釔-恩諾沙星增敏體系熒光光譜法測(cè)定飼料中恩諾沙星的含量

■李軍德 馬池方 張婷婷 宋吉英*

(1.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)校醫(yī)院，山東青島 266109；2.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)化學(xué)與藥學(xué)院，山東青島 266109）

恩諾沙星又名乙基環(huán)丙沙星、恩氟沙星，屬于氟喹諾酮類(lèi)化學(xué)合成抑菌劑，具有廣譜抗菌性和高效的殺菌作用，對(duì)金黃色葡萄球菌以及大多數(shù)革蘭氏陰性菌均具有較強(qiáng)殺傷作用[1]，又因?yàn)槎髦Z沙星與其他抗菌藥物交叉耐藥性小，因此作為獸用藥經(jīng)常與飼料混用，在畜牧養(yǎng)殖業(yè)中得到廣泛應(yīng)用。但如果恩諾沙星在飼料中長(zhǎng)期添加使用，也會(huì)蓄集到動(dòng)物體內(nèi)造成藥物殘留，食用后會(huì)給人體健康帶來(lái)不利影響，其對(duì)生長(zhǎng)發(fā)育中的兒童影響尤其不利，細(xì)菌耐藥性和過(guò)敏、溢血及腎衰等不良反應(yīng)也會(huì)相繼發(fā)生，此外還有可能誘發(fā)精神病及癲癇患者發(fā)病以及增加胎兒畸形的風(fēng)險(xiǎn)，從而影響人類(lèi)的食品安全和健康安全[2-3]。所以，飼料中恩諾沙星含量的分析檢測(cè)與控制，對(duì)食品安全有著重要的作用。

目前，文獻(xiàn)報(bào)道檢測(cè)飼料中的恩諾沙星含量的方法主要有高效液相色譜法[4]、流動(dòng)注射-化學(xué)發(fā)光法[5]、酶聯(lián)免疫吸附快速測(cè)定法[6]和熒光法[7]。因飼料中的恩諾沙星用量少，常規(guī)方法很難準(zhǔn)確檢測(cè)其含量，本實(shí)驗(yàn)中利用釔離子對(duì)恩諾沙星的增敏作用，將氧化釔配成溶液中加入到飼料中，增強(qiáng)了恩諾沙星的熒光強(qiáng)度，使分析檢測(cè)更加易行。本文采用釔-恩諾沙星增敏分子熒光光譜法檢測(cè)市售仔豬飼料中的恩諾沙星含量，和以往的文獻(xiàn)方法比較，樣品的前處理操作簡(jiǎn)單易行，所需溶劑用量少，操作環(huán)境友好，樣品處理結(jié)束后直接進(jìn)行分析檢測(cè)，方法穩(wěn)定可靠，分析結(jié)果良好。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

儀器：F-2500熒光分光光度計(jì)（Hitachi公司）；PB-10 pH計(jì)（北京賽多利斯科學(xué)儀器北京有限公司）；95-2型電動(dòng)磁力攪拌器（上海司樂(lè)儀器有限公司）；LXJ-802醫(yī)用低速離心機(jī)（金壇市恒豐儀器廠(chǎng)）；CHA-S氣浴恒溫振蕩器（江蘇金怡儀器科技有限公司）；電子分析天平（美特勒-托利多儀器上海有限公司）；RE-52AA型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海亞榮生化儀器廠(chǎng)）；SHB-B88型循環(huán)式多用真空泵（鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司）。

試劑：恩諾沙星標(biāo)準(zhǔn)品、氧化釔、Tris-HCl均由北京索萊寶科技有限公司提供；乙腈、鹽酸、氫氧化鈉等均為優(yōu)級(jí)純；市售仔豬飼料樣品。

0.1 g/l恩諾沙星標(biāo)準(zhǔn)溶液配制：稱(chēng)取0.010 0 g恩諾沙星標(biāo)準(zhǔn)品，用2 ml 0.1 mol/l NaOH溶液溶解后用超純水定容至100 ml棕色容量瓶，作為母液使用。

2 g/l Y3+溶液配制：稱(chēng)取Y2O3(M=225.81)0.254 0 g，用5 ml濃鹽酸溶解，加熱蒸發(fā)至近干，用超純水定容至100 ml，作為母液待用。

0.1 mol/l Tris-HCl溶液配制：稱(chēng)取7.882 5 g Tris-HCl（M=157.64）用超純水溶解，定容至 500 ml，需低濃度溶液用超純水稀釋即可。

1.2 光譜分析參數(shù)和分析測(cè)定方法

EX：277 nm，EM：441 nm，掃描范圍 EX：200～500 nm，EM：300～600 nm，狹縫寬度EX：5 nm，EM：5 nm，掃描速度為300 nm/min，延遲時(shí)間0 s，重復(fù)次數(shù)1次。

取一定濃度的恩諾沙星標(biāo)準(zhǔn)溶液，加入適量的Y3+標(biāo)準(zhǔn)溶液，調(diào)整溶液的pH=6，定容，使溶液體系中Y3+濃度為0.02 g/l，將溶液在氣浴恒溫震蕩器上室溫條件下振搖反應(yīng)30 min，待測(cè)。

1.3 樣品中目標(biāo)物的提取和測(cè)定方法

準(zhǔn)確稱(chēng)取仔豬飼料樣品2.000 0 g于100 ml碘量瓶中，加入20 ml乙腈，用封口膜封口以防止提取過(guò)程中溶劑揮發(fā)，磁力攪拌30 min后以4 000 r/min的速度離心30 min，將離心后得到的上清液轉(zhuǎn)移至圓底燒瓶中，在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上旋蒸至干，然后加入1 ml 0.1 g/l Y3+溶液，調(diào)整混合溶液的pH=6，用 0.1 mol/l Tris-HCl溶液定容至5 ml，在室溫下振搖反應(yīng)30 min，將所得溶液用一次性有機(jī)濾膜過(guò)濾以除去溶液中的固體顆粒，過(guò)濾后的溶液按照1.2節(jié)的分析測(cè)定方法待測(cè)。

2 結(jié)果與討論

2.1 恩諾沙星的激發(fā)波長(zhǎng)和發(fā)射波長(zhǎng)的確定

取1.1節(jié)中的恩諾沙星母液1 ml，調(diào)整溶液的pH=6并定容至10 ml，得0.01 g/l的恩諾沙星標(biāo)準(zhǔn)溶液，在1.2的最佳光譜條件下掃描其激發(fā)光譜和發(fā)射光譜，所得譜圖見(jiàn)圖1和圖2。

圖1 恩諾沙星激發(fā)光譜圖

圖2 恩諾沙星發(fā)射光譜圖

通過(guò)圖1和圖2可知，恩諾沙星的激發(fā)波長(zhǎng)為277 nm，發(fā)射波長(zhǎng)為441 nm。因?yàn)槎髦Z沙星屬于喹諾酮類(lèi)藥物，其分子中本身含有α-酮酸結(jié)構(gòu)和一個(gè)哌嗪基，由此造成恩諾沙星的平面性結(jié)構(gòu)比較穩(wěn)定，因此其具有內(nèi)源熒光，自身可以顯示出熒光強(qiáng)度。

2.2 釔-恩諾沙星體系的熒光光譜

取2個(gè)10 ml容量瓶中，其中一個(gè)加入1 ml 0.1 g/l恩諾沙星標(biāo)準(zhǔn)溶液，另外一個(gè)加入1 ml 0.1 g/l恩諾沙星標(biāo)準(zhǔn)溶液和1 ml 0.1 g/l Y3+溶液，調(diào)整溶液的pH=6并用0.1 mol/l Tris-HCl緩沖溶液定容。將兩份溶液在1.2節(jié)的實(shí)驗(yàn)條件下進(jìn)行譜圖掃描，比較恩諾沙星溶液和釔-恩諾沙星溶液體系的熒光強(qiáng)度的大小，以確定釔離子對(duì)恩諾沙星的熒光增敏效果，得激發(fā)光譜圖3和發(fā)射光譜圖4。

圖3 恩諾沙星激發(fā)光譜圖

圖4 恩諾沙星發(fā)射光譜圖

通過(guò)圖3和圖4可以發(fā)現(xiàn)，在恩諾沙星標(biāo)準(zhǔn)溶液中加入釔離子后，釔-恩諾沙星體系溶液的激發(fā)光譜和發(fā)射光譜的熒光強(qiáng)度均有明顯增強(qiáng)，且二者的激發(fā)和發(fā)射波長(zhǎng)并沒(méi)有發(fā)生改變。因此，Y3+與恩諾沙星形成配合物的熒光強(qiáng)度較恩諾沙星單體明顯增強(qiáng)，可以確定釔離子對(duì)恩諾沙星具有明顯的增敏作用。這主要是因?yàn)槎髦Z沙星分子結(jié)構(gòu)中含有α-酮酸，而Y3+具有一個(gè)充滿(mǎn)的次外電子層，能與恩諾沙星的羰基和羧酸基團(tuán)結(jié)合形成一個(gè)六元環(huán)，且在釔離子存在下，哌嗪基氮原子的質(zhì)子化作用可以使平面剛性結(jié)構(gòu)更加穩(wěn)定，所以加入釔離子對(duì)恩諾沙星有明顯的增敏作用[8]。

2.3 不同因素對(duì)釔-恩諾沙星體系熒光強(qiáng)度的影響

2.3.1 溶液的pH值對(duì)釔-恩諾沙星體系熒光強(qiáng)度的影響

在7個(gè)50 ml的容量瓶中分別加入1 ml 0.001 0 g/l恩諾沙星標(biāo)準(zhǔn)溶液，1 ml 0.2 g/l Y3+溶液，調(diào)整溶液的pH值分別為4、5、6、7、8、9、10，然后將溶液用0.1 mol/l Tris-HCl定容。在1.2的實(shí)驗(yàn)條件下測(cè)量溶液的熒光強(qiáng)度，以pH值為橫坐標(biāo)，溶液的熒光強(qiáng)度為縱坐標(biāo)做曲線(xiàn)，所得曲線(xiàn)如圖5所示。

圖5 pH值對(duì)釔-恩諾沙星體系熒光強(qiáng)度的影響

由圖5可知，在酸性環(huán)境下，釔-恩諾沙星體系的熒光強(qiáng)度逐漸增強(qiáng)，在pH=6時(shí)熒光強(qiáng)度最大，之后隨著溶液pH值的增大，體系熒光強(qiáng)度迅速減弱。這是因?yàn)槎髦Z沙星分子結(jié)構(gòu)中有3-羧基-4-氧喹諾酮環(huán)系，在7位有一個(gè)哌嗪取代基團(tuán)，分子里的N原子和O原子在不同的pH值環(huán)境里的質(zhì)子化的程度將直接影響著體系的電子性質(zhì)以及電子云分布，所以不同的pH值會(huì)對(duì)體系的熒光強(qiáng)度產(chǎn)生很大的影響[8]。同時(shí)恩諾沙星分子結(jié)構(gòu)中還有一個(gè)羧基，當(dāng)pH值較高時(shí)，稀土元素如釔離子可能會(huì)形成稀土氫氧化物而影響其配位平衡，并以沉淀的形式析出，因此實(shí)驗(yàn)中釔-恩諾沙星溶液體系的pH值選擇6。

2.3.2 Y3+濃度對(duì)釔-恩諾沙星體系熒光強(qiáng)度的影響

在7個(gè)50 ml的容量瓶中分別加入1 ml 0.001 g/l恩諾沙星標(biāo)準(zhǔn)溶液，加入不同體積的0.2 g/l Y3+溶液，調(diào)整溶液的pH=6并用0.1 mol/l Tris-HCl定容，使7份溶液中釔離子的濃度分別為0.005、0.010、0.015、0.020、0.025、0.030、0.040 g/l，在1.2節(jié)的實(shí)驗(yàn)條件下測(cè)量溶液的熒光強(qiáng)度，以釔離子的濃度為橫坐標(biāo)，溶液的熒光強(qiáng)度為縱坐標(biāo)做曲線(xiàn)，所得曲線(xiàn)如圖6所示。

圖6 Y3+濃度對(duì)釔-恩諾沙星體系熒光強(qiáng)度的影響

由圖6可知，溶液中Y3+濃度在0.005～0.020 g/l的范圍時(shí)，隨著Y3+濃度的增加，釔-恩諾沙星體系的熒光強(qiáng)度逐漸增強(qiáng)，當(dāng)Y3+濃度為0.020 g/l時(shí)熒光強(qiáng)度最大，之后隨著Y3+濃度的增加，熒光強(qiáng)度逐漸趨于穩(wěn)定。這主要是因?yàn)殡S著Y3+濃度的增加，Y3+和恩諾沙星形成配合物的濃度越來(lái)越高，當(dāng)Y3+濃度達(dá)到一定值時(shí)，Y3+和恩諾沙星絡(luò)合的程度趨于飽和狀態(tài)，其熒光強(qiáng)度也隨之趨于穩(wěn)定。所以實(shí)驗(yàn)中選擇Y3+的濃度為0.02 g/l。

2.3.3 反應(yīng)時(shí)間對(duì)釔-恩諾沙星體系熒光強(qiáng)度的影響

在6個(gè)50 ml容量瓶中加入1 ml 0.001 0 g/l恩諾沙星標(biāo)準(zhǔn)溶液、1 ml 1 g/l Y3+溶液，調(diào)整溶液的pH=6并用Tris-HCl溶液定容，使體系中恩諾沙星標(biāo)的濃度為0.020 mg/l，Y3+的濃度為 0.020 g/l。將容量瓶在室溫條件下振蕩反應(yīng)10、20、30、40、50、60 min，反應(yīng)結(jié)束后在1.2節(jié)的實(shí)驗(yàn)條件下測(cè)量溶液的熒光強(qiáng)度，以反應(yīng)時(shí)間為橫坐標(biāo)，溶液的熒光強(qiáng)度為縱坐標(biāo)做曲線(xiàn)，所得曲線(xiàn)如圖7所示。

圖7 反應(yīng)時(shí)間對(duì)釔-恩諾沙星體系熒光強(qiáng)度的影響

由圖7可知，隨著反應(yīng)時(shí)間的增加，溶液的熒光強(qiáng)度逐漸增強(qiáng)，且熒光強(qiáng)度在30 min時(shí)達(dá)到最大。這主要是因?yàn)閅3+和恩諾沙星絡(luò)合形成配合物需要一定的反應(yīng)時(shí)間，所以隨著時(shí)間的增加，絡(luò)合程度越來(lái)越大，配合物濃度逐漸增加，熒光強(qiáng)度也隨之增大，在一定的時(shí)間后絡(luò)合反應(yīng)達(dá)到平衡，熒光強(qiáng)度達(dá)到最大。再隨著反應(yīng)時(shí)間的增加，有可能是配合物的穩(wěn)定性減弱，熒光強(qiáng)度也有所降低，因此實(shí)驗(yàn)中選擇的反應(yīng)時(shí)間是30 min。

2.3.4 反應(yīng)溫度對(duì)釔-恩諾沙星體系熒光強(qiáng)度的影響

在4個(gè)50 ml的容量瓶中分別加入1 ml 0.001 0 g/l恩諾沙星標(biāo)準(zhǔn)溶液和1 ml 0.2 g/lY3+溶液，調(diào)整溶液的pH=6，溶液用0.1 mol/l Tris-HCl定容，然后將溶液分別放置在20、30、40、50℃不同溫度條件下的氣浴恒溫振蕩器中振蕩反應(yīng)30 min，反應(yīng)結(jié)束后在1.2的條件下測(cè)量溶液的熒光強(qiáng)度，以釔-恩諾沙星溶液體系的反應(yīng)溫度為橫坐標(biāo)，溶液的熒光強(qiáng)度為縱坐標(biāo)做曲線(xiàn)，所得曲線(xiàn)如圖8所示。

圖8 反應(yīng)溫度對(duì)釔-恩諾沙星體系熒光強(qiáng)度的影響

由圖8可知，隨著溫度的升高，溶液體系的熒光強(qiáng)度逐漸減弱，但其減弱程度不明顯。在20℃時(shí)的溫度條件下反應(yīng)，溶液體系的熒光強(qiáng)度最大，為12.17；在溫度為50℃時(shí)的環(huán)境下反應(yīng)，溶液的熒光強(qiáng)度最小，為9.85，因此，溫度的改變對(duì)于熒光強(qiáng)度的影響相對(duì)較小。且從圖8中也可以發(fā)現(xiàn)，在20～30℃的溫度范圍內(nèi)，釔-恩諾沙星體系的熒光強(qiáng)度變化不大。這主要是因?yàn)槎髦Z沙星與釔離子反應(yīng)后，其體系的平面剛性結(jié)構(gòu)更加穩(wěn)定，溫度的改變對(duì)釔-恩諾沙星體系的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)幾乎沒(méi)有影響，溫度改變以后，體系的熒光強(qiáng)度變化不大，因此實(shí)驗(yàn)選擇的反應(yīng)溫度在室溫下進(jìn)行即可。

2.4 正交實(shí)驗(yàn)

為了確定影響釔-恩諾沙星溶液體系熒光強(qiáng)度因素的主次，設(shè)計(jì)正交實(shí)驗(yàn)對(duì)其進(jìn)行驗(yàn)證。正交實(shí)驗(yàn)取四個(gè)主要影響因素（溶液體系的pH值、Y3+的濃度、反應(yīng)時(shí)間、反應(yīng)溫度），每個(gè)因素確定三個(gè)水平，設(shè)計(jì)四因素三水平正交實(shí)驗(yàn)，對(duì)實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行更系統(tǒng)的優(yōu)化分析。對(duì)于四因素三水平的實(shí)驗(yàn)，可選擇L9(34)正交實(shí)驗(yàn)表格，正交試驗(yàn)的因素和水平設(shè)計(jì)見(jiàn)表1，正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。

表1 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

表2 L9(34)正交試驗(yàn)結(jié)果

正交實(shí)驗(yàn)的優(yōu)選方案是指在所做的實(shí)驗(yàn)范圍內(nèi)，各因素較優(yōu)的水平組合。各因素優(yōu)水平的確定與實(shí)驗(yàn)指標(biāo)有關(guān)，本實(shí)驗(yàn)的指標(biāo)為溶液的熒光強(qiáng)度F，熒光強(qiáng)度越大表示該因素的水平越好，即各列K值中最大值對(duì)應(yīng)的水平。i表示任一列水平號(hào)（實(shí)驗(yàn)中i=1，2，3）時(shí)，Ki表示相應(yīng)水平所對(duì)應(yīng)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果之和。R為極差，在任一列上，極差R=max(Ki)-min(Ki)。一般來(lái)說(shuō)，各列的極差是不相等的，這說(shuō)明各因素的水平改變對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響是不相同的，極差越大，就是對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果影響最大的因素，也是最主要的因素。

據(jù)表2可知，根據(jù)各因素的K值，溶液體系應(yīng)選擇的最佳水平為pH=6，Y3+溶液的濃度為0.020 g/l，反應(yīng)時(shí)間30 min，反應(yīng)溫度在室溫條件下即可，該結(jié)論與單因素實(shí)驗(yàn)是一致的。根據(jù) RA＞RC＞RB＞RD可知，pH值為最主要影響因素，反應(yīng)溫度對(duì)結(jié)果的影響最小。

2.5 線(xiàn)性關(guān)系和檢出限

將濃度為0、0.05、0.10、0.15、0.20、0.25 mg/l釔-恩諾沙星標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照1.2的分析測(cè)定方法進(jìn)行分析，以熒光強(qiáng)度（F）對(duì)濃度（c）作線(xiàn)性回歸，線(xiàn)性方程式、線(xiàn)性相關(guān)系數(shù)R2、相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差、檢出限、加標(biāo)回收率等見(jiàn)表3。

表3 精密度試驗(yàn)數(shù)據(jù)

2.6 樣品中目標(biāo)物的提取和分析測(cè)定

準(zhǔn)確稱(chēng)取市售仔豬飼料2.000 0 g于100 ml碘量瓶中，加入20 ml乙腈，用封口膜封口以防止提取過(guò)程中溶劑揮發(fā)，磁力攪拌30 min以將目標(biāo)物充分提取，將攪拌后的混合物放入15 ml離心管中，以4 000 r/min的速度離心30 min，將離心后得到的上清液轉(zhuǎn)移至圓底燒瓶中旋蒸至干。因市售樣品中的恩諾沙星含量較低，為了檢測(cè)到其具體的含量，在圓底燒瓶中加入1 ml 0.1 g/l Y3+溶液，使其和恩諾沙星形成絡(luò)合物以增強(qiáng)熒光強(qiáng)度，調(diào)整混合溶液的pH=6，用0.1 mol/l Tris-HCl溶液定容至5 ml，室溫下震蕩反應(yīng)30 min，所得溶液用一次性有機(jī)濾膜過(guò)濾以除去溶液中的固體顆粒，過(guò)濾后的溶液按照1.2的分析測(cè)定方法待測(cè)。

為了確定市售仔豬飼料樣品中是否含有恩諾沙星，將過(guò)濾后的溶液按照1.2的光譜條件和測(cè)定方法進(jìn)行發(fā)射光譜掃描，將得到的譜圖和恩諾沙星標(biāo)準(zhǔn)溶液的譜圖進(jìn)行對(duì)比，所得對(duì)比譜圖見(jiàn)圖9。

圖9 飼料樣品和標(biāo)準(zhǔn)溶液的熒光光譜圖

由圖9可知，市售仔豬飼料樣品和釔-恩諾沙星標(biāo)準(zhǔn)溶液的熒光光譜，在波長(zhǎng)441 nm處有一個(gè)相同的發(fā)射峰，說(shuō)明此飼料樣品中含有恩諾沙星。將過(guò)濾后的溶液在1.2節(jié)的條件下分析檢測(cè)，根據(jù)線(xiàn)性方程進(jìn)行樣品中恩諾沙星含量的計(jì)算，得此市售仔豬飼料樣品中恩諾沙星的含量是0.295 mg/kg。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)主要研究了釔離子對(duì)恩諾沙星熒光強(qiáng)度的增敏效果，探討了溶液的pH值，釔離子濃度，反應(yīng)時(shí)間和反應(yīng)溫度等因素對(duì)釔-恩諾沙星溶液體系熒光強(qiáng)度的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在激發(fā)波長(zhǎng)和發(fā)射波長(zhǎng)分別為277 nm和441 nm下對(duì)釔-恩諾沙星溶液體系進(jìn)行熒光分析檢測(cè)，溶液的pH值為最主要影響因素，確定了溶液體系的最佳實(shí)驗(yàn)條件為溶液的pH=6，Y3+溶液濃度為0.02 g/l，反應(yīng)時(shí)間為30 min，反應(yīng)溫度室溫即可。在以上條件下，釔離子對(duì)恩諾沙星的熒光強(qiáng)度有非常明顯的增敏效果。該方法在0～0.25 mg/l的濃度范圍內(nèi)線(xiàn)性良好，其線(xiàn)性相關(guān)系數(shù)R2為0.998 9，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD為5.6%(n=11)，方法的檢測(cè)限為1.02 μg/l，平均加標(biāo)回收率為103.1%。用該方法對(duì)市售飼料樣品中的恩諾沙星進(jìn)行分析檢測(cè)，穩(wěn)定可靠，分析結(jié)果良好。