評(píng)價(jià)膽紅素對(duì)肌氨酸氧化酶法測(cè)定肌酐的干擾

張淑華，李云鳳，趙寶鶴，張吉奎，楊亞軒，高文育，徐福海，鄭福和，于水江，王華新

（1.黃驊開發(fā)區(qū)博愛醫(yī)院，河北 黃驊 061100；2.唐山市豐潤區(qū)疾控中心，河北 唐山 063000）

評(píng)價(jià)膽紅素對(duì)肌氨酸氧化酶法測(cè)定肌酐的干擾

張淑華1，李云鳳1，趙寶鶴2，張吉奎1，楊亞軒1，高文育1，徐福海1，鄭福和1，于水江1，王華新1

（1.黃驊開發(fā)區(qū)博愛醫(yī)院，河北 黃驊 061100；2.唐山市豐潤區(qū)疾控中心，河北 唐山 063000）

目的評(píng)價(jià)膽紅素對(duì)肌氨酸氧化酶法測(cè)定肌酐（Cr）的干擾。方法隨機(jī)選擇國內(nèi)威高、長征、九強(qiáng)、生之源、基蛋、利德曼6種肌氨酸氧化酶法Cr試劑盒，按照美國臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)EP 7-A2文件中“配對(duì)差異”和“劑量效應(yīng)”方案，在正常和高值 Cr血清中添加不同濃度結(jié)合膽紅素（CBIL）和游離膽紅素（FBIL）干擾物，進(jìn)行干擾評(píng)價(jià)試驗(yàn)。結(jié)果CBIL和FBIL對(duì)肌氨酸氧化酶法測(cè)定Cr存在不同程度的干擾。Cr正常水平，CBIL和FBIL≥120μmol／L時(shí)對(duì)威高、基蛋Cr試劑產(chǎn)生明顯干擾，CBIL≥621μmol／L或 FBIL≥481μmol／L時(shí)對(duì)九強(qiáng)、生之源、長征 Cr試劑產(chǎn)生干擾；Cr高值水平，CBIL或FBIL≥120μmol／L時(shí)對(duì)威高 Cr試劑產(chǎn)生干擾，CBIL≥962μmol／L或 FBIL≥1083μmol／L時(shí)對(duì)長征 Cr試劑產(chǎn)生干擾。干擾所產(chǎn)生的相對(duì)偏倚差異顯著，CBIL較比FBIL干擾作用更加明顯?！皠┝啃?yīng)”結(jié)果顯示，膽紅素對(duì) Cr測(cè)定產(chǎn)生負(fù)干擾并呈線性關(guān)系。結(jié)論國內(nèi)肌氨酸氧化酶法測(cè)定 Cr試劑抗膽紅素干擾能力不同，膽紅素對(duì) Cr測(cè)定產(chǎn)生負(fù)干擾并呈線性關(guān)系。臨床實(shí)驗(yàn)室在應(yīng)用肌氨酸氧化酶法測(cè)定 Cr時(shí)應(yīng)進(jìn)行膽紅素干擾試驗(yàn)驗(yàn)證。

肌氨酸氧化酶法； 肌酐； 膽紅素干擾； 干擾試驗(yàn)

肌酐（creatinine，Cr）是人體肌肉組織中肌酸及磷酸肌酸代謝終產(chǎn)物，血液中 Cr水平受飲食中攝取的外源性 Cr及人體內(nèi)產(chǎn)生的內(nèi)源性 Cr的影響，正常成人Cr生成速率基本穩(wěn)定，血 Cr及尿 Cr測(cè)定廣泛應(yīng)用于評(píng)估腎小球?yàn)V過功能。國內(nèi)大多實(shí)驗(yàn)室已將 Cr的Jaff堿性苦味酸法改進(jìn)為酶法，在 3種酶法中應(yīng)用較多的是肌酐酸偶聯(lián)肌氨酸氧化酶法（簡(jiǎn)稱酶法）。該法以Tinder為反應(yīng)指示，該反應(yīng)體系中易受膽紅素、維生素 C等還原性物質(zhì)干擾［1］，膽紅素的干擾可用亞鐵氰化鉀或膽紅素氧化酶等清除。為評(píng)估國內(nèi)肌酐酸偶聯(lián)肌氨酸氧化酶法測(cè)定Cr抗膽紅素干擾能力，隨機(jī)選擇國內(nèi)6家不同 Cr試劑，依據(jù)美國臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)（CLSI）EP 7-A2文件進(jìn)行“配對(duì)差異”和“劑量效應(yīng)”試驗(yàn)。

材料和方法

1 研究樣本

選取門（急）診、住院患者血清標(biāo)本中，外觀無溶血、黃疸、乳糜的正常和高值 Cr混合新鮮血清各20mL分為2管，1管用于批內(nèi)精密度試驗(yàn)，1管用于“配對(duì)差異”試驗(yàn)。

2 試劑和儀器

隨機(jī)選擇6種國內(nèi) Cr試劑及配套校準(zhǔn)品：山東威高批號(hào)20151201A、上海長征批號(hào)D1511083、武漢生之源批號(hào) 16030727-A2、北京九強(qiáng)批號(hào)15-1029、吉林 基 蛋 批號(hào) S20151116、北 京利 德 曼 批 號(hào)5111911。質(zhì)控品購 自伯樂 （BIO-RAD）批號(hào) 為lot14491、lot14492；干擾試劑盒為 Sysmex公司 APlus試劑盒，批號(hào) ZS4003。檢測(cè) 儀器 為Beckman5811全自動(dòng)生化分析儀。

3 方法

3.1 Beckman5811全自動(dòng)生化分析儀校準(zhǔn)和質(zhì)控

測(cè)試參數(shù)、儀器校準(zhǔn)按照試劑說明書和儀器說明書設(shè)置、校準(zhǔn)。在進(jìn)行樣本測(cè)定前按照質(zhì)控 SOP文件進(jìn)行室內(nèi)質(zhì)控，在控時(shí)進(jìn)行樣本檢測(cè)。

3.2 批內(nèi)精密度

按照 CLSI EP5-A2實(shí)驗(yàn)方案和要求進(jìn)行精密度評(píng)價(jià)。Cr正常和高值 2種水平混合新鮮血清，用6種試劑在1天內(nèi)每批間隔重復(fù)測(cè)試10次，按照 EP5-A2方案剔除離群值，計(jì)算均值（x）、標(biāo)準(zhǔn)差（s）、CV%值。根據(jù)我國WS／T 403-2012《臨床生物化學(xué)檢驗(yàn)常規(guī)項(xiàng)目分析質(zhì)量目標(biāo)》規(guī)定，Cr最大允許CV%為4.0%［1］，本研究規(guī)定≤4.0%為批內(nèi)精密度要求。

3.3 配對(duì)差異實(shí)驗(yàn)

3.3.1 樣本準(zhǔn)備

（1）參考 EP 7-A2文件，選擇 Cr正常值和高值血清作為基礎(chǔ)樣本。

（2）按照 A-Plus試劑盒要求復(fù)溶結(jié)合膽紅素（CBIl）、游離膽紅素（FBIl）干擾試劑和空白液，復(fù)溶后干擾物FBIl和 CBIl濃度為3610μmol／L。

（3）分別用基礎(chǔ)樣本稀釋復(fù)溶后的膽紅素干擾試劑和 空 白 液，稀釋 后 FBIl和 CBIl濃度 為1203μmol／L。將Cr正常值含 CBIl干擾試劑記作A1，Cr正常值含 CBIl空白液記作 B1，Cr正常值含F(xiàn)BIl干擾試劑記作C1，Cr正常值含F(xiàn)BIl空白液記作D1；Cr高值含CBIl干擾試劑記作A2，Cr高值含CBIl空白液記作B2，Cr高值含F(xiàn)BIl干擾試劑記作C2，Cr高值含 FBIl空白液記作 D2。

（4）按照 B1-A1、D1-C1、B2-A2、D2-C2配對(duì)稀釋，稀釋后 CBIl、FBIl系列濃度為1203、1083、962、842、722、602、481、361、241、120、0μmol／L共 22個(gè)樣品。

3.3.2 確定重復(fù)測(cè)定次數(shù)

計(jì)算某濃度水平可接受的最大允許干擾值（dmax）與批內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)差（s）比值，查 dmax／s重測(cè)對(duì)應(yīng)表［2］，根據(jù)我國WS／T 403-2012《臨床生物化學(xué)檢驗(yàn)常規(guī)項(xiàng)目分析質(zhì)量目標(biāo)》規(guī)定，Cr允許最大bias為5.5%。

3.3.3 干擾效應(yīng)

按照交互順序檢測(cè) 22個(gè)樣品。正常及高值 Cr檢測(cè)結(jié)果偏倚超過 dmax時(shí)為產(chǎn)生干擾效應(yīng)。若存在干擾效應(yīng)則進(jìn)行干擾計(jì)量效應(yīng)分析。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

結(jié)果通過分析軟件SPSS 22分析，計(jì)算x、s、CV，用最小二乘法進(jìn)行回歸分析，確定斜率、截距。

結(jié) 果

1 精密度

6種Cr試劑盒批內(nèi) CV均符合 WS／T 403-2012《臨床生物化學(xué)檢驗(yàn)常規(guī)項(xiàng)目分析質(zhì)量目標(biāo)》規(guī)定Cr最大允許 CV%為4.0%的要求，可以進(jìn)行干擾試 驗(yàn)研究。具體數(shù)據(jù)見表1。

表 16種國內(nèi) Cr試劑日內(nèi)精密度及 dmax／s（n＝10）

2 配對(duì)差異試驗(yàn)

2.1 重復(fù)測(cè)定次數(shù)的確定

從表1可見，6種試劑檢測(cè) Cr正常值 dmax／s接近 2.5，經(jīng)查表［2］，樣本重復(fù)次數(shù)為 5次；Cr高值dmax／s最小值為 3.25＞3，查表確定重復(fù)測(cè)定次數(shù)為3次。

2.2 干擾效應(yīng)

干擾效應(yīng)判斷標(biāo)準(zhǔn)：基礎(chǔ)Cr濃度 ×（1-5.5%）為 cut-off值，當(dāng)檢測(cè)值＜cut-off值時(shí)可判斷為產(chǎn)生干擾。6種試劑測(cè)定正常和高值Cr的 cut-off值見表2。

根據(jù)表2中 cut-off值，分析表3、表4數(shù)據(jù)表明，膽紅素對(duì)6種試劑檢測(cè) Cr均存在干擾，但產(chǎn)生干擾時(shí)膽紅素濃度差異較大。Cr正常水平，CBIL和FBIL≥120μmol／L時(shí)對(duì)威高、基蛋試劑產(chǎn)生明顯干擾，CBIL≥621μmol／L或 FBIL≥481μmol／L時(shí)對(duì)九強(qiáng)、生之源、長征試劑產(chǎn)生干擾；Cr高值水平，CBIL或FBIL≥120μmol／L時(shí)對(duì)威高試劑產(chǎn)生干擾，CBIL≥962μmol／L或FBIL≥1083μmol／L時(shí)對(duì)長征試劑產(chǎn)生干擾。361μmol／L CBIL、FBIL干擾產(chǎn)生的相對(duì)偏倚見表5。從表3和表4結(jié)果計(jì)算可知，相同濃度干擾物對(duì)不同廠家的試劑所產(chǎn)生干擾的相對(duì)偏倚差異顯著，以上數(shù)據(jù)也顯示，相同濃度下CBIL對(duì)測(cè)定Cr干擾強(qiáng)于 FBIL，威高和基蛋試劑表現(xiàn)更加明顯（P＜0.05）。

表2 6種試劑測(cè)定Cr干擾效應(yīng) cut-off值（μmol／L）

表3 CBIL和 FBIL干擾正常 Cr水平檢測(cè)結(jié)果（x，μmol／L）

表4 CBIL和 FBIL干擾高值 Cr水平檢測(cè)結(jié)果（x，μmol／L）

表5 361μmol／L CBIL、FBIL濃度產(chǎn)生的相對(duì)偏倚（%）

根據(jù)表2、表3和表4比較 CBIL和 FBIL產(chǎn)生干擾效應(yīng)濃度，見圖1、圖2。

圖 1和圖 2顯示，威高和基蛋試劑抗膽紅素干擾能力較弱，九強(qiáng)和長征抗膽紅素干擾能力較強(qiáng)。

2.3 劑量效應(yīng)

除長征和九強(qiáng)在膽紅素極高濃度下產(chǎn)生干擾且產(chǎn)生較小偏倚外，其他4種試劑測(cè)定正常和高值Cr膽紅素均產(chǎn)生了明顯干擾效應(yīng)，膽紅素對(duì)測(cè)定產(chǎn)生負(fù)干擾，4種試劑劑量效應(yīng)分析結(jié)果見表6。

表6 CBIL和 FBIL劑量效應(yīng)分析

討 論

膽紅素（bilirubin）是由體內(nèi)鐵卟啉化合物代謝產(chǎn)生的具有抗氧化性的混合物，主要有兩種存在形式，一類與白蛋白結(jié)合的稱為結(jié)合膽紅素（CBIL），另一類未與白蛋白結(jié)合的稱為游離膽紅素（FBIl）。膽紅素不僅因顏色特性對(duì)比色檢測(cè)方法有干擾，而且因其具有抗氧化性對(duì) Tinder反應(yīng)指示的反應(yīng)體系也有干擾。膽紅素對(duì)酶法測(cè)定肌酐產(chǎn)生負(fù)干擾，這是因?yàn)槟懠t素作為還原劑與 Tinder反應(yīng)體系中氧化劑 H2O2發(fā)生反應(yīng)，使得終產(chǎn)物減少，如在R1試劑中加入亞鐵氰化鉀、抗壞血酸氧化酶、膽紅素氧化酶等可消除膽紅素的干擾［3］。

Nah［4］調(diào)查了4種酶法和2種 Jaffe法測(cè)定 Cr試劑，調(diào)查結(jié)果顯示，4種酶法試劑不受總膽紅素（中位數(shù)165.1μmol／L，范圍75.58～330.17μmol／L）干擾；國秀芝［5］調(diào)查比較了 4種國產(chǎn)和 2種進(jìn)口酶法Cr試劑抗膽紅素干擾能力，當(dāng) CBIL≤332μmol／L、FBIL≤327μmol／L時(shí)對(duì)6種Cr試劑無干擾。本次研究隨機(jī)選擇的國內(nèi)6種酶法試劑，結(jié)果顯示，除了長征和九強(qiáng)試劑外，威高、基蛋、利德曼、生之源4種試劑受 CBIL、FBIL干擾明顯，CBIL比FBIL干擾相對(duì)較強(qiáng)。當(dāng)CBIL濃 度 接 近 國 秀 芝［5］試驗(yàn)濃度（332μmol／L）時(shí)，正常 Cr水平，威高、基蛋、利德曼、生之源試劑相對(duì)偏倚分別為 47.10%、24.65%、9.33%、9.25%；高值 Cr水平，威高、基蛋、利德曼、生之源試劑相對(duì)偏倚分別為 30.55%、13.72%、5.96%、5.60%。相對(duì)偏倚均超過我國 WS／T 403-2012《臨床生物化學(xué)檢驗(yàn)常規(guī)項(xiàng)目分析質(zhì)量目標(biāo)》中規(guī)定的Cr允許最大 bias為 5.5%的標(biāo)準(zhǔn)［1］。6種酶法 Cr試劑盒抗膽紅素干擾能力差異明顯，推測(cè)可能是試劑中添加破壞膽紅素干擾物質(zhì)的量不同。

Cr是臨床最常用的腎功能指標(biāo)，是評(píng)估腎小球?yàn)V過率（GFR）的重要參數(shù)，檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性直接影響腎病分期、評(píng)估預(yù)后［6］。對(duì)急性或慢性腎病合并黃疸時(shí)或黃疸合并腎病患者，能避免膽紅素干擾而準(zhǔn)確檢測(cè) Cr，正確評(píng)估 GFR顯得尤為重要。應(yīng)用酶法檢測(cè) Cr時(shí)進(jìn)行抗干擾能力性能驗(yàn)證，若存在明顯干擾時(shí)可經(jīng)劑量效應(yīng)試驗(yàn)建立回歸方程，對(duì)測(cè)定結(jié)果進(jìn)行回歸分析可得出較為準(zhǔn)確的結(jié)果。

CBIL和 FBIL都均有抗氧化劑作用，對(duì)測(cè)定Cr都具有干擾作用，但干擾效應(yīng)不同，其產(chǎn)生機(jī)制尚待進(jìn)一步研究。

總之，本研究發(fā)現(xiàn)國內(nèi)酶法 Cr試劑抗膽紅素能力存在顯著差異，膽紅素對(duì)Cr測(cè)定存在負(fù)干擾并呈線性關(guān)系。試劑廠家應(yīng)在說明書中明確其抗干擾能力，臨床實(shí)驗(yàn)室在應(yīng)用時(shí)應(yīng)進(jìn)行干擾試驗(yàn)驗(yàn)證。

［1］尚紅，王毓三，申子瑜.全國臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程.第4版.北京：人民衛(wèi)生出版社，2015：309-1015.

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（李 雁 張?jiān)鑫渚庉嫞?/p>

Evaluation of Biliruin Interference of Creatinine by Sarcosine Oxidase Method

ZHANG Shu-hua，LI Yun-feng，ZHAO Bao-he，ZHANG Ji-kui，YANG Ya-xuan，GAO Wen-yu，XU Fu-hai，ZHENG Fu-he，YU Shui-jiang，WANG Hua-xin
（Boai Hospital of Huanghua City，Huanghua 061100，China）

ObjectiveTo investigate the interference and result bias of bilirubin by Sarcosine oxidase method in determination of creatinine.MethodsTo evaluate the anti-interference ability，we randomly selected 6 kinds ofSarcosine oxidase method forthe determination ofcreatinine（WEIGAO，CHANGZHENG，SHENGZHIYUAN，JIUQIANG，JIDAN，LIDEMAN）.According to the“paired difference”and“doseresponse”documents from Clinical and Laboratory Standards Institute NCCLS EP7-A2， the interference tests were conducted by adding different concentrations of conjugated bilirubin（CBIL）and freed bilirubin（FBIL）to normal and high levels creatinine in serum.ResultsThe CBIL and FBIL had different degrees of interference to the determination of creatinine，but the anti-interference ability of the reagents was different.At normal creatinine level，WEIGAO or JIDAN revealed interference when CBIL and FBIL≥120μmol／L.When CBIL≥621 μmol／L or FBIL≥481 μmol／L，JIUQIANG，SHENGZHIYUAN and CHANGZHENG revealed interference.At high creatinine levels，WEIGAO also demonstrated interference with CBIL or FBIL≥120μmol／L，CHANGZHENG with≥962 μmol／L CBIL and CHANGZHENG with≥1083 μmol／L FBIL respectively.The relative bias caused by interference was significantly different.The CBIL interference effect was more obvious than the FBIL.The results of“dose-response”showed that there was a negative interference in the determination of serum creatinine with bilirubin，and there was a linear function relationship.ConclusionThe interference ability of anti bilirubin interference in the determination of creatinine reagent was different，and there was a negative interference in the determination of serum creatinine withbilirubin and there was a linear function with them.Clinical laboratories should always conduct validation of bilirubin interference for the determination of creatinine by sarcosine oxidase method.

Sarcosine oxidase method； Creatinine； Bilirubin interference； Interference testing

10.11748／bjmy.issn.1006-1703.2016.12.032

2016-07-01；

2016-09-27

河北省衛(wèi)計(jì)委指令性課題（1120140226）

李云鳳。E-mail：wanghuaxin004＠163.com