■毛建紅 陶 蓮 許貴善 石長青 刁其玉*
(1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院飼料研究所農(nóng)業(yè)部飼料生物技術(shù)重點實驗室,北京 100081;2.塔里木大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院,新疆阿拉爾 843300)
粗飼料在反芻動物日糧中的適宜比例為40%~70%,它能為反芻動物提供大量的營養(yǎng)物質(zhì),玉米秸稈、小麥秸稈和水稻秸稈等三大秸稈是反芻動物飼養(yǎng)中常用的粗飼料,合理地加工和利用農(nóng)作物秸稈是提高其營養(yǎng)價值的關(guān)鍵所在。我國是農(nóng)業(yè)大國,秸稈資源非常豐富,2015和2016年的秸稈年產(chǎn)量分別達(dá)8.5和7.9億噸[1]。但由于秸稈細(xì)胞壁中,纖維素以高度結(jié)晶且有序的微纖絲形式作為細(xì)胞壁骨架結(jié)構(gòu)的內(nèi)核,半纖維素和木質(zhì)素以共價鍵形式連接并嵌套在細(xì)胞壁骨架結(jié)構(gòu)中,使瘤胃微生物和降解纖維素的酶類不能直接與纖維素接觸,致使纖維素在動物瘤胃中的分解受到限制[2]。目前我國的秸稈用于飼料的比例僅為25%左右,大部分的秸稈都被丟棄、焚燒,不僅浪費資源,還嚴(yán)重污染環(huán)境。
提高秸稈飼料化利用率的方法主要有物理處理法、化學(xué)處理法和生物處理法[3]。物理處理法簡單易行,通過切短、粉碎、浸泡、蒸汽處理、射線照射等改變秸稈的外形特征,便于反芻動物咀嚼,增大秸稈與瘤胃微生物的接觸面積,減少飼料浪費并提高秸稈的消化率,但不能改變植物的化學(xué)組成或提高營養(yǎng)價值?;瘜W(xué)處理法主要是在秸稈中加入一定劑量的化學(xué)試劑,達(dá)到破壞秸稈內(nèi)部結(jié)構(gòu),提高秸稈利用率的目的。常用的化學(xué)處理法有:堿化處理、酸化處理、氨化處理、氧化處理和復(fù)合處理等。雖然化學(xué)處理破壞了秸稈中木質(zhì)素與纖維素、半纖維素的結(jié)合狀態(tài),使細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)變得疏松,提高了反芻動物對秸稈的利用率,但是化學(xué)法生產(chǎn)成本較高,且使用后化學(xué)離子會流失到環(huán)境中,對環(huán)境危害嚴(yán)重[4]。生物處理法主要是針對秸稈木質(zhì)纖維素的復(fù)合結(jié)構(gòu),用細(xì)菌、真菌、酶制劑對秸稈進(jìn)行處理,改善秸稈適口性和利用率的處理方法。經(jīng)生物處理過的秸稈,適口性明顯改善,營養(yǎng)成分顯著增加,在瘤胃中的轉(zhuǎn)化效率也明顯提高[5]。生物法處理秸稈不需要太復(fù)雜的設(shè)備和過多的能量消耗,也不需要高溫高壓、強酸強堿等條件,可以克服物理和化學(xué)法處理秸稈的弊端,具有能耗低、污染小、易于操作等優(yōu)點[4]。使用生物技術(shù)處理秸稈,可以破壞秸稈纖維的結(jié)構(gòu),故利用生物技術(shù)提高秸稈利用率得到廣泛關(guān)注。全面、客觀、正確地評價粗飼料的營養(yǎng)價值并采用恰當(dāng)合理的方法利用飼料資源,可以降低動物的飼養(yǎng)成本,提高經(jīng)濟效益,在實際生產(chǎn)中具有重要的指導(dǎo)意義。
農(nóng)作物秸稈主要由細(xì)胞壁和細(xì)胞內(nèi)容物組成,兩者的比例約在8∶2,通常細(xì)胞內(nèi)容物可以幾乎完全被動物消化利用[4]。木質(zhì)纖維素是秸稈細(xì)胞壁的主要成分,其中纖維素占細(xì)胞壁組分的40.6%~51.2%,半纖維素占28.5%~37.2%,木質(zhì)素占13.6%~28.1%,除此之外,細(xì)胞壁中還含有少量的果膠和結(jié)構(gòu)蛋白[6]。果膠和結(jié)構(gòu)蛋白可以被動物直接利用,果膠酶是分解果膠的復(fù)雜酶譜,包括原果膠酶、果膠甲酯水解酶、果膠酸酶3種酶,這3種酶的聯(lián)合作用使果膠質(zhì)得以完全分解[7]。
纖維素是秸稈細(xì)胞壁的主要骨架物質(zhì),纖維素微纖絲的長度、角度和結(jié)晶度在細(xì)胞壁的物理作用中起主要作用[8]。由于纖維素具有特定的結(jié)構(gòu)層次特征,遂將其分為一級結(jié)構(gòu)、二級結(jié)構(gòu)、三級結(jié)構(gòu)、四級結(jié)構(gòu)。纖維素的一級結(jié)構(gòu)是單純由D-葡萄糖通過β-1,4糖苷鍵鏈接而成的長鏈高分聚合物,一般由500~10 000個葡萄糖單元構(gòu)成,形成了組成微纖絲的糖鏈結(jié)構(gòu);纖維素糖鏈形成以后,其葡萄糖殘基上的羥基和分子間或內(nèi)部的羥基基團(tuán)形成穩(wěn)定的氫鍵網(wǎng)絡(luò),平行面上的糖鏈形成穩(wěn)定的一層糖鏈片層,使纖維糖鏈形成極為穩(wěn)定的超大分子,稱之為纖維素的二級結(jié)構(gòu);纖維素分子中,糖鏈的片層之間借助疏水作用力及范德華力等相互作用力,使糖鏈片層有規(guī)則的堆積成高度穩(wěn)定的結(jié)晶纖維素,也就是植物細(xì)胞壁中的微纖絲結(jié)構(gòu),即纖維素的三級結(jié)構(gòu);纖維素微纖絲由18~24條纖維素分子鏈構(gòu)成纖維素基本單位[2-8]。微纖絲中分子鏈有序堆積形成結(jié)晶結(jié)構(gòu),分子鏈無序堆積形成非結(jié)晶結(jié)構(gòu),多根微纖絲之間由于不同化學(xué)鍵的作用力,以不同方式排列形成一定的聚集態(tài)結(jié)構(gòu),即纖維素的超分子結(jié)構(gòu),也稱之為纖維素的四級結(jié)構(gòu)[9]。纖維素降解酶是由若干種相互關(guān)聯(lián)的酶組成的一個復(fù)雜的酶系統(tǒng),主要由內(nèi)切葡萄糖苷酶(Cx酶)、外切葡萄糖苷酶(C1酶)和β-葡萄糖苷酶(CB酶)組成。其降解過程主要是由Cx酶在纖維素的非結(jié)晶部位進(jìn)行切割,產(chǎn)生非氧化末端,然后再由C1酶以纖維二糖為單位,從末端進(jìn)行水解,最后由CB酶將纖維二糖徹底水解為葡萄糖[10]。
半纖維素是植物細(xì)胞壁中僅次于纖維素的物質(zhì)。半纖維素是由幾種不同類型的單糖構(gòu)成的異質(zhì)多聚體,包括葡萄糖、木糖、甘聚糖、阿拉伯糖與半乳糖等,各單糖聚合體間分別以共價鍵、氫鍵、酯鍵或醚鍵相連接,因而呈現(xiàn)穩(wěn)定的化學(xué)結(jié)構(gòu)[9]。半纖維素可以被降解為單糖和乙酸。降解半纖維素的酶主要有木聚糖酶、甘露聚糖酶、β-葡聚糖酶和半乳聚糖酶等,其中β-葡聚糖酶是飼料工業(yè)中應(yīng)用較多的半纖維素降解酶,它主要由木霉、黑曲霉、米曲霉、枯草桿菌和地衣芽孢桿菌等微生物產(chǎn)生[11]。
木質(zhì)素是以苯基丙烷為基本結(jié)構(gòu)單元的芳香族高分子聚合物,單體之間通過醚鍵和碳碳鍵等相連接,形成一個無定型的三維空間網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。木質(zhì)素與纖維素、半纖維素緊密結(jié)合,防止多余水分與有毒、有害物質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞,可以支持保護(hù)植物細(xì)胞的生長;木質(zhì)素填充在纖維素結(jié)構(gòu)骨架中能夠增強植物體的機械強度,有利于輸導(dǎo)組織之間的水分運輸,抵抗外界不良環(huán)境因素的干擾和侵襲;正是由于上述原因,木質(zhì)素的結(jié)構(gòu)非常穩(wěn)定,不易被降解[12]。隨著農(nóng)作物秸稈的成熟,植物細(xì)胞壁中的木質(zhì)素含量越來越高,進(jìn)一步增強了植物體的堅實性。木質(zhì)素的降解主要依賴細(xì)菌、真菌等微生物群落共同作用,其中真菌發(fā)揮了巨大的功效。降解木質(zhì)素的真菌主要有白腐菌、褐腐菌和軟腐菌,由于白腐菌降解木質(zhì)素的能力較強,在生產(chǎn)中應(yīng)用比較廣泛。木質(zhì)素降解菌還可以產(chǎn)生獨特的木質(zhì)素降解酶系,目前研究較多的是由白腐真菌產(chǎn)生的木質(zhì)素過氧化物酶(簡稱Li P)、錳過氧化物酶(簡稱Mn P)和漆酶(簡稱Lac),這些酶系共同降解木質(zhì)素。
由于秸稈的復(fù)雜難以降解性,酶解需要多種酶的協(xié)同作用,單一酶系降解時間較長且不徹底,通常將各種酶制劑混合,構(gòu)成復(fù)合制劑來降解秸稈,以發(fā)揮各個酶系優(yōu)勢,達(dá)到快速降解秸稈纖維的目的。因此對于農(nóng)作物秸稈,有針對性的添加適量的復(fù)合酶可以改善其營養(yǎng)物質(zhì)的利用效果,便于破壞其結(jié)構(gòu),促進(jìn)瘤胃微生物對粗纖維的降解,提高反芻動物對飼料的利用效率。
1.2.1 秸稈生物發(fā)酵的概念
生物發(fā)酵秸稈飼料就是在秸稈飼料中加入有針對性的活菌制劑,在密閉厭氧的環(huán)境中,這些微生物大量生長繁殖并分泌各種酶,通過降解多糖和木質(zhì)素破壞其連接的共價鍵,一方面破壞秸稈難消化的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu),使與木質(zhì)素交聯(lián)在一起的纖維素與半纖維素解脫束縛;另一方面又使秸稈細(xì)胞壁內(nèi)可利用的碳水化合物和其他營養(yǎng)物質(zhì)暴露出來,增加纖維素與消化液接觸的機會,從而提高秸稈中可利用物質(zhì)的消化率或瘤胃降解率,同時菌體自身生物量的增長又可提高真蛋白的含量[13]。
1.2.2 秸稈經(jīng)過生物發(fā)酵改善飼用價值
農(nóng)作物秸稈在生長過程中,纖維素-半纖維素-木質(zhì)素形成疏水穩(wěn)定的抗降解結(jié)構(gòu),該結(jié)構(gòu)使微生物不能在短時間內(nèi)將木質(zhì)纖維素完全降解,意味著木質(zhì)纖維素?zé)o法被動物直接高效利用。生物發(fā)酵秸稈飼料中常用的酶制劑主要有淀粉酶、纖維素酶、半纖維素酶,能有效降解秸稈中的抗?fàn)I養(yǎng)因子。同時,生物發(fā)酵秸稈使用的菌種大多是同型發(fā)酵乳酸菌或異型發(fā)酵乳桿菌,可提高秸稈飼料的有氧穩(wěn)定性,防止有機質(zhì)流失[14]。除此之外,經(jīng)微生物發(fā)酵處理后,秸稈飼料含有菌體蛋白、各種酶類、抑菌因子、維生素等菌體發(fā)酵代謝產(chǎn)物,具有一定的保健促生長功能[15]。反芻動物瘤胃內(nèi)本身含有龐大的微生物區(qū)系,其中的纖維素分解菌系列可以通過分泌的復(fù)雜酶譜,降解纖維素。秸稈生物發(fā)酵過程中添加纖維素復(fù)合酶可以補充內(nèi)源酶的不足,可以參加瘤胃內(nèi)的生物活動,將纖維素和半纖維素分解為乙酸、丙酸、丁酸等揮發(fā)性脂肪酸(VFA),有益于秸稈飼料的適口性。反芻動物的能量約60%~70%來源于VFA,另一方面可以提高奶牛乳汁的脂肪含量,改善乳品質(zhì)。
飼料的化學(xué)成分分析只能表明飼料本身的營養(yǎng)價值,并不能表明他們在動物胃腸道中的利用程度。目前常用于評定反芻動物對粗飼料利用率的方法主要有體外法(in vitro)、半體內(nèi)法(in situ)和體內(nèi)法(in vivo)三種方法。
2.1.1 體外法
體外法包括酶解法、糞液法、溶解度法、產(chǎn)氣法,目前常用的是體外產(chǎn)氣法。體外產(chǎn)氣法是在體外裝置內(nèi),將待測飼料樣與瘤胃液共同培養(yǎng),培養(yǎng)結(jié)束后測定產(chǎn)生氣體的速率和含量,并根據(jù)測定指標(biāo)估計飼料營養(yǎng)價值的方法[16]。該法能夠較真實地模擬飼料在瘤胃內(nèi)的消化利用情況,但必須與其他測定指標(biāo)相配合,技術(shù)細(xì)節(jié)、發(fā)酵底物和產(chǎn)氣裝置等對結(jié)果影響大。通常情況下,飼料中的有機物含量越多,瘤胃的產(chǎn)氣量就越高。李袁飛等[17]利用體外產(chǎn)氣法評定了15種飼料的營養(yǎng)價值并且對不同飼料組合的體外發(fā)酵特性進(jìn)行了評價,結(jié)果表明,不同飼料組合,中性洗滌纖維與粗蛋白的比值(NDF/CP)越小,其發(fā)酵速度越快、降解速率越高。王芳等[18]通過體外產(chǎn)氣法評定了三種能量飼料和三種粗飼料的營養(yǎng)價值,結(jié)果表明,能量飼料中玉米的GP24和DMD最高;粗飼料中苜蓿草粉的GP24和DMD最高。李文娟等[19]采用體外產(chǎn)氣法對甘蔗副產(chǎn)物的營養(yǎng)價值進(jìn)行評定,研究發(fā)現(xiàn)全株甘蔗的營養(yǎng)價值最高,其后依次為甘蔗葉、甘蔗渣,青貯和膨化技術(shù)對甘蔗副產(chǎn)物的營養(yǎng)價值具有改善作用。體外產(chǎn)氣法操作簡單,不過分依賴動物且自動化程度高,易用于大批量樣品的測定。但是人工模擬瘤胃始終與動物真實瘤胃有差異,其飼料消化率測定結(jié)果也有差異。
2.1.2 半體內(nèi)法
半體內(nèi)法亦稱尼龍袋技術(shù),此法是將被測樣品按照一定粒度粉碎后,裝入特制尼龍袋中,經(jīng)瘤胃瘺管送入瘤胃中培養(yǎng),經(jīng)過一段時間后取出,用自來水沖洗干凈,烘干稱重,測定尼龍袋中剩余殘渣的瘤胃降解率[20]。此法的優(yōu)點是可以將飼料的營養(yǎng)價值評定直接與反芻動物瘤胃內(nèi)微生物的活動緊密聯(lián)系起來,充分體現(xiàn)了反芻動物的消化生理特性。張永根等[21]采用糞液法和尼龍袋法測定牧草中的有機物和蛋白質(zhì)降解率,發(fā)現(xiàn)兩種方法的測定結(jié)果具有高度相關(guān)性。謝春元等[22]比較了尼龍袋法和體外產(chǎn)氣法評定飼料營養(yǎng)價值的差異性,研究表明尼龍袋法更能直觀地說明不同飼料的營養(yǎng)價值,但評價含有大量可溶物質(zhì)的飼料時,將增加高估瘤胃中飼料降解率的風(fēng)險。靳玲品等[23]用半體內(nèi)法測定了6種粗飼料的NDF和ADF的瘤胃降解率,并對飼料NDF、ADF瘤胃降解率與營養(yǎng)成分之間的相關(guān)關(guān)系進(jìn)行分析,建立了預(yù)測模型。尼龍袋技術(shù)雖然可以較真實地反映出飼料在瘤胃中的降解情況,但也存在一定的局限性,瘤胃食糜外流速度、尼龍袋孔徑大小、粉碎粒度均會影響試驗結(jié)果,且每批樣品測定時間較長,測定數(shù)量少。
2.1.3 體內(nèi)法
體內(nèi)法又稱活體法,是指選用活體動物測定飼料經(jīng)其消化道后的消化率。體內(nèi)法通常又分為全收糞法和指示劑法。因收糞部位不同,全收糞法又分為肛門收糞法和回腸末端收糞法。指示劑法分為內(nèi)源指示劑法和外源指示劑法[24]。體內(nèi)法測定瘤胃降解率比較準(zhǔn)確,是驗證半體內(nèi)法和體外法測定結(jié)果的參考標(biāo)準(zhǔn)[20]。高曄等[25]通過全收糞法和指示劑法測定陜北白絨山羊日糧養(yǎng)分的消化率,結(jié)果發(fā)現(xiàn)全收糞法與Cr2O3法測定的陜北絨山羊日糧NDF、ADF消化率的相關(guān)性較高,其余養(yǎng)分消化率差異不顯著。劉超遜等[26]采用酸不溶性灰分法、鏈烷烴C31法和全收糞法測定了象草、高粱秸和玉米秸在雜交山羊體內(nèi)各養(yǎng)分的消化率,研究表明,三種方法測得的營養(yǎng)物質(zhì)消化率差異不顯著。陳瑤等[27]使用全收糞法和指示劑法測定肉牛日糧有機物的消化率,結(jié)果表明,全收糞法評定有機物消化率更為準(zhǔn)確。體內(nèi)法測定的消化率比較準(zhǔn)確,具有可靠性和真實性,但操作繁瑣,費時費力,不適于大批量樣本的測定。
2.2.1 利用酶或復(fù)合酶提高飼用價值
許多研究表明,添加酶制劑能夠改善秸稈飼料的營養(yǎng)價值。黃梟等[28]研究表明,用飼用復(fù)合酶制劑處理玉米秸稈,纖維素含量比對照組降低了30.0%,粗蛋白、粗脂肪、總糖的含量分別提高了28.7%、12.6%、37.2%。Indunil Pathirana等[29]用纖維素酶和木聚糖酶處理稻秸進(jìn)行體外產(chǎn)氣試驗,結(jié)果顯示,各處理組體外產(chǎn)氣量和干物質(zhì)消失率均顯著高于對照組。Zimban?go C等[30]用體外產(chǎn)氣試驗表明,在高粗TMR中添加纖維素酶和木聚糖酶,DM、OM、NDF降解率分別比對照組提高了15.1%、15.65%、41.25%。同時,在秸稈飼料中添加酶制劑,還可以提高動物的生產(chǎn)性能。辛總秀[31]在飼喂綿羊的小麥秸稈中添加纖維素復(fù)合酶后,綿羊平均體重由28.02 kg增加到35.69 kg,比對照組多增加了37.70%。宋玉魁等[32]研究表明,在玉米秸稈青貯中添加酶制劑,可以提高玉米秸稈的營養(yǎng)價值,牛平均日產(chǎn)奶量比對照組提高了9.24%。蔡元等[33]以青玉米秸稈為原料,添加不同比例的酶制劑,進(jìn)行綿羊飼喂試驗,結(jié)果表明,各試驗組日增重比對照組提高17.91%~27.42%,且以添加酶制劑含量較高一組效果最好。
2.2.2 利用活菌微生物提高飼用價值
微生物作用于秸稈的原理是特定的菌種能將秸稈中的纖維素、半纖維素、木質(zhì)素等高分子碳水化合物分解為易被動物利用的小分子單糖或多糖,提高其在瘤胃中的降解率。Li等[34]利用布什乳桿菌和糞腸球菌處理玉米秸稈,半纖維素、纖維素分別比對照組降低了6.98%、3.34%。李飛等[35]經(jīng)生物處理玉米、小麥、水稻秸稈后,其在牛瘤胃中的有效降解率分別比對照組提高了45.58%、64.70%和41.54%。許麗等[36]測定了玉米秸微貯后干物質(zhì)和粗纖維在瘤胃中的降解率,結(jié)果發(fā)現(xiàn),干物質(zhì)和粗纖維的降解率分別比對照組提高了10.6%和18.8%。張立霞等[37]利用不同微生物菌株處理玉米秸稈,進(jìn)行瘤胃降解率的動態(tài)測定,結(jié)果顯示,各處理組玉米秸稈在0、6、12、24、48、72 h的降解率和有效降解率均大于對照組。陶蓮等[38]使用三種不同微生物制劑處理玉米秸稈,與對照組相比,均能提高玉米秸稈青貯中的OM含量及72 h瘤胃降解率。孫文[5]用微貯玉米秸稈替代部分羊草飼喂育成牛,與僅飼喂羊草的對照組相比日增重提高7.8%。
2.2.3 利用酶制劑和活菌制劑提高飼用價值
單獨加入酶或菌都能夠提高秸稈中纖維素的轉(zhuǎn)化效率,但酶和菌共同作用于秸稈,充分利用酶和菌的相互作用,秸稈的飼用價值可以取得顯著效果。在秸稈中加入一定量的纖維素酶和乳酸菌,不僅可以降解秸稈中的纖維素,還可將釋放的還原性糖轉(zhuǎn)變?yōu)槿樗?,抑制腐敗菌的增長,改善秸稈飼料的品質(zhì)。陳合等[39]利用菌酶共降解處理玉米秸稈,木質(zhì)素、纖維素、半纖維素的降解率分別達(dá)到67.0%、60.4%、33.0%。譚樹義等(2016)[40]報道,利用纖維素復(fù)合酶和乳酸菌處理玉米秸稈,可以顯著提高試驗組干物質(zhì)和蛋白質(zhì)含量,同時顯著降低了pH值、丁酸和氨態(tài)氮的含量。傅彤[14]添加植物乳桿菌+戊糖片球菌+復(fù)合纖維素酶的復(fù)合制劑分別使全株玉米青貯(60 d)的NDF和ADF含量減少了15.8%和15.0%,并增加了全株玉米青貯24 h瘤胃DM消失率,對48 h瘤胃DM消失率無影響。纖維素酶在一定程度上可以改變秸稈質(zhì)地,使其變得柔軟,適口性提高,動物也喜采食[31]。金加明等[41]對玉米秸稈進(jìn)行(粗酶液+酵母菌)處理后,發(fā)現(xiàn)試驗組只均日增重比對照組高49.1 g,日增重提高51%,差異極顯著(P<0.01)。
我國農(nóng)作物秸稈資源豐富,采用正確有效的加工調(diào)制方法,可以緩解粗飼料資源的不足。生物法調(diào)制秸稈具有多重優(yōu)點,是調(diào)制農(nóng)作物秸稈的優(yōu)先選擇。目前,大多數(shù)學(xué)者主要是以改善秸稈營養(yǎng)品質(zhì)、提高秸稈飼料利用率為研究重點,但是在秸稈生物處理過程中,秸稈細(xì)胞壁的破解程度與秸稈營養(yǎng)物質(zhì)的相關(guān)性卻鮮有報道。木質(zhì)纖維素的特殊結(jié)構(gòu)影響了秸稈在瘤胃中的降解效率,若能系統(tǒng)地從秸稈木質(zhì)纖維素的微觀結(jié)構(gòu)出發(fā),闡述其與營養(yǎng)物質(zhì)、瘤胃有效降解率、表觀消化率之間的相關(guān)性,將有助于秸稈飼料化的推進(jìn)。利用生物發(fā)酵技術(shù),開發(fā)出對動物生長有益的綠色廉價飼料,能夠緩解我國飼糧短缺、人畜爭糧的現(xiàn)狀,對實現(xiàn)農(nóng)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展具有重大的意義。生物發(fā)酵秸稈技術(shù)是農(nóng)業(yè)生物技術(shù)的核心組成部分,隨著研究的深入,生物發(fā)酵秸稈飼料的應(yīng)用前景必定更加廣闊。