玉米秸稈纖維素降解菌的篩選及復合菌系的構(gòu)建

■宋云皓 滿都拉 郜晉楠 段開紅 田瑞華

(1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學生命科學學院，內(nèi)蒙古呼和浩特 010018；2.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學食品科學與工程學院，內(nèi)蒙古呼和浩特 010018)

內(nèi)蒙古自治區(qū)是我國玉米種植大省，占全國玉米生產(chǎn)的10%。2015年，內(nèi)蒙古自治區(qū)玉米種植總面積約為5 111萬畝。一般粒用玉米畝產(chǎn)秸稈3～5 t，按此計算，2015年內(nèi)蒙古自治區(qū)玉米秸稈產(chǎn)量約為1.5～2.6億噸[1]。由于地理及氣候特點，內(nèi)蒙古自治區(qū)農(nóng)業(yè)和牧業(yè)生產(chǎn)具有明顯的地域性差異。玉米種植區(qū)主要集中在通遼市、興安盟、赤峰市及烏蘭察布盟等地區(qū)，而牧區(qū)主要集中在呼倫貝爾盟、錫林郭勒盟及阿拉善盟。一方面，由于氣候的變化，天然草地的退化及過度放牧，牧業(yè)區(qū)對飼草料的需求逐年增加。另一方面，可作為飼料的秸稈在農(nóng)業(yè)區(qū)的主要利用方式為生活能源燃料，沒有做到物盡其用。因此，對于內(nèi)蒙古地區(qū)的玉米秸稈的利用方式應以飼用為主。但是，由于玉米秸稈的組成大部分為纖維素類物質(zhì)，其中含約37%的纖維素、17%的半纖維素及28%的木質(zhì)素（占干物質(zhì)重）[2]，導致直接飼用后大部分未被吸收而直接排出，利用率較低[3]。大量研究表明，對秸稈進行預處理能夠疏松其結(jié)構(gòu)，增加采食量，提高秸稈飼用效率[4-5]。

目前，玉米秸稈的處理方式有酸堿化學處理法[6-8]，粉碎物理處理法[9]以及生物處理法[10-14]等。其中，由于生物處理法具有使秸稈纖維素含量下降、提升蛋白含量、操作簡便及環(huán)保等優(yōu)點，在研究秸稈飼用領域受到廣泛關注[15]。生物處理法是利用微生物產(chǎn)生的纖維素降解酶作用于纖維素、半纖維素以及木質(zhì)素，從而達到使玉米秸稈結(jié)構(gòu)疏松的目的。且相關微生物之間復配能顯著提高秸稈降解能力[16-18]，軟化秸稈[19]，提高牛羊的進食率[20]。

基于內(nèi)蒙古自治區(qū)秸稈利用方式及氣候特點，本研究從內(nèi)蒙古自治區(qū)東部（通遼和赤峰）篩選纖維素降解菌，并對其進行復配，構(gòu)建復合菌系，為進一步提高玉米秸稈飼用推廣奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

實驗樣品采自內(nèi)蒙古自治區(qū)赤峰市及通遼市郊區(qū)的腐爛玉米秸稈、牛羊圈土壤。土樣品過20目篩，與秸稈樣品分別裝入無菌袋帶回并保存于4℃冰箱中。

富集培養(yǎng)基：羧甲基纖維素鈉（CMC-Na）5.0 g、秸稈粉 5.0 g、K2HPO41.0 g、MgSO40.5 g、(NH4)2SO42.0 g、NaCl 0.5 g、牛肉膏0.5 g、胰蛋白胨1.0 g、蒸餾水1 000 ml，pH值自然。

篩選培養(yǎng)基：K2HPO41.0 g、MgSO40.5 g、NaCl 0.5 g、(NH4)2SO42.0 g、蒸餾水1 000 ml，取10 ml裝入50 ml試管中，再向試管中加入濾紙條（剪為5×0.7 cm），紙條貼在內(nèi)壁上，一半浸入培養(yǎng)基液面以下。

分離培養(yǎng)基：CMC-Na 5.0 g、K2HPO41.0 g、MgSO40.5 g、(NH4)2SO42.0 g、NaCl 0.5 g、剛果紅0.5 g、瓊脂20 g、蒸餾水1 000 ml，pH值自然。

發(fā)酵培養(yǎng)基：CMC-Na 10.0 g、K2HPO41.0 g、Mg-SO40.5 g、(NH4)2SO42.0 g、NaCl 2.5 g、牛肉膏 2.5 g、胰蛋白胨 5.0 g、蒸餾水 1 000 ml，pH值自然。

1.2 秸稈中兼性厭氧菌的篩選及分離純化

將樣品裝入250 ml三角瓶中，加滿水至瓶口，封口膜封口，30℃靜置培養(yǎng)3 d。吸取10 ml培養(yǎng)液加入富集培養(yǎng)基中（250 ml三角瓶加200 ml），30℃下富集培養(yǎng)3 d。

吸取富集培養(yǎng)物1 ml加入篩選培養(yǎng)基中，30℃培養(yǎng)2周。選擇濾紙崩解程度較高的試管稀釋至10-6、10-7、10-8梯度，將菌液涂布在分離培養(yǎng)基上，再倒一層瓊脂，30℃培養(yǎng)3 d。待雙層平板長出單菌落后，用接種針挑取產(chǎn)生剛果紅透明圈的菌株，接種到分離培養(yǎng)基后30℃培養(yǎng)3 d。在菌落周圍能產(chǎn)生透明圈的證明該菌株具有分解纖維素能力。

1.3 指標的測定

1.3.1 酶活的測定

將篩得菌株接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中30℃培養(yǎng)5 d，將發(fā)酵液在4℃、6 000 r/min、10 min后收集上清液即為粗酶液，利用3，5二硝基水楊酸法（DNS法）測定發(fā)酵液的酶活[21]。

1.3.2 秸稈中粗纖維含量的測定

按照國標（GB/T 6434-2006）中的方法測定秸稈中粗纖維的含量。

1.4 菌種鑒定與構(gòu)建復合菌系

利用平板劃線法分離單菌落后觀察其菌落形態(tài)特征。利用引物27F和1492R擴增所篩微生物16S rDNA，送測序公司測序后，將序列與NCBI數(shù)據(jù)庫進行比對。根據(jù)比對結(jié)果及形態(tài)特征確定所篩菌株的種屬。

將兩種不同的菌株采用兩兩相交劃線的方法接種于拮抗培養(yǎng)基中，得到菌株間拮抗關系后，結(jié)合酶活結(jié)果構(gòu)建復合菌系。

1.5 數(shù)據(jù)分析

每個處理設3次重復，當P＜0.05時，視為處理之間差異顯著。數(shù)據(jù)分析及繪圖利用Office Excel 2015完成。進化樹利用MAGA 6.0完成。

2 結(jié)果與討論

2.1 纖維素分解菌的篩選

通過對樣品富集培養(yǎng)后，分離純化出具有纖維素分解能力菌57株，并根據(jù)酶活初步篩選出14株有CMC酶活的菌株，觀察菌落形態(tài)（如表1所示）。由表1可以看出，無色透明菌落的檢出率較高，形態(tài)特征多樣。菌株8-2的CMC酶活較高，但沒有透明圈產(chǎn)生。菌株9、菌株6-4的CMC酶活很低，但有透明圈產(chǎn)生，可見透明圈大小只能初步反映出菌株的酶活高低。通過酶活大小的比較得出，直接從干玉米樣品中篩菌所得到的菌株CMC酶活均不高，這可能是由于干樣品中缺少水分，不利于菌株的存活。CMC酶活較高的菌株大多為在田地中有腐爛根莖的土樣中所篩得。這與吳文韜[22]和李波[23]等人的結(jié)果類似。由于菌株6-4、菌株9、菌株12、菌株14-5這4株菌較其他菌株酶活較低，因此不對此4株菌進行進一步的研究。

表1 所篩菌株的酶活、透明圈直徑及形態(tài)

2.2 16S rDNA序列分析

通過NCBI在線比對，株菌3-4、14-1、2-4和菌株6-9屬于芽孢桿菌屬（Bacillus），Blast比對相似度均為99%，酶活相對較高，這與張斯童等人的結(jié)果類似[24]。1-3、8-2和6-2屬于腸桿菌屬（Enterobacter），Blast比對相似度為98%、99%和99%。菌株5-2、11-2和菌株10分別屬于非脫羧勒克菌屬（Leclercia adecarboxylata）、泛菌屬（Pantoea）及檸檬酸菌屬（Citrobacter），Blast比對相似度均為99%。各菌株進化關系如圖1所示。

由于真菌和放線菌有較高的纖維素酶活[25]，如魏亞琴等[26]篩選出來的菌株CMC-Na酶活可高達1 181 U。但是，真菌及放線菌的生長較細菌緩慢且副產(chǎn)物多，且對其進行進一步優(yōu)化改造較難。因此本研究針對性的篩選降解纖維素細菌。從系統(tǒng)發(fā)育樹可以看出（圖1），具有較高CMC-Na酶活的菌株大部分為芽孢桿菌屬。有研究表明[27]，芽孢桿菌在作為飼料添加劑時，可以產(chǎn)生較多的生物熱，具有耐酸、耐高溫能力，在進入動物腸道后可以成為營養(yǎng)性細菌、提高飼用率、增強動物免疫力。因此，在下一步構(gòu)建復合菌系時，以芽孢桿菌屬菌株為主，配以其他菌屬細菌，從而達到提高酶活的目的。

2.3 復合菌系的構(gòu)建及秸稈發(fā)酵實驗

將所篩菌株兩兩劃線接種于無剛果紅的分離培養(yǎng)基中，觀察線跡有無萎縮斷開現(xiàn)象（結(jié)果如表2所示）。根據(jù)各菌株之間的拮抗結(jié)果利用無拮抗作用的菌株構(gòu)建復合菌系。

微生物的拮抗作用是指一種微生物在其生命活動中產(chǎn)生某種代謝產(chǎn)物或改變環(huán)境條件，從而對其他微生物產(chǎn)生抑制或毒害作用[28]，而芽孢桿菌本身就有較強的抑菌活力[29]，所以本實驗中與芽孢桿菌出現(xiàn)的拮抗作用的菌株較多。

根據(jù)拮抗實驗結(jié)果，構(gòu)建5組復合菌系A:1-3、5-2、6-2和11-2；B:3-4、6-9、5-2和8-2；C:2-4、5-2、8-2和11-2；D:10、2-4和8-2；E:14-1、3-4和8-2。在李靜等[30]的研究中，通過對Paenibacillus、Bacillus、Acinetobacter來進行復配，得到的結(jié)果為復合菌系比單菌株對秸稈的降解率相比提高了50.71%。由此可見利用構(gòu)建復合菌系的方法可以在提高秸稈降解率的過程中起到十分關鍵的作用。

利用DNS法分別測定5組菌系酶活（見圖2）后發(fā)現(xiàn)，菌系B的酶活最高。大量的研究表明[31-34]，Bacillus是高效的纖維素分解菌，Shrinivas[35]和Kumar等[36]指出，Bacillus可以分泌出降解纖維素的酶，促進纖維素降解。從結(jié)果來看，雖然Enterobacter構(gòu)成的菌系酶活較低，但在由Bacillus和Enterobacter構(gòu)成的菌系中酶活的提升較為明顯。因此，在菌系的構(gòu)成時，酶活較低的Enterobacter也起到了顯著的作用。

圖1 所篩纖維素降解菌的系統(tǒng)發(fā)育樹

表2 所篩纖維素降解菌的拮抗性

圖2 復合菌系的酶活

以1%接種量將復合菌系接入含水率為70%的玉米秸稈后，真空密封，置于30℃發(fā)酵。7 d后測得秸稈中的粗纖維降解率達到了48.6%。

目前內(nèi)蒙古自治區(qū)對玉米秸稈的處理方式主要以就地焚燒為主，這不僅會污染空氣、浪費資源，而且由于在焚燒的過程中會產(chǎn)生高溫破壞土壤內(nèi)的菌群結(jié)構(gòu)，為來年的生產(chǎn)造成困難，所以如何科學地利用玉米秸稈是本研究的核心。本研究針對內(nèi)蒙古自治區(qū)的特點提出了秸稈飼用的觀點并分離與純化玉米秸稈纖維素降解菌、構(gòu)建復合菌系，為進一步開發(fā)內(nèi)蒙古自治區(qū)玉米秸稈飼用資源奠定基礎。

3 結(jié)論

以內(nèi)蒙古東部地區(qū)為研究區(qū)域，分離純化出10株具有較高CMC酶活的纖維素降解菌1-3、2-4、3-4、5-2、6-2、6-9、8-2、10、11-2和14-1。并進一步構(gòu)建了復合菌系A:1-3、5-2、6-2、11-2；B:3-4、6-9、5-2、8-2；C:2-4、5-2、8-2、11-2；D:10、2-4、8-2和E:14-1、3-4、8-2。其中菌系B的CMC酶活較菌株3-4（所篩菌株中酶活最高）提高了105.07%，可見，復合菌系能夠顯著提高酶活力。玉米秸稈發(fā)酵實驗表明，復合菌系B處理過的秸稈粗纖維降解率達到了48.6%。