禽IL-2單克隆抗體的制備與鑒定

付夢(mèng)姣 ， 王永強(qiáng) ， 曹 紅 ， 李曉齊 ， 鄭世軍

(中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院農(nóng)業(yè)生物技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 ， 北京海淀100193)

禽IL-2單克隆抗體的制備與鑒定

付夢(mèng)姣 ， 王永強(qiáng) ， 曹 紅 ， 李曉齊 ， 鄭世軍

(中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院農(nóng)業(yè)生物技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 ， 北京海淀100193)

為制備禽源IL-2的單克隆抗體，首先構(gòu)建chIL-2的原核表達(dá)載體并進(jìn)行表達(dá)，用HIS-IL-2蛋白免疫BALB/c小鼠，經(jīng)3次免疫后，取小鼠脾與骨髓瘤細(xì)胞sp2/0 融合，應(yīng)用間接ELISA 方法篩選陽(yáng)性雜交瘤，最終獲得3 株穩(wěn)定分泌chIL-2 抗體的雜交瘤，分別命名為1C2，2F2和4B5。并對(duì)所獲得單抗的特性進(jìn)行了鑒定，結(jié)果表明，3株單抗亞型均為IgG1，抗體親和力解離常數(shù)(Kd)分別為4.81×10-10、1.36×10-10、4.15×10-9，均為高親和力抗體，經(jīng)過(guò)Western Blot 確定3株單抗分別識(shí)別chIL-2的不同區(qū)域，且均能特異性識(shí)別chIL-2。該單抗的制備為chIL-2的功能研究和應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

禽源IL-2 ； 原核表達(dá) ； 單克隆抗體

IL-2(Interleukin-2)主要是由T細(xì)胞產(chǎn)生的具有重要免疫調(diào)節(jié)作用的細(xì)胞因子。1976 年Morgan 等[1]發(fā)現(xiàn)小鼠脾細(xì)胞培養(yǎng)上清液中有一種能夠促進(jìn)和維持T 細(xì)胞在體外長(zhǎng)期生長(zhǎng)的因子，將其稱為T 細(xì)胞生長(zhǎng)因子(T cell growth factor，TCGF)，1979 年統(tǒng)一命名為IL-2，1983 年Taniguchi等[2]從ConA 刺激的Jurkat T 細(xì)胞系中首次成功克隆出人IL-2 基因并成功表達(dá)，此后多種哺乳動(dòng)物及反芻動(dòng)物的IL-2 基因被相繼成功克隆出來(lái)[3]。1997 年，Sundick 等[4]用ConA 激活的雞脾淋巴細(xì)胞構(gòu)建了一個(gè)cDNA 文庫(kù)，獲得了雞IL-2 基因。Hilton 等[5]的研究表明，作為第一個(gè)非哺乳動(dòng)物IL-2 基因克隆，雞IL-2 表現(xiàn)了與哺乳動(dòng)物相似的生物學(xué)活性。由于雞IL-2 與哺乳動(dòng)物的IL-2差異較大，且具有很強(qiáng)的種屬特異性[6-7]，使許多可在哺乳動(dòng)物中成功應(yīng)用的技術(shù)和方法都無(wú)法有效地應(yīng)用于雞IL-2 的研究，本研究通過(guò)制備雞IL-2單克隆抗體，為深入研究雞IL-2的生物學(xué)功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌種、質(zhì)粒、蛋白、細(xì)胞及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 大腸桿菌E.coliBL21、Rosetta、DH5α，骨髓瘤細(xì)胞sp2/0，質(zhì)粒pGEX-6p-1、pET-28a 為本實(shí)驗(yàn)室保存，標(biāo)簽蛋白His-IL-10、His-IFN-γ、His-IFN-β為本實(shí)驗(yàn)室保存。BALB/c 小鼠，購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所。

1.2 主要試劑與儀器設(shè)備 限制性內(nèi)切酶、LATaq酶和DNA 連接酶，購(gòu)自TaKaRa 公司。dNTPs，購(gòu)自CNS 公司；DNA 膠回收試劑盒，購(gòu)自ZYMO RESEARCH 公司；高純度質(zhì)粒小量快速提取試劑盒，購(gòu)自北京艾德萊公司；Ni-NTA 親和純化柱，購(gòu)自德國(guó)Qiagen 公司；Glutathione Sephrose 4B 凝膠，購(gòu)自GE Healthcare BioSciences AB 公司；鼠源His-tag與GST-tag 單克隆抗體，購(gòu)自Abmart 公司；HRP 標(biāo)記山羊抗小鼠IgG 二抗，購(gòu)自北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司；DMEM高糖培養(yǎng)基，購(gòu)自Gibco公司；標(biāo)準(zhǔn)胎牛血清，購(gòu)自Hyclone 公司；弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑、HAT、HT 和鼠單抗亞型分型試劑，均購(gòu)自Sigma 公司。PEG 4000，購(gòu)自MERCK 公司；Centrifuge5810R 型低溫冷凍高速離心機(jī)，購(gòu)自Eppendorf 公司；Alpha ImagerTM2200 型凝膠成像分析儀，購(gòu)自美國(guó)Alpha 公司；KoDak 醫(yī)學(xué)X 光顯影機(jī)102 型，購(gòu)自美國(guó)KoDak 公司；Sunrise型96 孔酶標(biāo)儀，購(gòu)自TECAN 公司。

1.3 chIL-2 原核表達(dá)載體構(gòu)建及蛋白純化 取感染球蟲的雞脾淋巴細(xì)胞，提取其總mRNA 進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，以反轉(zhuǎn)得到的cDNA 為模板，根據(jù)NCBI上發(fā)布的禽源IL-2 的序列(NO.AM231331.1)設(shè)計(jì)引物：F,5′-ATGATGTGCAAAGTACTGATCTTT-3′；R,5′-TTATTTTTGCAGATATCTCAC-3′，將擴(kuò)增得到的特異性條帶回收后連接至T 載體，轉(zhuǎn)化至DH5α，以測(cè)序正確的載體為模板，用含有酶切位點(diǎn)BamHI 和EcoRI 的特異性引物(F,5′-CGCGGATCCATGATGTGCAAAGTACTGATCTTT-3′；R,5′-CCGGAATTCTTATTTTTGCAGATATATAAC-3′)將chIL-2 擴(kuò)增出來(lái)，雙酶切后連接到酶切過(guò)的pET-28a 和pGEX-6p-1 載體上，轉(zhuǎn)化入DH5α，通過(guò)菌落PCR 檢測(cè)并將雙酶切鑒定的陽(yáng)性樣本進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序正確者即載體構(gòu)建成功。

將構(gòu)建成功的質(zhì)粒pET-28a-chIL-2與pGEX-6p-1-chIL-2分別轉(zhuǎn)化工程菌，進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。通過(guò)SDS-PAGE分析蛋白表達(dá)情況并用Western Blot進(jìn)行驗(yàn)證。確定蛋白表達(dá)之后進(jìn)行大量誘導(dǎo)表達(dá)，通過(guò)包涵體復(fù)性或親和層析的方法對(duì)所獲得蛋白進(jìn)行純化，純化后的蛋白分別用作免疫小鼠和陽(yáng)性雜交瘤篩選抗原。

1.4 chIL-2單克隆抗體的制備 小鼠經(jīng)過(guò)3次免疫后，以ELISA方法測(cè)定chIL-2陽(yáng)性血清效價(jià)，效價(jià)合格者用于細(xì)胞融合。小鼠免疫程序參照文獻(xiàn)[8]進(jìn)行，細(xì)胞融合、陽(yáng)性雜交瘤篩選參照文獻(xiàn)[9]。腹水的制備及單抗的純化按照文獻(xiàn)[10]所述方法進(jìn)行。

1.5 chIL-2單克隆抗體的鑒定

1.5.1 單體Ig 亞類鑒定 單抗亞類的鑒定按照Sigma 公司的鼠單抗亞型分型試劑鑒定試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。

1.5.2 單抗親和力的測(cè)定 應(yīng)用間接ELISA 法，以1 μg/mL 的濃度用GST-chIL-2 包被酶標(biāo)板，封閉后加入倍比稀釋的純化單抗進(jìn)行孵育，以HRP標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG 為二抗，酶標(biāo)儀讀取OD450nm 吸光值。連續(xù)幾個(gè)稀釋度的OD450nm 讀數(shù)不再增大時(shí)視為抗原抗體100%結(jié)合，以抗體濃度(mol/L)為橫坐標(biāo)，OD450nm 吸光值為縱坐標(biāo)做散點(diǎn)圖，以讀數(shù)最大值一半時(shí)抗原抗體結(jié)合率為50%，生成對(duì)數(shù)趨勢(shì)線和公式。將OD450nm 最大值的一半代入公式，求出此時(shí)的抗體濃度即為親和力解離常數(shù)(Kd)。

1.5.3 單抗腹水效價(jià)測(cè)定 制備前1 周，按照500 μL/只向小鼠腹腔內(nèi)注射石蠟，雜交瘤擴(kuò)大培養(yǎng)后，每只小鼠按照106個(gè)細(xì)胞數(shù)腹腔注射200 μL 雜交瘤細(xì)胞懸液，6 d 后，小鼠腹圍明顯增大，采集腹水，用間接ELISA法測(cè)定腹水效價(jià)。

1.5.4 單抗特異性鑒定 分別用原核表達(dá)的His-chIL-2、His-chIL-10、His-chIFN-γ 以及His-chIFN-β進(jìn)行單抗特異性的鑒定，將不同蛋白稀釋一定倍數(shù)后進(jìn)行Western Blot，分別用稀釋的單抗(1∶5 000)或His 單抗(1∶10 000)作為一抗，檢測(cè)所得單抗對(duì)常見的不同細(xì)胞因子的交叉反應(yīng)。

1.5.5 Western Blot分析單抗識(shí)別抗原表位 ChIL-2 全長(zhǎng)132 個(gè)氨基酸，其N 端有一段大小為11 個(gè)氨基酸的信號(hào)肽區(qū)域[11]，故首先構(gòu)建了帶有HIS 標(biāo)簽的成熟的chIL-2，共121 個(gè)氨基酸，然后分別從其C 端和N 端以40 個(gè)氨基酸為單位進(jìn)行截短，命名為Δ1、Δ2。用稀釋的單抗作為一抗進(jìn)行Western Blot檢測(cè)，確定各株單抗的識(shí)別區(qū)域。

2 結(jié)果

2.1 原核表達(dá)載體構(gòu)建及蛋白純化 從雞的脾淋巴細(xì)胞中成功克隆出432 bp 大小的chIL-2 基因，與預(yù)期一致(見圖1A)。經(jīng)BamHI、EcoRI 雙酶切驗(yàn)證成功(見圖1B-C)，構(gòu)建出pET-28a-chIL-2、pGEX-6p-1-chIL-2 重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)入工程菌后成功表達(dá)出目的蛋白。分別利用包涵體復(fù)興及親和層析的方法對(duì)目的蛋白進(jìn)行純化，均獲得較好的純化效果(見圖1D-E)。

2.2 chIL-2 單克隆抗體的制備 經(jīng)3 次免疫后，小鼠血清中chIL-2 抗體效價(jià)達(dá)到1∶128 000。細(xì)胞融合后利用間接ELISA方法對(duì)融合后細(xì)胞上清中chIL-2抗體進(jìn)行檢測(cè)，共篩到6株陽(yáng)性雜交瘤，經(jīng)過(guò)3 次亞克和擴(kuò)繁最終獲得3 株可穩(wěn)定分泌chIL-2抗體的雜交瘤細(xì)胞株，分別命名為1C2，2F2，4B5。雜交瘤細(xì)胞注射小鼠腹腔進(jìn)行腹水制備，經(jīng)測(cè)定，3株單克隆抗體腹水的效價(jià)分別為：1C2：5.12×107，2F2:6.4×106,4B5:1.28×107。并將腹水純化獲得純化單抗。

圖1 重組表達(dá)載體的構(gòu)建及融合蛋白的純化

A：chIL-2基因的克隆； B、C：重組表達(dá)載體pET-28a-chIL-2、pGEX-6p-1-chIL-2的雙酶切驗(yàn)證；D、E：目的蛋白His-chIL-2、GST-chIL-2的純化

2.3 單克隆抗體性質(zhì)的鑒定

2.3.1 單抗亞類的確定 根據(jù)抗體檢測(cè)試劑盒單抗亞類檢測(cè)方法，確定出3 株單抗的亞型均為IgG1。

2.3.2 單抗的純化及親和力測(cè)定 利用飽和硫酸銨法對(duì)所得腹水進(jìn)行純化，對(duì)純化后的單抗進(jìn)行親和力測(cè)定，3 株雜交瘤分泌的單抗親和力解離常數(shù)(Kd)分別為4.81×10-10(1C2)、1.36×10-10(2F2)以及4.15×10-9(4B5)，均為高親和力抗體(見圖2A～C)。

2.3.3 單抗識(shí)別抗原表位分析及特異性鑒定 經(jīng)Western Blot 驗(yàn)證3 株單抗分別識(shí)別的區(qū)域，單抗1C2 識(shí)別chIL-2 的1～40 位氨基酸，2F2 識(shí)別chIL-2 的81～121 位氨基酸，4B5 識(shí)別chIL-2 的41～80 位氨基酸(見圖3A-C)。即共獲得3 株分別識(shí)別不同位點(diǎn)的單抗。并且3株單抗均不能識(shí)別HIS 標(biāo)簽的其他細(xì)胞因子，表現(xiàn)出良好的特異性(見圖3D)。

3 討論

IL-2 是免疫應(yīng)答所必需的細(xì)胞因子，在T 細(xì)胞生長(zhǎng)和分化、B細(xì)胞發(fā)育及NK細(xì)胞激活方面發(fā)揮重要的作用[12-13]。目前，許多的病原感染畜禽后會(huì)通過(guò)損害機(jī)體的免疫器官或免疫細(xì)胞造成免疫抑制或損傷。雖然對(duì)于各病原造成免疫抑制的機(jī)理尚不完全清楚，但有研究表明，多種病原所引起的免疫抑制與IL-2或IL-2R的表達(dá)紊亂有關(guān)[14]。李慶章等[15]報(bào)道，雞馬立克病病毒和雞傳染性貧血病毒感染后，雞胸腺、脾臟T細(xì)胞對(duì)有絲分裂原反應(yīng)下降，IL-2 分泌受到抑制。這些研究表明，病毒可能通過(guò)直接或間接干擾IL-2 合成導(dǎo)致免疫抑制。

目前，國(guó)內(nèi)對(duì)于IL-2 的研究主要集中于哺乳動(dòng)物尤其是人IL-2，而對(duì)雞IL-2 的研究還十分有限，但因?yàn)镮L-2 具有種屬特異性，雞IL-2 與哺乳動(dòng)物IL-2 同源性相差較大，無(wú)交叉反應(yīng)性，故目前很多可用于哺乳動(dòng)物的實(shí)驗(yàn)技術(shù)及從市面上商品化的檢測(cè)試劑盒不能用于雞IL-2 的研究，極大的限制了對(duì)于雞IL-2的深入研究。

在本研究中，我們利用誘導(dǎo)表達(dá)的His-chIL-2 蛋白免疫小鼠，按照常規(guī)方法取脾與骨髓瘤細(xì)胞進(jìn)行融合，同時(shí)用GST-chIL-2 作為篩選蛋白，利用間接ELISA 方法篩選陽(yáng)性雜交瘤。經(jīng)過(guò)3 次亞克隆后共獲得3株能穩(wěn)定分泌chIL-2抗體的雜交瘤。經(jīng)過(guò)一系列特性檢測(cè)確定此3 株單抗均有較好的特異性和較高的親和力，而且這些單抗識(shí)別不同的抗原表位區(qū)域。在確定單抗識(shí)別的抗原表位區(qū)域時(shí)，由于chIL-2 的N 端有一段大小為11個(gè)氨基酸的信號(hào)肽，為了能更好的篩選到識(shí)別chIL-2 的單抗，故首先設(shè)計(jì)了去除信號(hào)肽的成熟chIL-2 即MIL-2，大小約121 個(gè)氨基酸，在此基礎(chǔ)上又分別從其C 端和

圖2 chIL-2單克隆抗體親和力的測(cè)定

圖3 單抗識(shí)別抗原表位分析及特異性鑒定

A：各截短蛋白示意圖 ； B：Western Blot分析3株單抗對(duì)不同截短蛋白的識(shí)別情況 ；C：3株單抗抗原表位識(shí)別區(qū)域示意圖 ； D：3株單抗特異性鑒定N端以40個(gè)氨基酸為一段對(duì)成熟chIL-2進(jìn)行截短。在WesternBlot中，MIL-2有時(shí)會(huì)曝出兩條帶，用抗His單抗作為一抗曝出的條帶尤為明顯。其原因是由于蛋白發(fā)生部分降解，故會(huì)曝出一條小于MIL-2正常大小的條帶，而與單抗的特異性無(wú)關(guān)。綜上所述，本研究所獲得的3株chIL-2單抗具有特異性好、效價(jià)高的優(yōu)點(diǎn)，可用于建立檢測(cè)雞IL-2方法或試劑盒，為深入研究雞IL-2的生物學(xué)作用提供物質(zhì)基礎(chǔ)。

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Development and identification of monoclonal antibodies against chIL-2

FU Meng-jiao ， WANG Yong-qiang ， CAO Hong ，LI Xiao-qi ， ZHENG Shi-jun

(State Key Laboratory of Agrobiotechnology，College of Veterinary Medicine，China Agricultural University，Beijing 100193，China)

To develop monoclonal antibodies against chicken IL-2，We constructed the prokaryotic expression vector of chIL-2 and expressed His-chIL-2 protein first，and then immunized BALB/c mice with purified HIS-IL-2 protein.After three-time immunizations we obtained hybridomas via fusion of mouse spleen with sp2/0 myeloma.Indirect ELISA method was used to screen fused cells for positive hybridomas.Finally we got three hybridomas that could stably secret chIL-2 McAbs，and these hybridomas were named 1C2，2F2，and 4B5 respectively.The characteristics of the three McAbs were determined，and the results showed that the isotypes of these McAbs were IgG1.We examined the dissociation constants(Kd)of these McAbs，and found that their Kds were 4.81×10-10，1.36×10-10，4.15×10-9，respectively.The recognizing domains of chIL-2 by 1C2，2F2 and 4B5 were located in three different areas as demonstrated by Western Blot analysis.And three monoclonal antibodies could specifically recognize chIL-2.These McAbs would help to elucidate the functions of chIL-2.

chIL-2 ; prokaryotic expression ; monoclonal antibodies

s: ZHENG Shi-jun ； LI Xiao-qi

2015-08-11

現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項(xiàng)資金(NYCYTX-41)

付夢(mèng)姣(1989-)，女，博士生，從事預(yù)防獸醫(yī)學(xué)研究，E-mail：rainshenmin@163.com

鄭世軍，sizheng@cau.edu.cn；李曉齊，leexiaoqi@cau.edu.cn

S852.4

A

0529-6005(2016)11-0006-04