北京地區(qū)警犬皮膚葡萄球菌分離鑒定及耐藥性試驗

周傳鐸 ， 任連權(quán) ， 趙 然 ， 張 迪 ， 周雅楠 ， 李曉曉 ， 林德貴

(1.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院 ， 北京海淀100193 ； 2.北京市公安局刑偵總隊警犬技術(shù)支隊 ，北京大興102614 ； 3.天津市獸藥飼料監(jiān)察所 ， 天津北辰300402)

北京地區(qū)警犬皮膚葡萄球菌分離鑒定及耐藥性試驗

周傳鐸1，2， 任連權(quán)3， 趙 然2， 張 迪1， 周雅楠1， 李曉曉1， 林德貴1

(1.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院 ， 北京海淀100193 ； 2.北京市公安局刑偵總隊警犬技術(shù)支隊 ，北京大興102614 ； 3.天津市獸藥飼料監(jiān)察所 ， 天津北辰300402)

犬膿皮病，又稱為犬細菌性皮膚病或犬細菌性毛囊炎，為由細菌引起的犬皮膚及其相關(guān)結(jié)構(gòu)的感染[1]，系犬常見病之一。該病具有發(fā)病率高、療程長、易復(fù)發(fā)的特點，加上日益嚴重的細菌耐藥問題，使得該病的治療愈發(fā)困難。而葡萄球菌被認為是引起人與動物化膿感染的主要的病原菌之一[1]。本試驗對北京地區(qū)警犬膿皮病病例及健康警犬體表皮膚的葡萄球菌進行分離、鑒定及藥物敏感性試驗，為警犬皮膚病防治提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料選擇 (1)2014年10月-2015年01月，北京地區(qū)新發(fā)的警犬膿皮病病例18例；(2)北京地區(qū)健康警犬50頭(體表無化膿感染病灶，其他器官或系統(tǒng)無明顯病變)，其中德國牧羊犬、史賓格犬、拉布拉多犬、羅威納犬、馬里努阿犬各10只，雌雄各半，年齡平均分布。

1.2 培養(yǎng)基及試劑 細菌培養(yǎng)所用各種培養(yǎng)基，購自北京奧博星生物技術(shù)有限責任公司；藥敏試紙片，分別購自賽默飛世爾生物化學(xué)制品(北京)有限公司及北京天壇生物科技有限公司；培養(yǎng)基及其他試劑的配制均按產(chǎn)品說明或常規(guī)方法配制；標準菌株金黃色葡萄球菌ATCC25923、ATCC29213由中國農(nóng)業(yè)大學(xué)藥理實驗室提供；DNA Marker，購自天跟生化科技(北京)有限公司；2*EasyTaqSupperMix，購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；PCR引物合成及測序由北京三博遠志生物技術(shù)有限責任公司完成。

1.3 細菌的分離、鑒定 (1)膿皮病病例：用無菌生理鹽水對病灶表面進行沖洗，用浸有無菌BHI肉湯的棉簽蘸取新的膿汁或沿感染灶與健康組織交界處蘸取滲出物，于酒精燈旁接種5%哥倫比亞血營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基；37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h；根據(jù)菌落的形態(tài)、顏色、溶血情況等，挑取不同的單菌落轉(zhuǎn)接至新的哥倫比亞血平板，37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h～36 h；(2)健康犬皮膚：將一次性無菌采樣拭子用無菌生理鹽水浸濕后，分別對每只犬的右眼眼周、背部正中、左側(cè)腹股溝處皮膚進行采樣，并置于7.5%高鹽肉湯培養(yǎng)基，37℃孵育24 h～36 h。在超凈臺中，將培養(yǎng)后的菌液接種于高鹽甘露醇瓊脂培養(yǎng)基，置37℃恒溫箱孵育24 h～48 h。挑取單菌落轉(zhuǎn)接至新的高鹽甘露醇瓊脂培養(yǎng)基，進一步純化；(3)挑取單一形態(tài)菌落：經(jīng)染色、鏡檢后，經(jīng)BHI肉湯增菌培養(yǎng)，采用水煮法[2]提取DNA，并采用16S rDNA法(通用引物27F、1492R)及生化鑒定法對細菌進行鑒定。

1.4 藥敏試驗 對分離得到的葡萄球菌采用紙片擴散法進行藥物敏感性試驗。結(jié)果判定依CL.SI(2015修訂版)進行。

2 結(jié)果

2.1 北京地區(qū)警犬膿皮病病原菌的分離鑒定結(jié)果 從18例膿皮病患犬患處分離到細菌34株。其中葡萄球菌18株(52.94%)，芽孢桿菌11株(32.35%)，結(jié)果見表1。

表1 北京地區(qū)膿皮病警犬病原菌鑒定結(jié)果

2.2 北京地區(qū)警犬健康皮膚葡萄球菌分離鑒定結(jié)果 150個采集樣本中，共分離出葡萄球菌23株。其中，偽中間型葡萄球菌最多，6株，占26.1%，結(jié)果見表2。

表2 北京地區(qū)警犬健康皮膚葡萄球菌分離鑒定結(jié)果

2.3 膿皮病患病品種統(tǒng)計及健康犬皮膚葡萄球菌與樣本間關(guān)系 18例警犬膿皮病中，史賓格犬、德國牧羊犬病例數(shù)最高，各6例，分占33.33%，拉布拉多犬、馬里努阿犬、羅威納犬分別為3例、2例和1例。而健康犬皮膚分離的23株葡萄球菌，從品種看，7株(30.43%)來自于史賓格犬，占比最高；德國牧羊犬與羅威納犬均為5 株(21.74%)；馬里努阿犬及拉布拉多犬分別為4 株(17.39%)、2 株(8.7%)；從分離部位看，左腹股溝處分離出菌數(shù)量最多，為12 株(52.17%)，背部最少4株(17.39%)。

2.4 北京地區(qū)警犬皮膚葡萄球菌耐藥情況 對膿皮病警犬患處分離的18 株葡萄球菌及健康警犬皮膚分離的23 株葡萄球菌進行藥物敏感性試驗，全部葡萄球菌均對頭孢西丁敏感，結(jié)果見表3。多重耐藥(同時對3 種及3 種以上藥物耐藥)的菌株情況見表4。

表3 北京地區(qū)警犬皮膚分離葡萄球菌的耐藥情況

a：依照CLSI獸醫(yī)標準；b：金黃色葡萄球菌及路登葡萄菌依表格標準，其他葡萄球菌依S≥25、R≤24標準

表4 北京地區(qū)警犬分離葡萄球菌多重耐藥情況

3 討論

3.1 犬皮膚感染致病菌較多，且多為復(fù)合感染。在既往的研究中，犬膿皮病分離得到的病原菌并不完全一致，但葡萄球菌，尤其是偽中間型葡萄球菌為犬膿皮病的主要病原菌已成為動物醫(yī)學(xué)界的共識[3-10]，本試驗的結(jié)果再次證實了這一結(jié)論。但試驗中，從膿皮病患犬處未分離到鏈球菌、綠膿桿菌、微球菌、變形桿菌、棒狀桿菌等[4-7，9]致病菌，而薛占永等[8]在研究北京地區(qū)犬膿皮病的病原菌時同樣未分離到鏈球菌與綠膿桿菌，其原因可能與地域及季節(jié)等因素有關(guān)。另外，從健康犬皮膚表面分離得到的凝固酶陰性葡萄球菌相對較多，而某些凝固酶陰性葡萄球菌也具有特定致病性，可以引發(fā)動物及人感染[11-12]，仍不能忽視。

3.2 從患病犬統(tǒng)計看，史賓格犬、德國牧羊犬為膿皮病發(fā)病率最高的品種。從健康警犬皮膚分離的葡萄球菌在犬品種間的分布來看，史賓格犬體表分離到的葡萄球菌最多，與史賓格犬膿皮病發(fā)病病例較高相呼應(yīng)。德國牧羊犬為人們已知的膿皮病易感品種，提示史賓格犬可能也具有膿皮病易感特性，應(yīng)引起警犬技術(shù)人員的重視。

3.3 葡萄球菌為公認的犬膿皮病主要致病菌，故對其進行分離及藥物敏感性試驗。從試驗結(jié)果看，所有分離菌株均對頭孢西丁敏感，未篩查出耐甲氧西林葡萄球菌；對阿莫西林-克拉維酸、阿米卡星、氟苯尼考也全部敏感，為以后臨床提供更多選擇；對青霉素G耐藥率最高；而常用的皮膚病用藥-克林霉素在健康犬皮膚分離葡萄球菌的耐藥率僅為 8.70%，但對發(fā)病犬分離菌的耐藥率提高為 38.89%，提示其可能較易產(chǎn)生耐藥性，在用藥時要審慎選擇。而與近年相關(guān)研究結(jié)果相比較，分離菌藥物敏感性試驗結(jié)果及多重耐藥情況均優(yōu)于國內(nèi)薛占永、楊靜等[8-9]的試驗，與國外研究的耐藥情況較為一致[5-7]。但從健康警犬皮膚分離的葡萄球菌耐藥情況看，雖然菌株對藥物敏感性情況優(yōu)于膿皮病患犬組，但對所用試驗藥物全部敏感的菌株僅占26.09%，仍有較多菌株對不同藥物耐藥，且存在著4株多重耐藥菌株，提示警犬皮膚葡萄球菌耐藥性存在的普遍性。

4 小結(jié)

由試驗可知，北京警犬膿皮病病原菌仍以葡萄球菌(偽中間型葡萄球菌)為主，皮膚分離葡萄球菌藥物敏感性情況要好于國內(nèi)平均水平，但仍存在一定的耐藥性問題。警犬技術(shù)工作人員要加強對警犬皮膚細菌耐藥性的監(jiān)測，重點圍繞易感的史賓格犬和德國牧羊犬品種展開膿皮病的預(yù)防及治療工作，合理使用藥物，提高膿皮病治療效果的同時，減少細菌耐藥性的產(chǎn)生，更要加強防范，減免動物源性耐藥菌向人的傳播。

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2015-11-16

周傳鐸(1982-)，男，獸醫(yī)師，工程師，博士，從事警犬疾病防治工作，E-mail：zthxc@163.com

林德貴，E-mail：csamam@sina.com

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