不同強度運動對自發(fā)性高血壓大鼠血管內皮結構及功能影響的氧化應激機制

葉 芳，柏 平，曾凡星，石麗君

體育科學

不同強度運動對自發(fā)性高血壓大鼠血管內皮結構及功能影響的氧化應激機制

葉 芳，柏 平，曾凡星，石麗君

目的：觀察不同強度運動對自發(fā)性高血壓大鼠(spontaneously hypertensive rat，SHR)腸系膜動脈內皮結構及功能的影響，探討氧化應激在其中的作用機制。方法：選用3月齡雄性SHR和正常血壓大鼠(Wistar Kyoto，WKY)隨機分為安靜對照組(SHR-C，WKY-C)、中等強度運動組(SHR-M，WKY-M)和高強度運動組(WKY-H，SHR-H)。中等強度運動組以18～20 m/min、高強度運動組以26～28 m/min進行跑臺運動，坡度為0°，60 min/天，5天/周。8周運動訓練末進行無創(chuàng)尾動脈血壓測試、血清氧化應激指標檢測、內皮細胞超微結構透射電鏡觀察及腸系膜動脈微血管張力測定。結果：1)SHR-M的收縮壓和舒張壓顯著低于SHR-C(P<0.05)，而SHR-H顯著高于SHR-C(P<0.05)。2)血清氧化產物丙二醛(MDA)檢測顯示：SHR-C組血清MDA含量與WKY-C相比，均值有升高趨勢但不具有統計學差異(P>0.05)，SHR-M組MDA含量與SHR-C不具有顯著性差異(P>0.05)，但SHR-H血清MDA含量顯著高于SHR-C(P<0.05)；抗氧化物酶谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、過氧化物歧化酶(SOD)檢測顯示：SHR-C GSH-Px酶活力顯著低于WKY-C組(P<0.05)，SHR-M組和SHR-H組GSH-Px酶活力顯著高于SHR-C(P<0.05)。WKY-M SOD顯著高于WKY-C(P<0.05)，SHR運動組與SHR安靜組相比較SOD無統計學差異(P>0.05)。3)透射電鏡結果顯示：SHR-C和SHR-H組均表現為內皮細胞畸形、膠原纖維增生，而SHR-M血管內皮細胞形態(tài)完整。4)微血管張力測定結果顯示：SHR-C內皮依賴性血管舒張能力顯著小于WKY-C，SHR-M內皮依賴性血管舒張能力顯著高于SHR-C，而SHR-H顯著低于SHR-M(P<0.05)。結論：中等強度運動訓練可以降低高血壓大鼠血壓、改善內皮結構和功能，其機制可能與運動降低氧化應激水平相關。然而，高強度運動則上調氧化應激水平，加劇了高血壓誘導的內皮功能紊亂。

運動強度；高血壓；內皮；氧化應激

內皮細胞主要以旁分泌方式分泌血管活性物質，作用于臨近的組織、細胞。內皮細胞分泌的活性物質包括血管舒張因子(EDRF)和血管收縮因子(EDCF)，兩者共同作用于血管張力的調控。但是，在高血壓的病理條件下，全身阻力血管處于高應力狀態(tài)，通過打破EDRF和EDCF之間的平衡，直接造成內皮細胞形態(tài)結構的改變和功能的失調，加重高血壓的發(fā)生和發(fā)展。在已有研究中，高血壓大鼠模型中選用不同類型的動脈，如：大動脈(主動脈、頸動脈)、微血管(腎血管、腸系膜動脈)，都存在著內皮依賴性血管舒張功能的下降。內皮功能紊亂是由多因素共同產生的[11]，其中氧化應激(Oxidative Stress，OS)是最關鍵的因素。OS是一種氧化水平與抗氧化水平的失衡狀態(tài)，不同程度氧化應激水平使活性氧簇(reactive oxidative species，ROS)對機體產生不同的效應。適宜的ROS水平，使機體適應性的上調酶和非酶抗氧化物的含量，使ROS發(fā)揮正常的生理功能，對機體產生正向作用。如果ROS大量蓄積而引起氧化損傷，可能會導致大分子，如DNA、脂質、蛋白質的改變和破壞，甚至危及到細胞死亡和組織損傷[5,9]。因此，有研究將抗氧化物應用于內皮功能紊亂和相關的心血管疾病的治療中。研究發(fā)現，對伴有內皮功能紊亂的冠狀動脈疾病，可通過注射維生素-C調節(jié)氧化應激水平，提高NO生物利用度，達到治療的效果[14]。有學者提出，對高血壓大鼠模型注射SOD1，研究結果表明，實驗組大鼠血壓顯著下降[23]?？寡趸锏闹委熤饕ㄟ^減少ROS的生成，降低OS水平，從而達到降壓效果。然而，ROS并不是單純對機體產生不利影響，它是機體正常代謝的產物，運動、衰老、炎癥都伴隨ROS的產生。

《中國高血壓基層管理指南》(下文簡稱《指南》)明確表明，改善長期生活方式是治療高血壓的基石，運動是改善生活方式的重要一環(huán)。《指南》推薦高血壓患者選擇中等運動方式，進行每周5～7次，每次持續(xù)30 min的運動，這是對運動作為預防和治療高血壓疾病的認可[2]。研究表明，定期有氧運動是一種有效的干預策略，可以改善疾病狀態(tài)下內皮依賴性血管舒張能力，如慢性心臟衰竭和高血壓[28]。長期的運動鍛煉可以使機體產生適應性的變化，從而提高心血管的功能。然而，在選擇運動作為治療手段時，運動處方往往會選擇中低強度的有氧運動，對于不同強度運動，尤其是中等強度和高強度運動對高血壓疾病的內皮功能和超微結構影響如何，以及不同運動強度下氧化應激水平會如何調控內皮功能，目前國內外研究尚少。本研究以不同運動強度下氧化應激水平對內皮的功能性影響為立足點，探究高血壓運動治療方法的有效運動負荷。

本實驗擬用自發(fā)性高血壓大鼠(spontaneously hypertensive rat，SHR)和正常血壓大鼠(Wistar Kyoto，WKY)隨機分為安靜對照組和運動組。運動組以中等強度和高強度進行跑臺運動，觀察不同運動強度下的系統血壓、內皮細胞超微結構和功能的變化，探討氧化應激在其中的作用機制，為運動療法的量——效關系以及運動處方的制定提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與實驗方案

本實驗選用3月齡雄性高血壓大鼠(SHR，n=24)和同齡的正常血壓大鼠(WKY，n=24)，體重約250 g，由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供。將SHR、WKY隨機分成安靜組(SHR-C，n=8；WKY-C，n=8)和運動組。運動組根據不同運動強度分成高血壓中等強度運動組(SHR-M，n=8)、普通血壓中等強度運動組(WKY-M，n=8)、高血壓高強度運動組(SHR-H，n=8)和正常血壓高強度運動組(WKY-H，n=8)。全部動物由北京體育大學動物房飼養(yǎng)，保持室溫約22℃，濕度保持40%～45%，國家標準嚙齒類動物分籠飼養(yǎng)，自由飲水。

1.2 尾動脈血壓的測量

訓練前和8周訓練后采用尾動脈無創(chuàng)血壓測試儀(BP-2010A，軟隆科技有限公司，日本)測量各組大鼠的收縮壓(SBP)、舒張壓(DBP)。

1.3 血清氧化應激指標的檢測

大鼠腹腔注射戊巴比妥鈉(50 mg/kg)，麻醉開腹后用粗紗布去除腹部筋膜和其他組織，找到下腔靜脈進行采血，取血后在離心機上以3 500 r/min離心15 min，取上層血清并儲存于-80℃，直到下次進行血清指標的分析時取出。

1.4 透射電鏡檢測

麻醉開腹后迅速取下腸系膜動脈(mesenteric artery，MA)，剝離周圍組織，防止組織自溶現象，在最短時間內投入4℃2.5%戊二醛固定液，并在固定液中過夜。次日用0.1 mol/L的磷酸鹽緩沖液沖洗3次，每次至少15 min；沖洗完畢進行脫水步驟，應梯度進行：70% 丙酮15 min→80% 丙酮15 min→90%丙酮15 min→100% 丙酮20 min(10 min×2)；組織進行浸透和包埋，形成包埋塊室溫儲存；超薄切片染色后JEOL JEM-1230(日本)透射電鏡進行觀察并攝片。

1.5 微血管張力測定

麻醉開腹后迅速取出腸系膜動脈組織，置于4℃ Na-Hepes緩沖液的平皿中。選取一小段含MA零級及其含有三級分支的血管，固定于含有4℃ Na-Hepes緩沖液的膠皿。在體視顯微鏡下輕輕剪去MA上的脂肪組織，暴露出腸系膜動、靜脈，辨別出靜脈，去除靜脈后剪取4段約1.5 mm長的三級MA備用。為保證血管活性，全程杜絕牽扯。將一根2 cm左右長的鎢絲穿進備好的三級MA管腔中，并固定在內含5 mL Na-Hepes(pH=7.4，T=37℃)離體微血管環(huán)張力測定儀上，在儀器上操作將另一根鎢絲穿入管腔。浴槽持續(xù)通95% O2-5% CO2的混合氣，保持浴槽溫度37℃。調節(jié)微調標尺，稍稍將血管擴張，張力調零平衡20 min，此后張力穩(wěn)定保持在0 mN之后緩慢持續(xù)增加血管張力，當血管基礎張力穩(wěn)定維持在1 mN左右停止。平衡后，動脈血管環(huán)浴槽中加藥觀察血管收縮、舒張功能。固定離體血管環(huán)后，每輪加藥后用5 mL Na-Hepes三次洗脫，等到血管環(huán)張力穩(wěn)定在1 mN左右進行下一輪加藥。

Na-Hepes緩沖液成分(mmol/L)：121.1 NaCl、10 Hepes、15.16 KCl、2.4 MgSO4、11.08 Glucose，1.6 CaCl2。

1.6 數據分析

2 結果

2.1 不同強度運動對大鼠血壓的影響

訓練前和8周正式訓練末對各組大鼠進行無創(chuàng)血壓測定，結果表明：訓練末WKY-M和WKY-H與正常血壓安靜組相比，收縮壓(SBP)均顯著下降(P<0.05)；然而，SHR-M SBP水平顯著低于SHR-C(P<0.05)，而SHR-H組不僅顯著高于SHR-C，亦顯著高于SHR-M(P<0.05)。正常血壓運動組與正常血壓安靜組舒張壓(DBP)無顯著性差異(P<0.05)，但SHR-M、SHR-H與SHR-C存在顯著性差異(P<0.05)，具體表現為SHR-M DBP顯著低于SHR-C；SHR-H則顯著高于SHR-M和SHR-C(P<0.05)。此外，訓練末SHR-M和SHR-H SBP和DBP均與各自訓練前結果存在顯著性差異(P<0.05，表1)。

表 1 不同強度運動對大鼠血壓的影響Table 1 The Effects of Exercise with Different Intensity on Rats’Blood Pressure (mmHg)

注：Initial指訓練前，Final指8周正式訓練末；SBP為收縮壓；DBP為舒張壓。*表示P<0.05，與WKY-C進行比較；#表示P<0.05，與SHR-C比較；+表示P<0.05，與SHR-M比較；$表示P<0.05，與Initial比較。

2.2 不同強度運動對氧化應激水平的影響

2.2.1 丙二醛(MDA)

SHR-C組(10.9±1.2 nmol/mL)血清MDA含量與WKY-C(8.5±0.6 nmol/mL)比較，均值有升高趨勢，但是不具有統計學差異(P>0.05)。SHR-H(21.0±3.1 nmol/mL)MDA含量顯著高于SHR-C組(P<0.05)，亦顯著高于SHR-M組(10.7±2.0 nmol/mL，P<0.05)，而SHR-M組與SHR-C組比較并不存在顯著性差異(P>0.05，圖1A)。

2.2.2 谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)

GSH-Px是機體重要的過氧化物分解酶，它特異的催化還原性谷胱甘肽對過氧化氫產生還原反應。SHR-C組GSH-Px酶活力顯著低于WKY-C(SHR-C：1 348.1±42.5 U；WKY-C：1 562.6±68.9 U，P<0.05)。不同強度的高血壓運動組與高血壓安靜組相比均表現出抗氧化物酶GSH-Px顯著增加(P<0.05)，但SHR-M與SHR-H兩組間不具有顯著性差異(SHR-M：1 639.2±119.5 U：SHR-H：1 685.1±35.00 U，P>0.05，圖1B)。

圖 1 血清氧化應激指標柱狀圖Figure1. Indicators of OxidativeStress in Serum

注：MDA：丙二醛；GSH-Px：谷胱甘肽過氧化物酶；SOD：過氧化物歧化酶；Cu/Zn-SOD為SOD的分型。 *P<0.05，與WKY-C進行比較；#P<0.05，與SHR-C比較；+P<0.05，與SHR-M比較。

2.2.3 過氧化物歧化酶(SOD)

血清總SOD(T-SOD)測定顯示，WKY-M組(232.9±3.6 U/mL)顯著高于WKY-C組(217.7±0.6 U/mL，P<0.05)，WKY-H與WKY-C、WKY-M相比均無統計學差異。此外，高血壓不同強度運動組與高血壓安靜組均沒有統計學差異(圖1C)。

Cu/Zn-SOD是SOD的分型，與內皮依賴性超極化因子發(fā)生有關。8周運動后，正常血壓運動組無論中強度還是高強度運動，Cu/Zn-SOD均顯著高于WKY-C組(WKY-C：163.9±4.0 U/mL；WKY-M：226.5±6.3 U/mL；WKY-H：211.8±19.7 U/mL，P<0.05)。SHR-C組Cu/Zn-SOD(213.0±1.6 U/mL)顯著高于WKY-C(P<0.05)，SHR-M、SHR-H與SHR-C相比均無顯著性差異，SHR-M與SHR-H之間亦不具有統計學差異(圖1D)。

2.3 內皮細胞的超微結構

透射電鏡實驗結果顯示，WKY組MA內皮細胞呈扁平狀，表面可見微絨毛，內膜連續(xù)性完好、內彈力膜平直與內皮細胞伴行，平滑肌排列較整齊；SHR組腸系膜動脈內皮細胞失去正常形態(tài)，核大而畸形，內皮細胞呈指狀突向內腔，表面微絨毛結構消失，細胞器脫落形成空泡，內彈性模不規(guī)則，大量膠原纖維增生至內膜層。中等強度運動逆轉高血壓內皮細胞形態(tài)，內皮細胞較完整；高血壓高強度運動組內皮細胞核大，不規(guī)則，出現空泡狀結構，大量膠原纖維增生(圖2)。

圖 2 大鼠腸系膜動脈內皮細胞超微結構圖Figure2. Ultrastructure of Endothlial Cells of Mesenteric Artery of Rats 注：EC：內皮細胞； IEL：內彈性膜；COL：膠原纖維。

2.4 不同強度運動對腸系膜動脈內皮功能的影響

2.4.1 去甲腎上腺素(NE)誘發(fā)的血管收縮反應

為排除微血管個體差異，先以KCL(60 mmol/L)誘導三級腸系膜動脈離體微血管環(huán)收縮，以產生的最大收縮張力作為100%Kmax。反應達平臺加入5 mL Na-Hepes進行3次洗脫，保持血管環(huán)張力值穩(wěn)定1 mN約10 min。后續(xù)實驗中，加入去甲腎上腺素(norepinephrine，NE，10-5mol/L)誘發(fā)MA收縮，均將其張力標準化為Kmax百分比(%KMAX)，以%KMAX作為評價血管收縮反應性的指標。各組對KCL反應的血管張力分別是(mN)：WKY-C(5.98±0.90)；WKY-M(6.39±0.14)；WKY-H(5.96±0.29)；SHR-C(6.00±0.22)；SHR-M(5.98±0.18)；SHR-H(6.00±0.27)，組間無顯著性差異(P>0.05)。

NE(10-5M)誘發(fā)收縮在SHR-C組為190.6%Kmax±9.1%Kmax，與WKY-C(175.5%Kmax±8.3%Kmax)相比無顯著差異(P>0.05)。進行運動干預后，給WKY施與不同強度運動與正常血壓安靜組(WKY-C)相比均具有顯著性差異(P<0.05)，WKY-H亦與WKY-M存在顯著性差異(WKY-M：154.1%Kmax±2.3%Kmax；WKY-H：198.2%Kmax±9.1%Kmax，P<0.05)。然而，SHR-M(155.8%Kmax±5.1%Kmax)與SHR-C的血管收縮反應性相比顯著降低 (P<0.05)； SHR-H(200.2%Kmax±10.8%Kmax)血管收縮反應性與SHR-C沒有顯著性差異，但顯著高于SHR-M(P<0.05,圖3)。

2.4.2 不同強度運動對內皮舒張功能的影響

為評價血管內皮依賴性血管舒張水平，常用遞增濃度的乙酰膽堿(ACh)進行實驗[10]。為比較不同強度運動對內皮舒張功能的影響，本實驗進行了如下步驟：1)加入KCL(60 mmol/L)待血管張力達到平臺時，Na-Hepes 3次洗脫；2)加入NE(10-5mol/L)，待血管張力達到平臺時，在浴槽依次加入半對數遞增濃度的ACh(10-9-10-5mol/L)。如圖4所示，在10-5mol/L NE刺激下，浴槽中依次加入ACh誘發(fā)MA血管環(huán)舒張，MA舒張百分比隨ACh濃度的升高呈濃度依賴性增加。

圖 3 NE誘發(fā)大鼠腸系膜動脈收縮張力比較Figure 3. Comparison of the Tension Increase Induced by NE in Mesenteric Arteries of Rats

注：*P<0.05，與WKY-C比較；aP<0.05，與WKY-M比較；#P<0.05，與SHR-C比較；+P<0.05，與SHR-M比較。NE為去甲腎上腺素。

圖 4 ACh誘發(fā)的內皮依賴性血管舒張反應曲線圖Figure 4. ACh-induced Endothelium-dependent Vasodilation

注：圖中箭頭表示以半對數遞增濃度方式依次加入乙酰膽堿(ACh：10-9mol/L，3×10-9mol/L，10-8mol/L，3×10-8mol/L，10-7mol/L，3×10-7mol/L，10-6mol/L，3×10-6mol/L，10-5mol/L)。

ACh(10-5mol/L)誘發(fā)的最大血管舒張在SHR-C組為87.2%NE±4.8%NE，顯著小于WKY-C(97.9%NE±1.2%NE，P<0.05)。SHR-M(95.7%NE±1.2%NE)則顯著改善SHR-C內皮依賴性血管舒張功能(P<0.05)。然而，SHR-H(66.0%NE±3.0%NE)顯著低于SHR-C和SHR-M內皮依賴性血管舒張能力(P<0.05，圖5A)。

利用GraphPad Prism 5.0劑量濃度——反應的非線性回歸曲線計算得出EC50。pIC50 是EC50的負對數，pIC50值表示對藥物的敏感性，值越高表示對藥物的敏感性越高。各組由ACh誘發(fā)的內皮依賴性血管pIC50分別為：WKY-C(7.65±0.06)；WKY-M(7.58±0.03)；WKY-H(7.99±0.01)；SHR-C(7.10±0.15)；SHR-M(7.65±0.05)；SHR-H(6.47±0.07)。WKY-H pIC50顯著高于WKY-C和WKY-M(P<0.05)。SHR-C組pIC50顯著低于WKY-C組(P<0.05)。SHR-M組顯著高于SHR-C組pIC50(P<0.05)，而SHR-H組則顯著低于SHR-C(P<0.05)。不同運動強度間比較，WKY-H組 pIC50顯著高于WKY-M(P<0.05)，SHR-H組 pIC50顯著低于SHR-M(P<0.05，圖5B)。

圖 5 ACh誘發(fā)內皮依賴性血管舒張的劑量-反應曲線Figure 5. Dose-Response Curve of ACh-induced Endothelium-dependent Vasodilation

注：圖A為ACh誘發(fā)內皮依賴性血管舒張的劑量反應曲線，縱坐標將NE誘發(fā)MA收縮張力峰值作為100%。圖B為ACh劑量反應的pIC50比較。pIC50，ACh誘導血管舒張達50%的藥物濃度負對數，反映血管對藥物的敏感性。*P<0.05，與WKY-C進行比較；#P<0.05，與SHR-C比較；aP<0.05，與WKY-M比較；+P<0.05，與SHR-M比較。

硝普鈉(SNP)作用于平滑肌細胞使血管舒張，舒張百分比隨SNP的升高濃度呈依賴性增加。本研究結果，6組均可以完全舒張，無統計學差異，排除了各組間由于平滑肌作用帶來的舒張差異(圖6)。

2.4.3 氧化應激對內皮依賴性血管舒張的作用

為檢測氧化應激對各組血管舒張功能的貢獻程度，我們進行了如下實驗：1)加入KCL(60 mmol/L)待血管張力達到平臺時，Na-Hepes3次洗脫；2)加入NE(10-5mol/L)，待血管張力達到平臺時，在浴槽依次加入半對數遞增濃度的ACh；3)加入NAD(P)H氧化酶抑制劑Apocynin(3×10-4mol/L)孵育15 min，加入NE(10-5mol/L)，待血管張力達到平臺時，依次加入遞增濃度ACh。觀察ACh最大濃度下血管舒張百分比，比較加藥前、后舒張百分比是否存在統計學差異。

Apocynin預孵育15 min后，在NE的刺激下，離體微血管環(huán)表現出的舒張程度隨ACh濃度的升高呈依賴性的增加。每組對加入Apocynin前后，ACh誘發(fā)血管最大舒張百分比進行前后對照，只有SHR-H加抑制劑Apocynin前與加藥后具有顯著性差異(P<0.05，表2)。

圖 6 SNP誘發(fā)非內皮依賴性血管舒張的劑量-反應曲線圖Figure 6. Dose-Response Curve of SNP-induced Endothelium-independent Vasodilation

注：SNP誘發(fā)非內皮依賴性血管舒張的劑量反應曲線，縱坐標將NE誘發(fā)MA收縮張力峰值作為100%。

3 討論

本研究以SHR和WKY為對象，觀察了不同強度運動對其腸系膜動脈內皮結構及功能的影響，并探討了氧化應激在其中的可能作用機制。

有研究對不同月齡SHR長期施加低強度游泳運動訓練，結果顯示：長期低強度游泳運動使青年鼠和成年鼠都會產生降低動脈血壓的效果[34]。有學者提出，長期中等強度有氧運動可以使高血壓患者SBP降低約6～10 mmHg，而DBP降低約4～8 mmHg[15]。然而，高強度對自發(fā)性高血壓的降壓效果如何并沒有明確結論。本實驗對高血壓大鼠施加中等強度和高強度運動，與正常血壓組進行對照，闡述運動強度與系統血壓之間的量——效關系。本實驗結果顯示，高血壓組中等強度運動訓練后SBP和DBP顯著低于高血壓安靜組血壓水平，而高強度運動組顯著高于高血壓安靜組所測血壓值。因此，高血壓組施加不同運動強度會產生相反的效果，即高血壓大鼠進行長期中等強度運動可以有效降低SBP和DBP；高血壓大鼠進行長期高強度運動明顯提高高血壓大鼠SBP和DBP。對比訓練前和后的血壓值，高血壓安靜組顯示安靜血壓隨增齡顯著上升，這與前人研究結果一致[13]。有研究表明，中等強度運動對高血壓大鼠內皮功能[19]和抗氧化功能[4]產生積極影響，有利于對血壓的調控。高強度運動對高血壓大鼠血壓產生不利影響可能與內皮功能紊亂、血管張力調控功能下降有關，進而影響血壓。有研究表明，高強度運動會導致高血壓大鼠eNOS磷酸化水平降低，增加eNOS依賴活性氧的增加，影響內皮功能[6]。氧化應激可以誘導血管進行重構，改變正常的生理過程，產生內皮功能紊亂，影響血管收縮、舒張功能。所以，本文以氧化應激角度，研究不同強度運動對高血壓內皮功能影響的分子機制。

表 2 Apocynin對ACh誘發(fā)內皮依賴性最大舒張的影響Table 2 Effect ofApocyninon the Maximum Percentage of Endothelium-dependent VasodilationInduced by ACh

注：由NE收縮離體微血管環(huán)達到張力峰值作為100%最大反應，ACh舒張離體微血管環(huán)，以最大Relaxation(%NE)表示內皮依賴性血管舒張水平。Control組是正常ACh誘發(fā)微動脈最大舒張，Apocynin組是在血管收縮前加入NAD(P)H氧化酶抑制劑，由ACh誘發(fā)微動脈最大舒張百分比。$ P<0.05，與各自空白對照組進行比較。

氧化應激是高血壓等心血管疾病共同的病理生理過程，它在高血壓防治中已被作為治療靶點[18,29]。研究發(fā)現，對老年大鼠進行36周的運動訓練并沒有改變心臟脂質過氧化物的生物標記物，即反映機體MDA含量的TBARS水平并沒有發(fā)生改變，是因為運動使大鼠體內發(fā)生適應性變化，誘導減少由于單個運動周期所產生的暫時性的氧化應激狀態(tài)[33]。運動由于增加了10～20倍的氧消耗，使通過線粒體產生的ROS大量增加[30]。在運動中ROS的產生作為信號物質，可以使細胞在運動下適應地產生相關的抗氧化物酶的增加[17]。研究不同運動強度下氧化應激指標的變化，是誘導內皮功能改變、影響血壓變化的重要機制之一。氧化應激水平由氧化產物與抗氧化物酶之間的平衡關系所評價，最常見的指標是MDA(氧化產物的代表)，GSH-Px和SOD(抗氧化物酶的代表)[25]。本實驗結果顯示，SHR-C的MDA含量與WKY-C相比有增加趨勢，但不具有顯著性差異，這可能與樣本量少有關。SHR-H的氧化應激產物MDA和抗氧化酶指標GSH-Px都表現出增加，但是，前者增加了約1倍，后者增加了約0.3倍，反映出氧化和抗氧化的平衡重心向氧化一邊傾斜；SHR-M與SHR-C相比，SHR-M的MDA含量雖然不變，但是抗氧化物酶GSH-Px顯著增加，表現抗氧化能力的增加。有研究表明，一次力竭運動后會使ROS產物增加，運動后抗氧化物酶含量增加是運動中產生氧化應激機制的反饋。本實驗中，不同強度運動的高血壓大鼠均表現出抗氧化物酶GSH-Px顯著增加，這可能是對運動過程對產生的大量氧化產物所表現的適應性。GSH-Px酶活力在運動后產生的變化眾說紛紜。有學者報道與本實驗GSH-Px結果相似，運動會使GSH-Px活力上升[30,20-21]。然而，也有研究表明運動使高血壓GSH-Px活力下降[22,31]。當然，還有部分研究支持在運動后GSH-Px活力并沒有發(fā)生變化[8,12,16]。Kamal等對大鼠給予3種不同的運動方式，即耐力運動、阻力運動、耐力加阻力運動，分別對其氧化應激水平以及抗氧化物酶進行比較。研究結果顯示，3組不同的運動方式均使氧化應激水平下降(MDA含量的下降和SOD酶活力的增加)，但是，一些抗氧化物酶(CAT、GSH-Px)活力變化趨勢是不同[24]。所以，抗氧化物酶活力變化趨勢不同，可能與實驗對象的選擇、運動方式、運動強度和運動時間有關，這還需進一步的研究。

長時間的適宜強度運動可刺激氧化產物和抗氧化物酶的生成、減少許多慢性疾病的風險，但是，過多的ROS可以攻擊細胞的成分，內皮亦是其攻擊靶點，可以改變內皮細胞結構和功能[7]。有研究報道，SHR血管內皮細胞變形，細胞核增大，細胞膜向管腔呈指狀突起[10]，這與我們的結果一致。本研究還發(fā)現，中等強度運動有益于高血壓大鼠內皮細胞的完整，而高強度運動則加重了內皮細胞的畸形和凋亡。內皮細胞超微結構伴隨高血壓疾病發(fā)生改變，結構的改變必然會影響其正常生理功能，影響內皮發(fā)揮血管舒張的能力。本研究中的內皮依賴性血管舒張功能實驗，也為此提供了有利證據。

有研究表明，通過外源性抗氧化物治療可以調節(jié)氧化應激水平，改善內皮功能紊亂?？寡趸锏闹委熤饕ㄟ^降低活性氧簇的生成、降低氧化應激水平、改善內皮功能，進而達到降壓效果[14]。所以，內皮功能的正常發(fā)揮與氧化應激水平密切相關。有學者提出，適當的活性氧簇水平會產生正向作用，機體可以產生一些適應性變化，即機體本身的負反饋產生更多的抗氧化物酶；然而，在活性氧簇水平很高的情況下，對機體DNA、細胞、組織產生攻擊，并且誘導血管進行重構，改變正常的生理過程，產生內皮功能紊亂、血管張力調控能力下降，影響血管收縮、舒張功能[1]。本實驗中，觀察了高應力狀態(tài)下外周阻力血管——MA收縮反應性和舒張功能的變化，以及不同運動強度調控內皮功能的氧化應激機制。本研究結果表明，SHR-H血清MDA含量顯著高于SHR-C組，高強度運動使高血壓大鼠產生大量活性氧簇，發(fā)生大量的脂質過氧化物損傷，證實了高血壓大鼠進行高強度運動內皮功能紊亂是由于過氧化物的產生，而抗氧化物酶不足以清除大量氧化代謝產物，氧化應激水平嚴重。從離體血管功能性檢測中發(fā)現，通過向離體血管環(huán)浴槽中加入NAD(P)H抑制劑Apocynin，比較各組加藥前后ACh誘發(fā)最大內皮依賴性血管舒張，評價各組氧化應激在調控內皮功能中的貢獻程度。實驗結果表明：加入Apocynin后，各組ACh誘發(fā)血管舒張均不存在顯著性差異，說明各組ACh誘發(fā)最大內皮依賴性血管舒張存在的差異源自氧化應激的作用，這與Fernanada研究冠狀動脈在NAD(P)H氧化酶抑制劑Apocynin作用下內皮依賴性最大舒張水平相似[32]。其中，SHR-H加入Apocynin前后對應的ACh誘發(fā)血管最大內皮依賴性舒張之間具有顯著性差異，說明了高強度運動造成高血壓組內皮功能紊亂主要與氧化產物大量蓄積有關，即SHR-H內皮功能下降主要是因為氧化應激水平的增加。相反，中等強度運動的高血壓大鼠減少血清氧化應激水平，在內皮舒張功能性的檢測中表現出SHR-M組改善了高血壓誘導的內皮功能紊亂，加入抑制劑Apocynin前后對應的血管最大舒張百分比不具有統計學差異，說明中等強度運動通過降低氧化應激水平影響內皮舒張功能。

4 結論

不同運動強度調控高血壓誘導的內皮功能紊亂，中等強度運動通過下調氧化應激水平達到增加內皮功能的效果，而高強度運動增加氧化應激水平，加劇了高血壓大鼠血管內皮功能障礙。

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Oxidative Stress Mechanisms of Treadmill with Different Intensity on Endothelial Function and Ultrastructure in Spontaneously Hypertensive Rats

YE Fang,BAI Ping,ZENG Fan-xing,SHI Li-jun

Objective:To investigate the effects of treadmill exercise with different intensity on spontaneously hypertensive rats’endothelial function and ultrastructure.Methods:Three-month-old male SHR and WKY were randomly assigned to six groups:sedentary control group (SHR-C,WKY-C),moderate-intensity exercise group (SHR-M,WKY-M),and high-intensity exercise group (SHR-H,SHR-H).The animals in the exercise-trained groups ran on a motor treadmill (0° slope) at 18～20 m/min (～55～65% of the maximal aerobic velocity) and 26～28m/min (～75～85% of the maximal aerobic velocity),respectively.Each exercise-trained group ran 60 min per day,5 days per week for 8 weeks.Blood pressure examined by non-invasive methods,endothelial ultrastructure observed by transmission electron microscope,tension test to isolated vessel ring measured by DMT,protein determined by western blotting and detection for enzyme activity.Result:1)Systolic pressureand diastolic pressure in SHR-M were much lower than in SHR-C,and SHR-H significantly different from SHR-C(P<0.05).2)Oxidative product MDA demonstrated that compared to MDA in WKY-C,SHR-C had the trend to rise,but no significant difference.SHR-H were significantly higher than SHR-M (P<0.05).Antioxidant enzymes including GSH-Px,SOD demonstrated that GSH-Px in SHR-C were lower in comparison with WKY-C,GSH-Px in SHR-H and SHR-M were significantly higher compared to SHR-C (P<0.05);SOD in WKY-M were significantly higher than in WKY-C (P<0.05),SOD in SHR exercise-trained groups had no significant difference compared to SHR-C(P<0.05).3)Transmission electron microscope in SHR-C and SHR-H showed that endothelial cells’ malformation,collagen proliferation.However,SHR-M showed the intact of endothelial cells.4)Endothelial-dependent vasodilator function in SHR-C was strikingly lower in comparison with WKY-C,SHR-M ameliorated endothelium-dependent dilation dysfunction induced by hypertension;However,endothelial-dependent dilation was apparently decreased in SHR-H compared to SHR-C (P<0.05).Conclusion:Moderate-intensity exercise can reduce the SHR blood pressure,ameliorate endothelial function and ultrastructure.Whereas high-intensity exercise has an opposite effect that the increase of oxidative stress and the disorder of endothelium dependent dilation.

exerciseintensity;hypertension;endothelium;oxidativestress

1000-677X(2016)12-0058-09

10.16469/j.css.201612008

2016-09-20；

2016-12-05

中央高?；究蒲袠I(yè)務費專項基金資助(2015ZD008)；國家體育總局科研課題(2015B035)。

葉芳(1991-)，女，安徽人，在讀博士研究生，主要研究方向為運動和心血管生理學,E-mail:15600612858@163.com。

北京體育大學 運動與體質健康教育部重點實驗室，北京 100084 Beijing Sport University,Beijing 100084，China.

G804.7

A