在易位染色體中黑麥特異的重復(fù)序列和小麥的著絲粒信號同時出現(xiàn)在易位染色體中。因此，對于著絲粒DNA序列而言，小麥和黑麥的特異著絲粒DNA序列同時出現(xiàn)在易位染色體的著絲粒區(qū)域，這些重復(fù)序列和CenH3蛋白相互作用，可能進一步參與指導(dǎo)1BL/1RS易位染色體的正確分離。

2.3 CenH3基因在1BL/1RS易位染色體中的定位

CenH3是發(fā)現(xiàn)較早的功能著絲粒的基本蛋白質(zhì)。相關(guān)的CenH3蛋白研究中，基于蛋白質(zhì)與DNA相互識別的機制，通常采用同源克隆、回收基因組DNA酶切片段和CENH3抗體進行染色質(zhì)免疫沉淀（CHIP）實驗，分離著絲粒DNA序列[20-22]。在小麥1BL/1RS易位系中，易位染色體在不同小麥背景中均能穩(wěn)定遺傳，該易位染色體的著絲粒起關(guān)鍵作用。為此，將小麥、燕麥、玉米和水稻等的CenH3進行同源比對，設(shè)計引物擴增黑麥CenH3基因的cDNA序列，然后根據(jù)小麥的CenH3基因組的DNA序列重新設(shè)計引物，以黑麥基因組DNA為模板擴增黑麥CenH3的DNA序列，獲得約2.5 kb的序列，在對應(yīng)的平板上重新挑菌過夜培養(yǎng)，提取質(zhì)粒基因組DNA，標記探針（綠色），F(xiàn)ISH檢測其在1BL/1RS易位染色體上的位置，并未發(fā)現(xiàn)在1BL/1RS易位染色體上有黑麥CenH3基因的信號。

3 討論與結(jié)論

著絲粒是植物染色體重要的標志性結(jié)構(gòu)。通過細胞學(xué)的研究方法和技術(shù)，科學(xué)家很早就發(fā)現(xiàn)著絲粒和特異性的蛋白結(jié)合成動粒，在細胞有絲分裂和減數(shù)分裂中成為紡錘絲牽引附著的主要位點[23]。不同植物著絲粒區(qū)域大小不一，結(jié)構(gòu)也較為復(fù)雜，主要由著絲粒DNA序列和蛋白結(jié)合區(qū)域組成[24]；著絲粒DNA序列是植物甚至真核生物進化最快的序列之一，即便在親源關(guān)系非常接近的物種中，著絲粒的DNA序列長度或組成也可能完全不同，這些著絲粒DNA序列通常由高度串聯(lián)重復(fù)的衛(wèi)星序列和高拷貝數(shù)的反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子組成[25-26]。CenH3是較早發(fā)現(xiàn)的功能著絲粒的基本蛋白質(zhì)。即使在親緣關(guān)系密切的近緣物種中，CenH3與組蛋白H3無論在組成還是結(jié)構(gòu)上都有較大的差異，CenH3基因的序列也高度趨異且羧基端蛋白質(zhì)折疊域的變異與核小體定位密切相關(guān)[27-28]。CenH3蛋白發(fā)生任何修飾或者突變都會導(dǎo)致染色體錯分裂，致使產(chǎn)生非整倍體或者單倍體后代[29]?？梢?，著絲粒特異組蛋白和DNA序列之間的互作在染色體的分離過程中起關(guān)鍵作用。在小麥的育種改良中，育種學(xué)家通過附加系或者花粉輻射等方法創(chuàng)制各種易位系，但是在轉(zhuǎn)育的過程中發(fā)現(xiàn)多數(shù)易位系不能穩(wěn)定遺傳，但是1BL/1RS易位系卻能在不同的小麥背景中均穩(wěn)定遺傳，甚至在山羊草屬的細胞質(zhì)中也能穩(wěn)定遺傳，本研究通過克隆黑麥的CenH3基因約2.5 kb的序列，應(yīng)用FISH的方法標記探針，1BL/1RS易位染色體在2種細胞質(zhì)背景的小麥中都無法檢測到信號，說明1BL/1RS易位染色體中黑麥的CenH3不表達或者發(fā)生基因沉默，只有小麥的CenH3在染色體分離過程中和著絲粒DNA序列互作，指導(dǎo)易位染色體正確分離。

然而，由于著絲粒結(jié)構(gòu)特殊，特別是著絲粒包含高度重復(fù)序列和多拷貝的反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子，導(dǎo)致構(gòu)建測序所用的克隆重疊群難度較大；其次，著絲粒的功能在幾乎所有的真核生物中都極為保守，但是他們的序列變化較大，即便在親源關(guān)系很近的物種之間。因此，對著絲粒區(qū)域的DNA序列組成及其功能的解析，成為人們理解真核生物最后的邊界[24]。1BL/1RS易位染色體不僅在小麥背景中能穩(wěn)定遺傳，在山羊草屬背景中也能穩(wěn)定遺傳，易位染色體著絲粒區(qū)域在分離過程中起關(guān)鍵的作用，盡管在1BL/1RS易位染色體中檢測到黑麥著絲粒DNA序列，但是小麥、黑麥著絲粒DNA序列的融合位點及黑麥著絲粒DNA序列的組成、長度及活性等方面是否發(fā)生變化，還需要結(jié)合CHIP技術(shù)做進一步的研究。其次，在一些模式植物的研究中發(fā)現(xiàn)，CenH3蛋白和外源染色體在寄主基因組中的去留有著千絲萬縷的聯(lián)系，在大麥×球莖大麥和小麥×玉米的研究中，均發(fā)現(xiàn)由于父本CenH3蛋白在合子中失活而逐漸丟失。小麥K型1BL/1RS易位系和保持系雜交會產(chǎn)生一定比例的單倍體[30]，但是在后代的篩查中沒有發(fā)現(xiàn)錯分裂，可能與黑麥的CenH3基因不表達有關(guān)，但小麥的CenH3蛋白和黑麥的部分著絲粒DNA序列之前的相互作用機制還有待進一步研究。因此，今后對易位染色體著絲粒序列進行進一步的CHIP分析，將有助于理解1BL/1RS易位染色體在不同小麥和山羊草屬背景中均能穩(wěn)定遺傳的機制。

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Cloning of the CenH3 Gene in Rye and Its Location of 1BL/1RS Translocated Chromosome

LI Yali1，2，NIE Yuanjun3，YANG Feng4，SUNYu5，DONG Yanhui1，RENYongkang5，TANG Zhaohui1
（1.Reseach CenterofBiotechnololgy，Shanxi Academy ofAgricultural Sciences，Taiyuan 030031，China：2.InstituteofGeneticsand Developmental Biology，Chinese Academy ofSciences，Beijing100101，China；3.InstituteofAgricultural Resources&Economy，Shanxi Academy ofAgricultural Sciences，Taiyuan 030006，China；4.Institute ofWheat，Shanxi Academy ofAgricultural Sciences，Linfen 041000，China；5.Institute ofCrop Sciences，Shanxi Academy ofAgricultural Sciences，Taiyuan 030031，China）

Rye containg a lot of resistance genes is an important genetic resource for wheat improvement.Transferring valuable genesof rye（Secale cereale L.）into hexaploid wheat（Triticum aestivum L.）can widen the genetic constitution and enrich variation of wheat.Weobtained a partof CenH3 geneusing technologyofmolecular cloningand applied forDigoxigenin-labelled gDNA probesof the CenH3 gene.Meanwhile,including Ae.kotschyi cytoplasm of 1BL/1RS type,32 samples of different genetic background belong to 1BL/1RS translocation lines,and these 1BL/1RS translocation lineswere tested with genomic in situ hybridization（GISH）and fluorescent in situ hybridization（FISH）.The result showed that therewas no sigals of CenH3 gene of rye.However,two sigals from special tandem repeats of centromere of wheat and rye were found in all samples.So DNA sequence of centromere from 1RS was also considered as a compensatory substituteof 1BS,and the interaction of the CenH3 protein of wheat and DNA sequence of centromere of rye could lead to correctsegregation ofchromosomesand steadily hereditary in differentgenetic background.

rye;CenH3 gene;fluorescence in situ hybridization（FISH）;1BL/1RS translocation lines

S512.5

A

1002-2481（2016）07-0889-05

10.3969/j.issn.1002-2481.2016.07.01

2016-05-08

國家科技支撐計劃項目（2013BAD04B03-04）；山西省國際科技合作項目（2015081002）；山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院博士基金項目（YBSJJ1413）

李亞莉（1978-），女，山西代縣人，博士，主要從事小麥遺傳育種研究工作。唐朝暉為通信作者。