高效液相色譜-電感耦合等離子體質(zhì)譜聯(lián)用法測定飼料中的無機(jī)砷及其他砷形態(tài)

■許錦華

（福建省產(chǎn)品質(zhì)量檢驗(yàn)研究院，福建福州 350002）

砷是一個(gè)與環(huán)境和人體健康關(guān)系密切的有害元素，砷的生物毒性不僅與其含量有關(guān)，與其存在形態(tài)更是密切相關(guān)，不同形態(tài)的砷化合物的毒性差異很大[1-3]。亞砷酸鹽[As(Ⅲ)]、砷酸鹽[As(Ⅴ)]、單甲基砷酸[MMA]、二甲基砷酸[DMA]和砷甜菜堿(AsB)是自然界常見的砷形態(tài)。它們的毒性排序?yàn)椋篈s(Ⅲ)＞As(Ⅴ)＞MMA＞DMA，砷甜菜堿常被認(rèn)為是無毒的。最近的研究顯示，MMA和DMA可能會(huì)誘發(fā)DNA被氧化，其毒性可能會(huì)超過無機(jī)砷[4]。它們易在食用者或飼用者體內(nèi)積累[5]，而且DMA又被認(rèn)為是潛在的致癌因子。

有機(jī)砷作為動(dòng)物抗病原微生物和促生長類飼料添加劑，對于提高畜禽的飼料利用率、增強(qiáng)抗病能力有著明顯作用，被普遍添加于飼料中。無機(jī)砷雖然在現(xiàn)代動(dòng)物營養(yǎng)學(xué)研究中被認(rèn)為和硒、碘一樣，是動(dòng)物機(jī)體的一種必需元素，但卻是一種有毒有害元素，對畜禽動(dòng)物的危害性很大，因此飼料衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)中對無機(jī)砷有嚴(yán)格的限制要求，即≤3.0 mg/kg。

目前測定飼料無機(jī)砷的方法主要是用氫化物原子熒光分光光度計(jì)進(jìn)行測定[6]。該方法測出來的無機(jī)砷含量往往會(huì)偏高，這是由于在分離提取過程中部分有機(jī)砷也會(huì)被提取出來，在鹽酸長時(shí)間浸泡過程中，導(dǎo)致砷形態(tài)的轉(zhuǎn)化；無機(jī)砷測定過程中部分有機(jī)砷也會(huì)產(chǎn)生氫化物。為了解決上述問題，近年來，色譜聯(lián)用技術(shù)被廣泛應(yīng)用于砷元素形態(tài)分析。國內(nèi)外常采用高效液相色譜（HPLC）與電感耦合等離子體質(zhì)譜（ICP-MS）、原子熒光光譜（AFS）等[7-9]技術(shù)分析砷形態(tài)化合物。ICP-MS具有靈敏度高、檢出限低、線性范圍寬等優(yōu)點(diǎn)，近年來已成為重要的元素檢測分析手段。HPLC與ICP-MS聯(lián)用技術(shù)已經(jīng)成為元素形態(tài)分析最常用和有效的方法之一，對于砷形態(tài)分析而言，在靈敏度、分離效能方面最具優(yōu)勢。

本文采用HPLC-ICP-MS進(jìn)行五種砷形態(tài)的分離分析，采用水為提取劑，在封閉環(huán)境下加熱提取，針對飼料樣品基質(zhì)復(fù)雜的問題，采用C18小柱凈化，實(shí)現(xiàn)了飼料樣品五種砷形態(tài)的準(zhǔn)確測定。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

儀器：Agilent 1100高效液相色譜（安捷倫科技有限公司）；Agilent 7500a型電感耦合等離子體質(zhì)譜（安捷倫科技有限公司）；MARS 5微波消解儀（美國CEM公司）；電熱鼓風(fēng)干燥箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）；Avanti J-E冷凍高速離心機(jī)（BECKMAN）；ST 2100/3C Pro-F型pH酸度計(jì)（美國奧豪斯）；XK-80A快速混勻器（新康醫(yī)療器械有限公司）；DKQ-4型智能控溫電加熱器（上海屹堯微波化學(xué)技術(shù)有限公司）；Sartorius BSA224S電子分析天平（賽多麗斯科學(xué)儀器有限公司）；Milli-Q超純水機(jī)（Milipore公司）。

試劑：超純水（電阻率18.2 MΩ·cm）；硝酸（優(yōu)級(jí)純，CNW公司）；無水乙酸鈉（分析純）；硝酸鉀（分析純）；磷酸二氫鈉（分析純）；乙二胺四乙酸二鈉（分析純）；氨水（分析純）；無水乙醇（色譜純）；砷標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)：亞砷酸根[As(Ⅲ)]（GBW 08666）、砷酸根[As(V)]（GBW 08667）、一甲基砷酸（MMA）（GBW 08668）、二甲基砷酸（DMA）（GBW08668）、砷甜菜堿（AsB）（GBW 08669）（中國計(jì)量科學(xué)研究院）；砷標(biāo)準(zhǔn)貯備液（1 000 μg/ml，國家有色金屬及電子材料分析測試中心）；調(diào)諧液（10 μg/l鋰、釔、鉈標(biāo)準(zhǔn)溶液）。

1.2 液相色譜及ICP-MS條件

色譜柱：陰離子分析柱Dionex IonPac AS19（250 mm×4.0）；陰離子保護(hù)柱IonPac AG19(50 mm×4.0)；

流動(dòng)相：A相：10 mmol/l無水乙酸鈉，3 mmol/l硝酸鉀，2 mmol/l磷酸二氫鈉，0.2 mmol/l乙二胺四乙酸二鈉，用氨水調(diào)節(jié)pH值10.7；B相：無水乙醇；A+B(99+1)混合等度淋洗；流速：1.0 ml/min；進(jìn)樣量：25 μl。

ICP-MS工作條件：功率1 350 W；載氣流量0.65 L/min；補(bǔ)償氣流量0.45 L/min；采樣深度7.0 mm；采集質(zhì)量數(shù)75。

1.3 飼料中砷形態(tài)的提取

取飼料樣品過40目篩待用。稱取該飼料樣品1 g（準(zhǔn)確至0.001 g）于50 ml離心管中，加入24 ml超純水，渦旋混勻，置于95℃烘箱中加熱提取2.5 h，每隔0.5 h渦旋1次。提取完后，冷卻至室溫，加入3%（v/v）乙酸溶液1 ml混勻沉淀蛋白，于4℃以10 000 r/min轉(zhuǎn)速離心5 min，取上清液用0.45 μm水系濾膜過濾及C18小柱凈化后上機(jī)測試。

1.4 總砷含量的測定

稱取過篩后的飼料樣品0.5 g（準(zhǔn)確至0.001 g）于聚四氟乙烯消解罐內(nèi)，加入6 ml硝酸和2 ml鹽酸，將消解罐蓋旋緊后，放入微波消解儀中，微波消解程序見表1。樣品消解完成，冷卻后打開消解罐，置于趕酸器（溫度設(shè)置為160℃）中趕酸，待消解液濃縮剩余2 ml左右，將其移入50 ml比色管，以少量去離子水清洗消解罐3次以上，洗液一同并入容量瓶中，定容、搖勻，同時(shí)做試劑空白。用電感耦合等離子體質(zhì)譜測定總砷。

表1 微波消解程序

2 結(jié)果與討論

2.1 流動(dòng)相的選擇

砷形態(tài)是以陰離子形式存在，因此選擇陰離子交換柱進(jìn)行分離，磷酸鹽溶液進(jìn)行等度淋洗，pH值和磷酸鹽濃度均會(huì)影響目標(biāo)砷形態(tài)的分離度，在流動(dòng)相中加入少量的甲醇或乙醇，都能對砷的檢測起到增敏效應(yīng)，提高砷的電離效率及靈敏度，考慮到乙醇對人體的傷害較小，因此實(shí)驗(yàn)選擇在淋洗液中加入1%乙醇，可以有效地將靈敏度提高1倍以上。在流動(dòng)相：A相：10 mmol/l無水乙酸鈉，3 mmol/l硝酸鉀，2 mmol/l磷酸二氫鈉，0.2 mmol/l乙二胺四乙酸二鈉，用氨水調(diào)節(jié)pH值10.7；B相：無水乙醇；A+B(99+1)混合等度淋洗下，能夠?qū)崿F(xiàn)5種砷形態(tài)分離，分離度和保留時(shí)間均可以達(dá)到試驗(yàn)要求。圖1為選用該流動(dòng)相的5種砷形態(tài)標(biāo)準(zhǔn)品與樣品色譜圖。

圖1 砷形態(tài)色譜圖

2.2 方法線性范圍及檢出限

按試驗(yàn)方法，對質(zhì)量濃度分別為0、1.0、5.0、10.0、20.0 μg/l和50.0 μg/l的5種形態(tài)砷混合標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行HPLC-ICP-MS分析，以砷形態(tài)的峰面積對濃度進(jìn)行線性回歸，結(jié)果表明：在0～50.0 μg/l的范圍內(nèi)，各種砷形態(tài)的線性回歸方程相關(guān)系數(shù)均在0.999以上。以3倍色譜峰信噪比S/N計(jì)算得到5種無機(jī)砷形態(tài)的儀器檢出限見表2，在試樣取樣量為1 g，定容體積為25 ml時(shí)，方法檢出限（按儀器檢出限×稀釋倍數(shù)計(jì)算）結(jié)果見表2。

2.3 飼料中砷形態(tài)的提取效率

砷形態(tài)的提取方法有水、甲醇-水、酶提取、酸提取等[10-12]。熱水提取，是一種傳統(tǒng)的砷形態(tài)提取方法，不會(huì)造成砷形態(tài)的轉(zhuǎn)化。試驗(yàn)采用水做為提取劑，密閉加熱提取，對提取溫度和提取時(shí)間進(jìn)行優(yōu)化。為了考察砷形態(tài)的提取效率，試驗(yàn)通過比較微波消解-ICP-MS方法測定的總砷（見表3）與HPLC-ICP-MS測定的總砷，提取效率為88.7%～104%，說明95℃中熱浸提2.5 h可以有效地提取飼料中的砷形態(tài)。

2.4 方法回收率及重現(xiàn)性

為考察方法的回收率和砷形態(tài)化合物的穩(wěn)定性，按試驗(yàn)方法對飼料樣品進(jìn)行3個(gè)添加水平的加標(biāo)回收試驗(yàn)，結(jié)果見表4。從表4可以看出，5種形態(tài)砷化合物的加標(biāo)回收率在88.6%～105%之間，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差在2.1%～6.7%（平行測定6次）。說明熱提取方法不會(huì)造成砷形態(tài)的轉(zhuǎn)化。

2.5 飼料中砷形態(tài)分布

采用所建立的方法測定12個(gè)飼料樣品中的5種砷形態(tài)化合物，檢驗(yàn)結(jié)果見表3。從試驗(yàn)結(jié)果可知，飼料中的總砷含量在0.46～3.92 mg/kg之間，砷形態(tài)以砷甜菜堿（AsB）為主，個(gè)別樣品含有DMA和無機(jī)砷，無機(jī)砷含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于其限量值。

3 結(jié)論

試驗(yàn)建立了熱水浸提，C18小柱凈化，陰離子交換色譜與電感耦合等離子體質(zhì)譜聯(lián)用方法測定飼料中5種砷形態(tài)的方法。通過測定12個(gè)飼料的砷形態(tài)，發(fā)現(xiàn)飼料中的砷形態(tài)以有機(jī)砷為主。HPLC-ICP-MS測定飼料中無機(jī)砷含量的分析方法，具有靈敏度高、準(zhǔn)確性好等優(yōu)點(diǎn)，是檢測飼料無機(jī)砷的有效方法之一。

表2 線性范圍及檢出限

表3 飼料樣品中砷形態(tài)分布（mg/kg）

表4 飼料樣品中5種砷形態(tài)的加標(biāo)回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(%)(n=6)