咪達(dá)唑侖對(duì)山羊不同腦區(qū)cAMP含量的影響

郭 岑 ， 鄭 宇 ， 魏成威 ， 王 浩 ， 李麗娜 ，張一鳴 ， 王宇鑫 ， 李欣然 ， 高 利

(東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院 ， 黑龍江哈爾濱150030)

咪達(dá)唑侖對(duì)山羊不同腦區(qū)cAMP含量的影響

郭 岑 ， 鄭 宇 ， 魏成威 ， 王 浩 ， 李麗娜 ，張一鳴 ， 王宇鑫 ， 李欣然 ， 高 利

(東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院 ， 黑龍江哈爾濱150030)

研究咪達(dá)唑侖對(duì)山羊不同腦區(qū)cAMP含量的影響，探討其在中樞麻醉中的作用機(jī)制。試驗(yàn)用15只健康山羊，3只為生理鹽水對(duì)照組，其余為試驗(yàn)組，試驗(yàn)組山羊肌肉注射14mg/kg體重咪達(dá)唑侖。分別在給藥后誘導(dǎo)期、麻醉期、恢復(fù)1期和恢復(fù)2期4個(gè)時(shí)間點(diǎn)，每個(gè)給藥點(diǎn)剖殺3只山羊取腦組織，并采用ELISA測(cè)定不同腦區(qū)cAMP含量。注射咪達(dá)唑侖后，山羊大腦皮層、海馬、丘腦、小腦和腦干內(nèi)cAMP含量顯著升高，恢復(fù)2期上述腦區(qū)內(nèi)cAMP含量均恢復(fù)到正常水平，這種變化趨勢(shì)與山羊肌肉注射咪達(dá)唑侖麻醉后行為學(xué)變化基本一致。表明咪達(dá)唑侖的麻醉作用可能與激活山羊各個(gè)腦區(qū)內(nèi)cAMP信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)相關(guān)。

咪達(dá)唑侖 ； cAMP ； 山羊

咪達(dá)唑侖(Midazolam、Dormicum)是苯二氮卓類麻醉劑，具有鎮(zhèn)靜、安眠、抗焦慮、肌肉松弛作用[1]。但其麻醉輔助藥物對(duì)中樞作用機(jī)制目前還沒有系統(tǒng)的研究。cAMP 作為第二信使，具有調(diào)控細(xì)胞基因和蛋白表達(dá)的重要功能[2]，腺苷酸環(huán)化酶(AC)在接收胞外信號(hào)跨膜抵達(dá)胞內(nèi)時(shí)，在Mg2+存在時(shí)，環(huán)化ATP 轉(zhuǎn)化為cAMP，cAMP 激活蛋白激酶(PKA)磷酸化目標(biāo)蛋白或使目標(biāo)基因轉(zhuǎn)錄，進(jìn)而使細(xì)胞內(nèi)各項(xiàng)生理生化反應(yīng)被激活。近些年，許多試驗(yàn)數(shù)據(jù)逐步證實(shí)cAMP 信號(hào)通路在麻醉過程中發(fā)揮著相應(yīng)的關(guān)聯(lián)作用。有報(bào)道證實(shí)，噻環(huán)乙胺麻醉可顯著提高大鼠的丘腦和大腦皮質(zhì)內(nèi)的腺苷酸環(huán)化酶(AC)活性，增加cAMP 的含量[3-4]。唐蘇紅等[5]人用丙泊酚麻醉大鼠，測(cè)定麻醉各時(shí)期腦干、海馬以及大腦皮層內(nèi)cAMP 含量。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在麻醉期，大鼠各腦區(qū)的cAMP 含量明顯升高，而恢復(fù)期cAMP 含量則呈下降趨勢(shì)，逐步回歸正常水平，從而推測(cè)大鼠腦干、海馬以及大腦皮層的cAMP 含量變化可能是丙泊酚引發(fā)中樞抑制作用的原因之一。此外，李平萍等[6]人使用氯胺酮、依托咪酯、咪達(dá)唑侖、異氟烷等藥物做類似研究，都得出了麻醉期相關(guān)腦區(qū)cAMP 含量升高的結(jié)果，說明動(dòng)物麻醉可能伴隨相應(yīng)腦區(qū)cAMP的含量變化。試驗(yàn)設(shè)計(jì)研究咪達(dá)唑侖對(duì)山羊各個(gè)腦區(qū)cAMP含量的影響，利用山羊研究該藥的麻醉中樞作用機(jī)制，以探討咪達(dá)唑侖對(duì)山羊麻醉的中樞作用機(jī)制及其在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的主要作用位點(diǎn)，為今后該藥物在反芻動(dòng)物臨床應(yīng)用提供依據(jù)。

1 試驗(yàn)材料及方法

1.1 試驗(yàn)用品

1.1.1 試驗(yàn)動(dòng)物 八月齡健康山羊15只(購(gòu)自哈爾濱郊區(qū)養(yǎng)殖戶，醫(yī)學(xué)檢查健康)，體重13～15 kg，雌雄兼用，試驗(yàn)前在動(dòng)物舍喂養(yǎng)1周以適應(yīng)環(huán)境。試驗(yàn)前12 h禁食禁水。

1.1.2 儀器和藥品 AvantiTM30Centrifuge高速冷凍離心機(jī)(Japanese Beckman Company；BioTek EpochTM)；多體積分光光度計(jì)(美國(guó)伯騰儀器有限公司)。咪達(dá)唑侖注射液，由哈爾濱醫(yī)科大學(xué)提供；山羊cAMP測(cè)定試劑盒，購(gòu)自美國(guó)R&D systems公司。

1.2 動(dòng)物分組及樣品采取 15只山羊隨機(jī)分為兩組：對(duì)照組(生理鹽水組)3只、麻醉誘導(dǎo)組(注藥后5 min)、麻醉組(翻正反射消失)、恢復(fù)1組(翻正反射恢復(fù)時(shí))、恢復(fù)2組(翻正反射恢復(fù)后6 h)4個(gè)時(shí)間點(diǎn)每個(gè)時(shí)間點(diǎn)3只。對(duì)照組與麻醉組分別肌肉注射生理鹽水1.5 mL/kg體重，咪達(dá)唑侖14 mg/kg體重，并于各時(shí)間點(diǎn)處死開顱，取腦組織，用4 ℃生理鹽水沖凈腦組織血液，置于冰面上迅速分取雙側(cè)大腦皮層、小腦、丘腦、腦干和海馬。稱重后按1∶9(W/V)置入預(yù)冷的生理鹽水溶液中勻漿，然后 -4 ℃ 高速離心10 min(3 000 r/min)，取上清液。行為學(xué)變化按照師銘咸等[7]所述標(biāo)準(zhǔn)判定。

1.3 檢測(cè)方法 采用ELISA方法檢測(cè)樣品中cAMP含量。上步所采取的樣品按照所用ELISA試劑盒要求進(jìn)行進(jìn)一步處理后，用ELISA方法檢測(cè)各樣品中cAMP含量。

2 試驗(yàn)數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)與分析

應(yīng)用SPSS13.0for Windows數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析軟件，對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行一維方差分析，兩變量間簡(jiǎn)單相關(guān)分析采用直線相關(guān)回歸分析，P<0.05為差異顯著，P<0.01為差異極顯著。應(yīng)用Microsoft Excel 2007對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行作圖。

3 試驗(yàn)結(jié)果與分析

咪達(dá)唑侖麻醉下山羊行為學(xué)變化 注藥后山羊表現(xiàn)如下：逐漸安靜，行動(dòng)遲緩、共濟(jì)失調(diào)、趴臥不動(dòng)，最后翻正反射消失。測(cè)定翻正反射消失所用平均時(shí)間為8.46±2.67 min。在麻醉期間，山羊雙目半閉，眼球向內(nèi)下方翻轉(zhuǎn)，對(duì)光反射存在。眼瞼反射、角膜反射明顯減弱，肛門反射存在，較少出現(xiàn)流涎。翻正反射恢復(fù)的平均時(shí)間為45.68±4.52 min。

如表1所示，注射咪達(dá)唑侖后，山羊大腦皮層、海馬、丘腦、小腦和腦干內(nèi)cAMP濃度都明顯增高。誘導(dǎo)期大腦皮層、海馬、丘腦和腦干內(nèi)cAMP濃度與對(duì)照組比較，分別增高17.8%(P<0.01)、23.1%(P<0.01)81.6%(P<0.01)、5.3%(P>0.05)和5.4%(P>0.05)，差異不顯著或極顯著。麻醉期大腦皮層、海馬、丘腦、小腦和腦干內(nèi)cAMP濃度與對(duì)照組比較，分別增高24.0%、35.6%、92.4%、25.8%和14.0%，均差異極顯著?；謴?fù)1期各個(gè)腦區(qū)cAMP濃度雖有不同程度的降低，但與對(duì)照組比較，分別增高14.4%(P<0.05)、20.6%(P<0.01)、46.6%(P<0.01)、15.2%(P<0.01)和 10.9%(P<0.01)差異顯著或極顯著。恢復(fù)2期上述腦區(qū)cAMP濃度，恢復(fù)到正常水平。山羊各個(gè)腦區(qū)cAMP含量變化趨勢(shì)與山羊行為學(xué)變化呈現(xiàn)一定規(guī)律性。

4 討論

cAMP普遍存在于細(xì)胞內(nèi)，是一種重要的第二信使。細(xì)胞內(nèi)，活化的腺苷酸環(huán)化酶(AC)催化胞漿中的ATP脫去一個(gè)焦磷酸產(chǎn)生cAMP，cAMP進(jìn)一步激活細(xì)胞中的蛋白激酶(PKA)，介導(dǎo)靶蛋白磷酸化，從而調(diào)節(jié)細(xì)胞的生理反應(yīng)。cAMP還可通過PKA調(diào)節(jié)與麻醉有關(guān)的受體(如NMDA受體、GABA受體等)和通道(如鈉離子通道)從而影響突觸的興奮傳遞。cAMP信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)可，通過PKA使鈉通道蛋白質(zhì)磷酸化，減少鈉離子內(nèi)流，減弱神經(jīng)元之間的興奮傳遞，從而使機(jī)體產(chǎn)生麻醉反應(yīng)[3]。

表1 咪達(dá)唑侖麻醉對(duì)山羊不同腦區(qū)cAMP濃度的影響 (單位：nmol/mL)

a：**：與對(duì)照組比較P<0.01，差異極顯著；*：與對(duì)照組比較P<0.05，差異顯著

b：▲▲：與麻醉期比較P<0.01，差異極顯著；▲：與對(duì)照組比較P<0.05，差異顯著

郁麗娜等(2001)研究發(fā)現(xiàn)，咪達(dá)唑侖對(duì)異丙酚引起小鼠不同程度大腦皮質(zhì)cAMP含量變化無明顯影響，但在小鼠翻正反射消失這一時(shí)點(diǎn)，咪達(dá)唑侖和異丙酚組小鼠大腦皮質(zhì)cAMP含量與生理鹽水組和異丙酚組相比，增加15.8%，有增加趨勢(shì)[8]。這與本試驗(yàn)的結(jié)果有相似之處，表明咪達(dá)唑侖通過激活神經(jīng)細(xì)胞的cAMP信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)產(chǎn)生抑制性神經(jīng)調(diào)節(jié)。Cao等(2005)預(yù)先給大鼠使用咪達(dá)唑侖，可抑制嗎啡戒斷大鼠脊髓Fos蛋白表達(dá)，也間接證明本試驗(yàn)結(jié)果的正確性[9]。

本試驗(yàn)結(jié)果表明，咪達(dá)唑侖麻醉過程中，誘導(dǎo)期山羊各個(gè)腦區(qū)內(nèi)cAMP含量均明顯升高，麻醉期上述腦區(qū)內(nèi)cAMP含量均極顯著高于對(duì)照組。在恢復(fù)1期，大腦皮層、海馬和腦干內(nèi)cAMP含量有明顯升高，在翻正反射恢復(fù)并能自由走動(dòng)后，各腦區(qū)cAMP的濃度均有所降低，基本恢復(fù)到正常水平，這種變化趨勢(shì)與山羊行為學(xué)變化相平行。分析試驗(yàn)結(jié)果推斷，山羊各個(gè)腦區(qū)的cAMP信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)可能參與咪達(dá)唑侖全麻分子機(jī)理的調(diào)控，且咪達(dá)唑侖全麻作用可能與激活上述腦區(qū)的cAMP信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)相關(guān)。另一方面，咪達(dá)唑侖能夠直接作用于GABAA受體的苯二氮位點(diǎn)，修飾GABAA受體的活動(dòng)(控制Cl_通道)。兩者之間可能存在協(xié)同作用。Juan-Fita等(2006)研究發(fā)現(xiàn)，應(yīng)用地西泮能增強(qiáng)多巴胺刺激大鼠心肌產(chǎn)生cAMP的作用，這一效應(yīng)不能由苯二氮卓類受體誘導(dǎo)，可能是地西泮抑制PDE同工酶4活性的結(jié)果[10]。咪達(dá)唑侖同為苯二氮卓類麻醉劑，是否通過相同的機(jī)制對(duì)cAMP信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)產(chǎn)生作用，還需要進(jìn)一步的研究。

5 結(jié)論

本研究表明，cAMP信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)可能參與了咪達(dá)唑侖全麻分子機(jī)理的調(diào)控。咪達(dá)唑侖的全麻作用可能與激活山羊各個(gè)腦區(qū)的cAMP信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)相關(guān)。

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Effect of midazolam on cAMP content in different encephalic regions of goats

GUO Cen ， ZHENG Yu ， WEI Cheng-wei ， WANG Hao ， LI Li-na ， ZHANG Yi-ming ，WANG Yu-xin ， LI Xin-ran ， GAO Li

(College of Animal Medicine，Northeast Agricultural University，Harbin 150030，China)

To study the effect of midazolam on cAMP content in different encephalic regions of goats and to explore its central mechanism，we used 15 healthy goats with three of them as saline control group and the rest as experimental group.The goats in experimental group were intramuscularly injected with 14 mg/kg midazolam.Goats in experimental group were executed respectively in induction period，anesthesia period，recovery-form-anesthesia period I and recovery-form-anesthesia period II after induction and the brain tissues were taken immediately.CAMP content was measured by ELISA in different brain areas.The results showed that the cAMP content in cerebrum，hippocamp，thalamus，cerebellum and brainstem was significantly increased and was restored to normal levels in recovery-form-anesthesia period I and recovery-form-anesthesia period II.This trend was consistent with behavioral change of goats after midazolam anesthesia.The anesthesia effect of midazolam may be related to activating the cAMP signal transduction system in various encephalic regions of goats.

midazolam ； cAMP ； goat

GAO Li

2015-10-21

國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目(31372491，31572580)

郭岑(1992-)，女，碩士生，從事獸醫(yī)麻醉研究工作，E-mail：554892820@qq.com

高利，E-mail：gaoli43450@163.com

S859.791

A

0529-6005(2016)11-0115-03