枯草芽孢桿菌與植物乳桿菌對甘蔗尾青貯品質(zhì)的影響

■穆勝龍 周 波 甘書灝 楊冉冉 武婷婷 宋明杰 鄒彩霞* 何仁春

（1.廣西大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，廣西南寧 530004；2.廣西畜牧研究所，廣西南寧 530002）

糖產(chǎn)業(yè)是廣西省的支柱產(chǎn)業(yè)之一，而甘蔗是制糖最主要的原材料，甘蔗尾為蔗糖產(chǎn)業(yè)的副產(chǎn)業(yè)。在冬季，甘蔗尾是一種很好的青綠飼料，能夠有效地飼喂于反芻動物并被很好利用。然而，在廣西甘蔗砍伐期恰逢冬季，陰雨天氣多，濕度大，不及時保存易腐爛變質(zhì)，造成了飼料資源的嚴重浪費。所以，能否對這種飼料資源進行有效的處理使其營養(yǎng)成分能夠長期保存，這對畜牧業(yè)未來的發(fā)展具有重要的意義。添加乳酸菌青貯是甘蔗尾能夠長期貯存最有效的方式之一，乳酸菌青貯不僅能夠增加飼料菌體蛋白的含量、改善飼料的品質(zhì)、增加動物機體的消化和利用，而且能夠大幅度提高其有氧穩(wěn)定性，從而有效解決冬季反芻動物粗飼料相對缺乏的問題。

任付平（2006）利用枯草芽孢桿菌等對玉米全株進行青貯時發(fā)現(xiàn)，青貯后的玉米秸稈不僅與原料的色澤和結(jié)構(gòu)相似，而且霉變程度也得到了明顯的改善，感官評定為優(yōu)良級。敖曉琳等（2014）用植物乳桿菌青貯飼料稻，結(jié)果表明，在接種植物乳桿菌青貯的樣品中，乳酸的含量明顯增加，V-Score評分為滿分。傅彤（2005）對玉米全株利用植物乳桿菌進行青貯，結(jié)果發(fā)現(xiàn)植物乳桿菌不僅能降低青貯玉米的pH值和乙酸的含量，而且能夠提高乳酸的含量。Daniel等（2015）添加開菲爾乳桿菌（Lactobacillus kefiri）和短乳桿菌（L.brevis）對甘蔗青貯發(fā)酵的研究表明，開菲爾乳桿菌能夠增加甘蔗青貯過程中乙酸和1,2-丙二醇的濃度，并能降低酵母菌的數(shù)量，緩解甘蔗青貯發(fā)酵過程中揮發(fā)性有機化合物的形成，以減少營養(yǎng)物質(zhì)的損失。ávila等（2012）從甘蔗中分離出了一株乳酸菌，對甘蔗青貯有氧穩(wěn)定性效果的研究表明，無論是分離出的乳酸菌菌株還是購買的商業(yè)菌株，與對照組相比，都可以促進產(chǎn)生大量的乙酸和丙酸，并減少酵母菌的數(shù)量，從而達到改善甘蔗青貯的有氧穩(wěn)定性。上述對乳酸菌和枯草芽孢桿菌等添加劑的研究多用于玉米秸稈和稻草等青貯的研究，國內(nèi)用于甘蔗尾的研究還相對較少。因此，本試驗以甘蔗尾為材料，枯草芽孢桿菌和植物乳桿菌為添加菌劑，以探究兩菌不同的比例組合添加青貯對甘蔗尾青貯品質(zhì)的影響。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

青貯原料：甘蔗尾來源于廣西大學(xué)農(nóng)學(xué)院試驗田，對甘蔗尾進行人工切割，長度為1～4 cm左右。

表1 甘蔗尾營養(yǎng)成分(%)

添加劑：枯草芽孢桿菌和植物乳桿菌購自中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心。

培養(yǎng)基：MRS液體培養(yǎng)基（北京陸橋，貨號CM 187）用于植物乳桿菌的活化和菌液培養(yǎng)；MRS固體培養(yǎng)基（MRS液體培養(yǎng)基中添加1.5%瓊脂粉）用于植物乳桿菌涂板計數(shù)；葡萄糖營養(yǎng)瓊脂-2液體培養(yǎng)基（北京陸橋，貨號CM 0100）用于枯草芽孢桿菌的活化和菌液培養(yǎng)；葡萄糖營養(yǎng)瓊脂-2固體培養(yǎng)基（葡萄糖營養(yǎng)瓊脂-2液體培養(yǎng)基中添加1.5%瓊脂粉）用于枯草芽孢桿菌的涂板計數(shù)。

1.2 試驗方法

1.2.1 試驗菌種活化及擴培

安瓿管菌種→活化→3%添加量接入液體培養(yǎng)基，植物乳桿菌培養(yǎng)溫度為37℃，靜態(tài)培養(yǎng)；枯草芽孢桿菌的培養(yǎng)溫度為30℃，并在150 r/min搖床上進行培養(yǎng)。

接種液計數(shù)：用一次性涂板對接種液進行平板計數(shù)。

1.2.2 試驗設(shè)計

對照組（C）：添加40 ml生理鹽水。

試驗組Ⅰ：添加7.5 ml BS+7.5 ml LAP+25 ml的生理鹽水，設(shè)置2個重復(fù)。

試驗組Ⅱ：添加5 ml BS+10 ml LAP+25 ml的生理鹽水，設(shè)置2個重復(fù)。

試驗組Ⅲ：添加10 ml BS+5 ml LAP+25 ml的生理鹽水，設(shè)置2個重復(fù)。

表2 青貯處理甘蔗尾微生物添加劑的菌落單位（CFU/g）

1.2.3 青貯制作

將刈割好的甘蔗尾，每組按計量取菌液稀釋到25 ml生理鹽水中，混勻后均勻噴灑到400 g甘蔗尾上，并裝到聚乙烯薄膜袋中。對照組添加40 ml生理鹽水。用真空壓包機壓緊后，避光室內(nèi)青貯43 d。

1.3 測定項目及方法

1.3.1 常規(guī)項目評定

利用楊勝(1993)的常規(guī)法進行水分、中性洗滌纖維(DNF)、酸性洗滌纖維(ADF)和粗蛋白(CP)含量的測定。

1.3.2 青貯料感官評定

青貯結(jié)束后，稱重，并根據(jù)我國農(nóng)業(yè)部1996年發(fā)布的《青貯飼料質(zhì)量評定標準（試行）》進行色澤、質(zhì)地、氣味以及霉變情況的評定(劉建新，1996)。

1.3.3 pH值及品質(zhì)項目分析

①青貯甘蔗尾開袋以后，每袋取35 g樣品，放入250 ml廣口瓶中，并添加150 ml超純水，置于4℃冰箱中；經(jīng)過24 h后，用2層紗布進行過濾樣液，并分裝濾液，分別用于pH值、氨態(tài)氮、乳酸和揮發(fā)性脂肪酸（VFA）的測定。然后取適量的青貯甘蔗尾進行烘干和粉碎后，用于常規(guī)營養(yǎng)成分的測定。

② pH值采用pH計進行測定，型號為HANNA HI 8424。

③乳酸采用試劑盒進行測定，其廠家為南京建成，貨號為A019-2。

④氨態(tài)氮是使用紫外可見分光光度計采用比色的方法進行測定,其廠家為濟南海能，型號為I9。

⑤VFA測定

取0.5 ml①中所得的濾液，加入0.5 ml 8.2%的偏磷酸溶液，在13 000 r/min下離心10 min，取上清液后，加入己配好的巴豆酸溶液，使用Agilent 7890A型氣相色譜儀分析測定上清液中乙酸、丙酸和丁酸的含量。

⑥干物質(zhì)回收率（DMR）

DMR=（青貯后原料質(zhì)量×青貯后干物質(zhì)率）/裝袋時原料質(zhì)量×原料干物質(zhì)率。

1.3.4 有氧穩(wěn)定性的測定

每組均勻混合后取樣，取約200 g左右樣品置于封口袋中壓實，并用牙簽扎數(shù)個小孔，再套上一個寬松不封口的塑料袋，防止交叉污染和減少水分損失，用溫度計測定溫度變化。處理好的封口袋都放置于背光的房間中，環(huán)境溫度的變化根據(jù)實際情況而確定，樣品溫度的變化每8 h記錄一次，當(dāng)青貯樣品的溫度超過環(huán)境溫度2℃時停止記錄。

1.4 數(shù)據(jù)分析

試驗所得數(shù)據(jù)先用EXCEL軟件處理，再用SPSS 22.0軟件中的ANOVA過程進行單因子方差分析，差異顯著性以P＜0.05為判斷標準，數(shù)據(jù)采用Duncan's法進行多重比較檢驗；數(shù)據(jù)均采用“平均值±標準誤”來表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 枯草芽孢桿菌和植物乳桿菌對青貯甘蔗尾發(fā)酵品質(zhì)的影響

表3 枯草芽孢桿菌和植物乳桿菌對甘蔗尾青貯發(fā)酵品質(zhì)的影響

如表3所示，試驗Ⅲ組和試驗Ⅰ組相比pH值顯著降低(P＜0.05)。試驗Ⅰ、Ⅱ組和Ⅲ組中乳酸含量、氨態(tài)氮含量，以及乙酸和丙酸的含量與對照組相比差異均不顯著（P＞0.05）。在對照組、試驗Ⅰ、Ⅱ組和Ⅲ組之間均未檢測到丁酸。

2.2 枯草芽孢桿菌和植物乳桿菌對青貯營養(yǎng)價值的影響

如表4所示，各組間的DM含量差異不顯著（P＞0.05）。試驗Ⅰ組和Ⅱ組中NDF的含量顯著低于試驗Ⅲ組和對照組(P＜0.05)。試驗Ⅲ組NDF含量與對照組相比差異不顯著(P＞0.05)；同時，ADF含量在各組間的差異也均不顯著（P＞0.05）。試驗Ⅱ組的CP含量與對照組相比顯著提高(P＜0.05)。試驗Ⅰ組、Ⅱ組和Ⅲ組中干物質(zhì)回收率（DMR）與對照組相比差異不顯著（P＞0.05）。從表1與表4中可以看出，在各試驗組中，DM、NDF和ADF的含量與青貯前相比均有所降低；而各試驗組中CP的含量與青貯前相比，只有試驗Ⅱ組中的CP含量有所提高。

表4 枯草芽孢桿菌和植物乳桿菌對甘蔗尾青貯常規(guī)營養(yǎng)成分的影響(%)

2.3 枯草芽孢桿菌和植物乳桿菌對甘蔗尾青貯有氧穩(wěn)定性的影響

表5 枯草芽孢桿菌和植物乳桿菌對甘蔗尾青貯有氧穩(wěn)定性的影響

從表5中可以看出，對照組青貯有氧穩(wěn)定性顯著低于試驗組的有氧穩(wěn)定性。各青貯試驗組之間有氧穩(wěn)定性相比差異并不明顯，而與對照組相比，各試驗組分別高出了80、72 h和72 h，有氧穩(wěn)定性提高了90%以上。

2.4 甘蔗尾青貯的飼料品質(zhì)評定

根據(jù)我國農(nóng)業(yè)部1996年發(fā)布的《青貯飼料質(zhì)量評定標準（試行）》進行色澤、質(zhì)地、氣味以及霉變情況的評定(劉建新，1996)；對本次研究的甘蔗尾青貯進行評分，結(jié)果如表6所示：甘蔗尾經(jīng)43 d青貯發(fā)酵后，對照組的感官評定等級為一般，各試驗組的感官評定等級都為良好，其中試驗Ⅰ組和Ⅱ組的感官評定總分為最高。

表6 甘蔗尾青貯的感官評定

表7是按照實驗室評定的方法(劉建新，1996)對甘蔗尾進行飼料品質(zhì)的評定，該評定方式以化學(xué)分析為主要方式，以測定青貯甘蔗尾的pH值和有機酸(包括乳酸、乙酸、丙酸和丁酸)的總體含量，以及測定各有機酸在總體酸中的百分含量，并以此評定青貯甘蔗尾發(fā)酵的優(yōu)劣，其中，以氨態(tài)氮含量占總氮含量的比值來評價青貯甘蔗尾中蛋白質(zhì)被破壞的程度。從表7中可以看出，青貯甘蔗尾采用實驗室評分評定后，試驗第Ⅱ組的總得分為最高，青貯品質(zhì)評定等級為良好，其它各青貯組的青貯品質(zhì)等級評定均為一般。

表7 甘蔗尾青貯的品質(zhì)評定

3 討論

3.1 枯草芽孢桿菌和植物乳桿菌對甘蔗尾青貯發(fā)酵產(chǎn)物的影響

枯草芽孢桿菌是農(nóng)業(yè)部允許在飼料中添加的一種微生物菌劑?？莶菅挎邨U菌能夠分泌纖維素酶、淀粉酶、堿性蛋白酶、糖化酶等多種酶系，并且通過各種酶之間的相互協(xié)同作用能夠生成一定量的粗蛋白質(zhì)（張洋，2008）。乳酸菌的青貯發(fā)酵可分為異型發(fā)酵乳酸菌和同型發(fā)酵乳酸菌兩種類型，其中，植物乳桿菌為同型乳酸菌發(fā)酵。青貯發(fā)酵的主要作用是通過乳酸菌發(fā)酵產(chǎn)生乳酸、丙酸等揮發(fā)性脂肪酸，迅速降低其pH值，從而能夠有效抑制其它有害微生物的生長，降低丁酸及氨的產(chǎn)生，質(zhì)量較差的發(fā)酵飼料會有高含量的丁酸和氨（Parvin等，2010）。因此，以前的研究通常通過添加乳酸菌發(fā)酵來提高青貯飼料的品質(zhì)。

傳統(tǒng)上一般添加的乳酸菌為同型發(fā)酵菌株，其發(fā)酵時可利用1 mol果糖或葡萄糖可產(chǎn)生2 mol乳酸；同型發(fā)酵的菌株能在厭氧發(fā)酵早期快速抑制其它有害的好氧微生物和不耐酸的厭氧微生物，增加干物質(zhì)回收率，并改善動物的性能，這些菌株可以快速降低pH值抑制梭菌的生長，但不抑制自身附帶乳酸菌的發(fā)酵(Muck，2010)。因此，在本試驗中添加了植物乳桿菌和枯草芽孢桿菌對甘蔗尾青貯，以探究同型發(fā)酵乳酸菌和枯草芽孢桿菌混合青貯，對甘蔗尾青貯品質(zhì)及有氧穩(wěn)定性的影響。本次研究中，對照組與各試驗組pH值均超過4.3。唐振華等（2015、2016）報道，甘蔗尾罐裝青貯40 d的pH值為3.70～3.93，本次甘蔗尾青貯的pH值大于3.93，青貯品質(zhì)不理想，這可能與真空壓縮包裝后，發(fā)酵產(chǎn)氣使真空發(fā)酵袋漏氣有關(guān)。在試驗Ⅲ組中，枯草芽孢桿菌和植物乳桿菌的添加比例為2∶1時，pH值低于對照組，有氧穩(wěn)定性高達160 h，明顯高于對照組。公美玲（2013）的研究表明，隨著青貯發(fā)酵期的延長，pH值的降低以及氧氣的消耗殆盡，腐敗菌和梭菌的數(shù)量會逐漸減少以至消失，同時，氨態(tài)氮的含量會也會逐漸降低，到青貯末期含量基本不再變化。在本試驗中與對照組相比各試驗組氨態(tài)氮的含量差異不顯著，這可能是由于青貯的時間相對較短所致。

3.2 枯草芽孢桿菌和植物乳桿菌對甘蔗尾青貯營養(yǎng)價值的影響

張洋（2008）的研究結(jié)果表明在青貯發(fā)酵稻草的過程中，枯草芽孢桿菌不同的接種量對粗纖維的降解率和蛋白質(zhì)的增加率不同。Keles等（2011）和華金鈴（2006）的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在青貯發(fā)酵中添加同型發(fā)酵乳酸菌，青貯發(fā)酵后能夠降低NDF的含量，同時CP的含量有所增加。張大偉（2007）的研究結(jié)果表明，丙酸能夠抑制霉菌和真菌的生長繁殖，減少二次發(fā)酵的產(chǎn)生，在一定程度上促進乳酸菌的生長，從而調(diào)控青貯過程的進行，并且可以降低蛋白質(zhì)的分解。隨著青貯飼料中乳酸菌的活動，能夠有效抑制有害微生物的生長，并能迅速阻止飼料蛋白等養(yǎng)分的分解，從而提高飼料蛋白質(zhì)等養(yǎng)分的含量（張濤等，2005）。

試驗Ⅰ組和Ⅱ組中，青貯后NDF的含量與對照組相比有所降低，這與楊俊峰（2011）添加乳酸菌對玉米青貯中營養(yǎng)成分影響的結(jié)果相似，青貯后都降低了NDF的含量。張想峰（2009）研究了添加乳酸菌發(fā)酵對新疆小蘆葦中營養(yǎng)成分的影響，發(fā)現(xiàn)植物乳桿菌能夠降低NDF的含量，但差異不顯著，同時發(fā)現(xiàn)不同乳酸菌對小蘆葦NDF的影響差異較大。試驗Ⅰ組、Ⅱ組和Ⅲ組中CP的含量與對照組相比都有所增高，其中試驗Ⅱ組的CP含量顯著高于其它試驗組和對照組，這可能與添加的枯草芽孢桿菌和植物乳桿菌最適添加量有關(guān)。

3.3 枯草芽孢桿菌和植物乳桿菌對甘蔗尾青貯有氧穩(wěn)定性的影響

青貯飼料開窖后，由于與空氣的接觸，飼料中酵母的增殖活動加強，使青貯飼料產(chǎn)熱增加，同時，其它一些有害霉菌的活動也開始增強，導(dǎo)致青貯飼料開始腐敗，使青貯飼料不易保存，因此，青貯飼料開窖后，其抗腐敗能力的大小是評價青貯飼料品質(zhì)的重要因素之一。所以，本試驗將青貯后的甘蔗尾與空氣相接觸，用來探究不同比例組合的添加劑對甘蔗尾青貯有氧穩(wěn)定性的影響。

Nishino等（2005）的研究結(jié)果表明，青貯飼料發(fā)生腐敗的時間越快，青貯飼料樣中酵母菌的數(shù)量也就越多；而乙酸是抑制酵母活動的主要因素，這與Arrio?la等（2011）的研究結(jié)果一致。Wilkinson等(2013)的研究結(jié)果表明，乙酸具有抗真菌的作用，可以有效提高青貯料暴露空氣后的有氧穩(wěn)定性。Danner等(2003)關(guān)于乳酸、乙酸、葡萄糖、甘露糖和1,2－丙二醇對青貯飼料有氧穩(wěn)定性影響的研究結(jié)果也表明，乙酸可以顯著提高青貯料的有氧穩(wěn)定性。試驗中各試驗組與對照組相比，都能明顯提高甘蔗尾青貯的有氧穩(wěn)定性，并與對照組相比普遍高出了72 h。其中，試驗Ⅱ組中乙酸含量比對照組低，而有氧穩(wěn)定性卻比對照組高出了72 h。這與Zhang等（2006）的研究相似，青貯有氧穩(wěn)定性不僅與乙酸的含量有關(guān)，可能還與添加菌株產(chǎn)生除乙酸以外的能抗酵母菌和霉菌等的物質(zhì)有關(guān)。

4 結(jié)論

對甘蔗尾青貯而言，枯草芽孢桿菌和植物乳桿菌的添加比例為1∶2時，即每克新鮮甘蔗尾的菌落單位為枯草芽孢桿菌7.8×106CFU/g、植物乳桿菌1.5×108CFU/g時，能夠降低pH值，提高CP的含量且可改善青貯的有氧穩(wěn)定性。

（參考文獻刊略，需者可函索1366891256@qq.com）