體外法研究不同功能性低聚糖對瘤胃發(fā)酵與微生物蛋白合成的影響

■胡丹丹 郭婷婷 金亞東 徐曉鋒

(寧夏大學(xué)，寧夏銀川 750021)

低聚糖又稱為寡糖，一般是由2～10個(gè)單糖以糖苷鍵聚合而成的直鏈或者支鏈的聚合物的總稱。低聚糖主要分為功能性低聚糖和普通性低聚糖兩大類。普通性低聚糖可以被動(dòng)物體消化吸收，而功能性低聚糖無法被動(dòng)物體消化利用。國內(nèi)外對寡糖的研究和應(yīng)用起始于單胃動(dòng)物，在反芻動(dòng)物的研究報(bào)道中也越來越受到重視。據(jù)Heinrichs等[1]報(bào)道，甘露寡糖能夠使奶牛的胃腸道微生物態(tài)環(huán)境得到優(yōu)化，促使雙歧桿菌、乳酸桿菌等有益菌繁殖，抑制大腸桿菌等有害菌的生長。Sharon等[2]證明寡糖可以與一些毒素等表面結(jié)合，增強(qiáng)機(jī)體的免疫功能，保障奶牛的健康。Zhang X F等[3]通過在綿羊的瘤胃、十二指腸中灌注寡糖，可以增強(qiáng)綿羊的免疫功能，促進(jìn)綿羊?qū)θ占Z中低聚糖的利用。許多專家學(xué)者證明寡糖具有改善腸道菌群，提高免疫力等益生作用，因此可以作為優(yōu)良的飼料添加劑在生產(chǎn)上廣泛應(yīng)用。為了進(jìn)一步的驗(yàn)證低聚糖對瘤胃發(fā)酵的作用，本試驗(yàn)旨在利用體外法研究不同功能性低聚糖對瘤胃發(fā)酵與微生物蛋白合成的影響，為在畜牧養(yǎng)殖飼料中添加不同功能性低聚糖的合理應(yīng)用提供科學(xué)、可靠的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

果寡糖（FOS，純度為90%）、甘露寡糖（MOS，純度為50%）、大豆寡糖（SBOS，純度為55%）。

1.2 試驗(yàn)動(dòng)物及日糧

選取3頭體況良好、體重約600 kg，裝有永久性瘤胃瘺管的中國荷斯坦奶牛作為瘤胃液供體動(dòng)物，TMR飼養(yǎng)，日糧精粗比為30∶70（風(fēng)干基礎(chǔ)），試驗(yàn)正式期14 d，從第15 d開始收集瘤胃液用于體外培養(yǎng)，體外培養(yǎng)發(fā)酵底物由精料和粗料組成，精粗比為30∶70（風(fēng)干基礎(chǔ)）。

1.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與飼養(yǎng)管理

試驗(yàn)選取甘露寡糖、大豆寡糖、果寡糖三種功能性低聚糖研究對象，添加水平分別為0%、0.5%、1.5%、3.0%，利用體外批次培養(yǎng)方法，重復(fù)3次，每個(gè)添加水平3個(gè)平行樣，體外批次培養(yǎng)裝置參照盧德勛等[4]和程茂基[5]的方法進(jìn)行。試驗(yàn)動(dòng)物于每日早7:00和晚19:00等量飼喂，自由飲水，試驗(yàn)期21 d，其中預(yù)飼期為7 d，正式期14 d。

1.4 體外產(chǎn)氣與培養(yǎng)

1.4.1 緩沖液配制

每升緩沖液中含Na2HPO41.43 g、KH2PO41.55 g、NaHCO38.75 g、NH4HCO31.00 g、MgSO4·7H2O 0.15 g、CaCl2·2H2O 3.3 g、MnCl2·4H2O 2.5 g、FeCl2·6H2O 0.2 g、CoCl2·6H2O 0.25 g、Na2S9·H2O 0.37 g。

1.4.2 瘤胃液的采集

于晨飼前0.5 h通過瘤胃瘺管分別采集3頭奶牛的瘤胃內(nèi)容物，采集的內(nèi)容物立即放入保溫瓶中帶回實(shí)驗(yàn)室，等體積混合，在厭氧和保溫（39℃）條件下用攪拌器劇烈震蕩3次以上，每次30 s,保證附著在飼料顆粒上的微生物脫落，然后用四層紗布過濾。

1.4.3 混合培養(yǎng)液的配制

收集的瘤胃液用四層紗布過濾，持續(xù)充入CO2氣體5 min，與緩沖液的配比為1∶2，然后迅速轉(zhuǎn)移至已預(yù)熱好并通有CO2的培養(yǎng)瓶內(nèi)（1 000 ml），接注射器，記錄初始讀數(shù)，然后開始培養(yǎng)。

1.5 測定項(xiàng)目與方法

1.5.1 產(chǎn)氣量的測定

從培養(yǎng)開始后，分別于2、4、6、12、24、48、72 h各時(shí)間點(diǎn)通過玻璃注射器記錄1次產(chǎn)氣量。

1.5.2 產(chǎn)氣動(dòng)力學(xué)指標(biāo)計(jì)算

根據(jù)Φrskov等(1979)[6]的產(chǎn)氣模型公式將各種樣品在2、4、6、12、24、48、72 h各時(shí)間點(diǎn)的產(chǎn)氣量代入，應(yīng)用Neway curve-fitting程序（麥考利土地利用研究所，2004）計(jì)算消化動(dòng)力學(xué)參數(shù)。

GP=a+b(1-e-ct)

式中：GP——產(chǎn)氣量；

a——快速發(fā)酵部分的產(chǎn)氣參數(shù)；

b——慢速發(fā)酵部分的產(chǎn)氣參數(shù)；

c——產(chǎn)氣速率；

t——產(chǎn)氣時(shí)間。

1.5.3 發(fā)酵參數(shù)測定

1.5.3.1 VFA的測定

利用日本島津GC-7A氣相色譜儀以內(nèi)標(biāo)法進(jìn)行測定瘤胃VFA[7]，內(nèi)標(biāo)物為巴豆酸。

1.5.3.2 氨態(tài)氮的測定

利用苯酚-次氯酸鈉比色法測定瘤胃氨態(tài)氮的含量[8]。

1.5.3.3 乳酸測定

利用對羥基聯(lián)苯法對瘤胃乳酸的量進(jìn)行測定。

1.5.3.4 微生物蛋白的測定

利用嘌呤堿基法對瘤胃微生物蛋白進(jìn)行測定[9]。

1.6 數(shù)據(jù)分析

飼料樣品的產(chǎn)氣量、產(chǎn)氣參數(shù)、發(fā)酵參數(shù)運(yùn)用EXCELL 2003和SAS 8.2中析因設(shè)計(jì)的方差分析對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，采用最小顯著法SNK進(jìn)行差異顯著性比較，以P＜0.05作為差異顯著性判斷標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1 不同功能性低聚糖對瘤胃體外產(chǎn)氣參數(shù)的影響

添加不同功能性低聚糖對瘤胃體外產(chǎn)氣參數(shù)的影響見表1，從表1可以看出，隨著低聚糖添加量的增加，各組內(nèi)潛在產(chǎn)氣量極顯著提高（P＜0.01），不同功能性低聚糖添加處理對潛在產(chǎn)氣量影響差異顯著（P＜0.05），在3%的添加水平下呈現(xiàn)出大豆寡糖添加組最高，甘露寡糖添加組次之，而不同功能性低聚糖，在不同添加水平下，對潛在產(chǎn)氣量影響差異不顯著（P＞0.05）。對于體外產(chǎn)氣速率，隨著低聚糖添加量的增加，各組內(nèi)產(chǎn)氣速率差異不顯著（P＞0.05），不同功能性低聚糖添加處理對產(chǎn)氣速率影響差異不顯著（P＞0.05），而不同功能性低聚糖，在不同添加水平下，對產(chǎn)氣速率影響差異不顯著（P＞0.05）。對于快速降解部分，隨著低聚糖濃度的增加，快速降解部分也隨之極顯著地提高（P＜0.01），不同功能性低聚糖添加處理對快速降解部分影響差異不顯著（P＞0.05），而不同功能性低聚糖，在不同添加水平下，對快速降解部分影響差異不顯著（P＞0.05）。對于慢速降解部分，隨著低聚糖濃度的增加，慢速降解部分極顯著提高（P＜0.01），不同功能性低聚糖添加處理對慢速降解部分影響差異顯著（P＜0.05），在3%的添加水平下，呈現(xiàn)出大豆寡糖最高，甘露寡糖添加組次之，而不同功能性低聚糖，在不同添加水平下，對慢速降解部分影響差異不顯著（P＞0.05）。

表1 不同功能性低聚糖對瘤胃體外產(chǎn)氣指數(shù)的影響

2.2 不同功能性低聚糖對瘤胃體外發(fā)酵參數(shù)的影響

添加不同功能性低聚糖對瘤胃發(fā)酵參數(shù)的影響見表2，從表2可看出，三種不同功能性低聚糖，隨著添加量的增加對總揮發(fā)性脂肪酸、乙酸/丙酸值、氨態(tài)氮均有顯著影響(P＜0.05)，對乳酸影響不顯著，但有降低的趨勢(P＞0.05)。對于總揮發(fā)性脂肪酸，隨著低聚糖添加量的增加極顯著提高總揮發(fā)性脂肪酸的量（P＜0.01），不同功能性低聚糖添加處理對其影響差異極顯著（P＜0.01），而不同功能性低聚糖，在不同添加水平下，對總揮發(fā)性脂肪酸影響差異顯著（P＜0.05）。對于乙酸/丙酸值，隨著低聚糖添加量的增加，乙酸/丙酸值顯著增加（P＜0.05），不同功能性低聚糖添加處理對其影響差異不顯著（P＞0.05），而不同功能性低聚糖，在不同添加水平下，對乙酸/丙酸值影響差異不顯著（P＞0.05）。對于氨態(tài)氮，隨著低聚糖添加量的增加，各添加組組內(nèi)氨態(tài)氮極顯著降低（P＜0.01），不同功能性低聚糖添加處理對其影響差異極顯著（P＜0.01），呈現(xiàn)出大豆寡糖添加組最低，果寡糖次之，而不同功能性低聚糖，在不同添加水平下，對氨態(tài)氮影響差異顯著（P＜0.05）。對于乳酸，添加組組內(nèi)差異不顯著（P＞0.05），但隨著添加量的增加，有降低的趨勢，不同功能性低聚糖添加處理對其影響差異極顯著（P＜0.01），其中甘露寡糖添加組乳酸要低于其余兩組，而不同功能性低聚糖，在不同添加水平下，對乳酸影響差異不顯著（P＞0.05）。

表2 不同功能性低聚糖對體外瘤胃發(fā)酵參數(shù)的影響

2.3 不同功能性低聚糖對體外瘤胃微生物蛋白合成的影響

添加不同功能性低聚糖對體外瘤胃微生物合成的影響見表3，從表3可看出，低聚糖的添加極顯著提高微生物蛋白的合成，不同功能性低聚糖添加處理對其影響差異極顯著（P＜0.01），而不同功能性低聚糖，在不同添加水平下，對微生物蛋白合成影響差異不顯著（P＞0.05）。對于微生物蛋白合成效率，隨著低聚糖濃度的增加，微生物蛋白合成效率顯著提高（P＜0.05），但在果寡糖添加組，添加組組內(nèi)差異不顯著（P＞0.05），不同功能性低聚糖添加處理對其影響差異極顯著（P＜0.01），呈現(xiàn)出甘露寡糖添加組最高，大豆寡糖次之，而不同功能性低聚糖，在不同添加水平下，對微生物蛋白合成效率影響差異不顯著（P＞0.05）。

表3 不同功能性低聚糖對體外瘤胃微生物蛋白合成的影響

3 討論

3.1 不同功能性低聚糖對瘤胃體外產(chǎn)氣量的影響

瘤胃發(fā)酵產(chǎn)生的氣體以CO2和CH4為主，主要途徑以瘤胃內(nèi)微生物發(fā)酵。王新峰等[10]通過在斷奶羔羊日糧中添加低聚果糖、低聚異麥芽糖，研究發(fā)現(xiàn)，異麥芽寡糖和果寡糖能改變斷奶羔羊瘤胃菌群結(jié)構(gòu)，增加瘤胃菌群的數(shù)量，提高產(chǎn)氣量。戈婷婷等[11]通過在日糧中添加不同水平甘露寡糖，發(fā)現(xiàn)隨著添加量的增加，瘤胃產(chǎn)氣量顯著增加。但是對于產(chǎn)氣量，各學(xué)者研究結(jié)果不同，劉光斌等[12]研究表明，在日糧中添加不同水平的大豆寡糖，產(chǎn)氣量變化不明顯。本研究發(fā)現(xiàn)，不同種類與不同添加水平低聚糖均顯著提高瘤胃體外產(chǎn)氣量，尤其在日糧中添加甘露寡糖對體外產(chǎn)氣量影響效果最顯著，說明在日糧中添加功能性低聚糖能夠改善瘤胃微生物發(fā)酵功能。

3.2 不同功能性低聚糖對瘤胃體外發(fā)酵參數(shù)的影響

3.2.1 不同功能性低聚糖對瘤胃揮發(fā)性脂肪酸的影響

揮發(fā)性脂肪酸是碳水化合物在奶牛瘤胃中發(fā)酵產(chǎn)生的主要物質(zhì)，是反映瘤胃發(fā)酵和對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收能力的重要指標(biāo)。據(jù)研究證明，揮發(fā)性脂肪酸的產(chǎn)生，可能是由于在日糧中添加糖類物質(zhì)，直接影響瘤胃微生物的發(fā)酵[13]和誘導(dǎo)瘤胃微生物數(shù)量的失衡而促進(jìn)瘤胃微生物的發(fā)酵[14]，提高揮發(fā)性脂肪酸的量。Shi等[15]通過在斷奶仔豬日糧中添加果寡糖，發(fā)現(xiàn)隨著果寡糖的添加，雙歧桿菌極顯著提高，產(chǎn)生的揮發(fā)性脂肪酸也增加。肖宇[16]研究在混合精料中添加半乳甘露寡糖對奶山羊瘤胃發(fā)酵的影響，發(fā)現(xiàn)半乳甘露寡糖的添加能夠顯著提高揮發(fā)性脂肪酸的含量。黃雅莉等[17]研究在日糧中添加果寡糖，發(fā)現(xiàn)隨著果寡糖的添加，瘤胃揮發(fā)性脂肪酸的量顯著增加。Mwenya B等[18]通過在奶牛日糧中添加低聚糖，發(fā)現(xiàn)隨著低聚糖的添加，瘤胃發(fā)酵產(chǎn)生的總揮發(fā)性脂肪酸也增加。本試驗(yàn)通過體外法研究三種不同低聚糖對奶牛瘤胃發(fā)酵產(chǎn)生的揮發(fā)性脂肪酸的影響，發(fā)現(xiàn)不同低聚糖種類和添加水平對總揮發(fā)性脂肪酸均有顯著影響，影響程度不同，但對乙酸/丙酸的值，在甘露寡糖和大豆寡糖添加組乙酸/丙酸的值均顯著增加，而對于果寡糖添加組，乙酸/丙酸值有降低的趨勢，這和大多數(shù)研究一致，綜合以上三種功能性低聚糖對瘤胃揮發(fā)性脂肪酸的影響，發(fā)現(xiàn)大豆寡糖對奶牛瘤胃發(fā)酵的綜合作用效果最理想。

3.2.2 不同功能性低聚糖對瘤胃氨態(tài)氮的影響

氨態(tài)氮濃度是評(píng)價(jià)瘤胃內(nèi)環(huán)境的重要指標(biāo)，是日糧蛋白與非蛋白氮在瘤胃中降解的產(chǎn)物。對于氨態(tài)氮，大多數(shù)研究者觀點(diǎn)不一。Li G H等[19]通過體外法研究在綿羊日糧中加入不同種類的寡糖，結(jié)果表明，寡糖添加可以顯著降低瘤胃氨態(tài)氮的量。陳志龍等[20]研究在不同精粗比的日糧中添加甘露寡糖，發(fā)現(xiàn)在培養(yǎng)后期導(dǎo)致瘤胃中氨態(tài)氮上升的趨勢，但不呈規(guī)律性變化。凌寶明等[21]研究證明，寡糖的添加，能夠顯著降低瘤胃氨態(tài)氮的量，這與本試驗(yàn)研究結(jié)果相似。本試驗(yàn)通過在日糧中添加三種功能性低聚糖，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，不同低聚糖和不同的添加水平均對瘤胃氨態(tài)氮均有顯著的影響，隨著低聚糖濃度的增加，氨態(tài)氮顯著降低，特別是添加大豆寡糖組對氨態(tài)氮影響最顯著。作為微生物蛋白合成的前體物質(zhì)和瘤胃微生物發(fā)酵的氮源，氨態(tài)氮應(yīng)處于合適的濃度，濃度過高會(huì)增加氮循環(huán)中氮素的損失，Hristov A N等[22]認(rèn)為，氨態(tài)氮濃度過低限制纖維素分解菌分解纖維的能力。對于氨態(tài)氮的最適濃度，各國學(xué)者比較一致的認(rèn)為在10～50 mg/dl范圍內(nèi)[23]，本試驗(yàn)研究的氨態(tài)氮的濃度恰好在此范圍內(nèi)。

3.2.3 不同功能性低聚糖對乳酸的影響

乳酸是反芻動(dòng)物在瘤胃糖代謝中產(chǎn)生中間產(chǎn)物，是反映瘤胃功能好與壞的重要參照指標(biāo)。乳酸在瘤胃中大量的積累，降低瘤胃pH值，導(dǎo)致瘤胃酸中毒現(xiàn)象[24]。現(xiàn)如今即使在大多數(shù)發(fā)達(dá)國家，每年因瘤胃酸中毒就要損失5～10億美元[25]，因此減少瘤胃中乳酸的量，能夠有效防止瘤胃酸中毒現(xiàn)象。本試驗(yàn)通過在日糧中添加三種功能性低聚糖，研究對瘤胃代謝產(chǎn)生的乳酸的影響，結(jié)果證明，隨著低聚糖濃度的增加，乳酸的量無顯著變化，但是有降低的趨勢，因此在日糧中添加功能性低聚糖對乳酸的產(chǎn)生有抑制作用，而不同功能性低聚糖添加處理對乳酸影響差異顯著，其中甘露寡糖對乳酸的降低最有利。

3.3 不同功能性低聚糖對體外瘤胃微生物蛋白合成的影響

反芻動(dòng)物瘤胃中的微生物各種各樣，主要包括細(xì)菌、原蟲和真菌，這些厭氧微生物尤其是細(xì)菌把來自日糧中的蛋白質(zhì)降解為游離氨基酸、小肽和氨，以瘤胃發(fā)酵產(chǎn)生的揮發(fā)性脂肪酸和CO2為碳架合成微生物蛋白[26]，因此微生物蛋白也是反映瘤胃發(fā)酵的重要指標(biāo)。對微生物蛋白，研究者們從體內(nèi)和體外方法來證明添加功能性寡糖對微生物蛋白的影響。潘珂[27]通過在基礎(chǔ)日糧基礎(chǔ)上添加甘露寡糖、果寡糖和大豆寡糖功能性寡糖，發(fā)現(xiàn)隨著寡糖濃度的添加，瘤胃微生物蛋白呈現(xiàn)降低的趨勢。戈婷婷等[28]通過體外法研究不同水平的甘露寡糖對瘤胃微生物的影響，發(fā)現(xiàn)隨著甘露寡糖添加量的增加，微生物蛋白量提高。凌寶明等[29]利用體外法研究在綿羊日糧中添加甘露寡糖和果寡糖對瘤胃微生物蛋白的影響，結(jié)果證明，日糧中添加功能性寡糖能夠顯著提高微生物蛋白的量。本試驗(yàn)通過體外方法研究不同功能性低聚糖對瘤胃微生物蛋白的影響中發(fā)現(xiàn)，低聚糖的種類和添加水平均對瘤胃微生物合成有顯著影響，隨著低聚糖添加量的提高，微生物蛋白的量極顯著增加，不同功能性低聚糖添加處理對其影響差異顯著?？v觀三種不同的功能性低聚糖對體外瘤胃微生物蛋白合成的影響，可以發(fā)現(xiàn)3.0%添加水平下大豆寡糖添加組的綜合作用效果要優(yōu)于其他兩組。

4 結(jié)論

在體外條件下，不同功能性低聚糖對瘤胃發(fā)酵和瘤胃微生物蛋白合成均有影響，通過在日糧中添加功能性低聚糖，可以明顯改善瘤胃發(fā)酵以及促進(jìn)瘤胃微生物蛋白合成，這種改善取決于功能性低聚糖的種類以及其添加水平。對于低聚糖添加組，隨著添加水平的增加，可以使瘤胃產(chǎn)氣量、總揮發(fā)性脂肪酸、乙酸/丙酸值、微生物蛋白均顯著提高，使氨態(tài)氮顯著降低，對于乳酸來說影響不顯著，但是能夠使乳酸呈降低趨勢。不同功能性低聚糖在不同的添加水平下對奶牛瘤胃發(fā)酵和微生物合成均產(chǎn)生影響，在綜合潛在產(chǎn)氣量、快速降解部分、慢速降解部分、總揮性脂肪酸、乙酸/丙酸值、氨態(tài)氮、總嘌呤方面，3.0%大豆寡糖添加組要好于其他添加組，即3.0%的大豆寡糖添加組對奶牛瘤胃發(fā)酵及微生物合成影響最有利。