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    產(chǎn)木聚糖酶芽孢桿菌的篩選鑒定及肉兔飼喂效果研究

    2017-01-05 08:12:50楊佳蕾張學(xué)雯李術(shù)娜
    飼料工業(yè) 2017年12期
    關(guān)鍵詞:聚糖菌劑芽孢

    ■楊佳蕾 張學(xué)雯 李術(shù)娜*

    (1.西北農(nóng)林科技大學(xué)經(jīng)濟(jì)管理學(xué)院,陜西楊凌 712100;2.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,河北保定 071001)

    我國(guó)的畜禽主要食用玉米-豆粕型日糧,這種飼料富含半纖維素。木聚糖是半纖維素的一種主要組成部分,占植物干重的35%,是自然界中第二豐富的物質(zhì)資源[1-3]。研究表明畜禽食用木聚糖后使消化道內(nèi)容物具有較強(qiáng)的黏性,導(dǎo)致畜禽消化道功能減弱,影響畜禽的生長(zhǎng)性能與飼料利用率。動(dòng)物自身分泌的酶不能將攝入的木聚糖完全消化,畜禽會(huì)出現(xiàn)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)利用率降低,生長(zhǎng)性能下降等現(xiàn)象。

    大量研究證實(shí),飼糧中輔加相應(yīng)酶制劑,能夠提高動(dòng)物對(duì)飼料的利用率,進(jìn)而提高動(dòng)物生長(zhǎng)性能。譚權(quán)等[4]在日糧中添加木聚糖酶,發(fā)現(xiàn)其可促進(jìn)肉雞生長(zhǎng)性能;李建民等[5]在日糧中添加混合飼用酶制劑,結(jié)果表明可促進(jìn)肉兔生長(zhǎng)性能;胡向東等[6]在飼糧中添加木聚糖酶,證實(shí)可促進(jìn)生長(zhǎng)豬生長(zhǎng)性能;張仁祥等[7]在日糧中添加復(fù)合酶,證實(shí)可促進(jìn)泰山肉兔增重。但此法成本較高,因此有學(xué)者[8-9]嘗試在日糧中直接添加益生菌、產(chǎn)酶菌的方式來(lái)促進(jìn)動(dòng)物的健康節(jié)糧養(yǎng)殖,這種方法對(duì)菌劑提出了更高的要求:菌株不僅具有明確的產(chǎn)酶能力,還要易于生產(chǎn),最重要的是要耐受動(dòng)物胃腸道的極端環(huán)境。目前已報(bào)道的木聚糖菌株中[10-11],學(xué)者們多注重對(duì)酶活力與酶性質(zhì)的研究,缺少對(duì)耐受動(dòng)物胃腸道能力、生產(chǎn)能力及安全性的考察。

    本研究通過(guò)篩選耐受動(dòng)物胃腸道環(huán)境的產(chǎn)木聚糖酶的芽孢桿菌,并對(duì)菌株進(jìn)行菌種鑒定與安全性試驗(yàn),為飼用產(chǎn)酶菌劑的研制開(kāi)發(fā)積累菌種資源,奠定科學(xué)基礎(chǔ)。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    1.1.1 菌源樣品

    用對(duì)角線法采集保定市南市區(qū)牛糞便以及長(zhǎng)期堆放腐敗秸稈、樹葉的10~15 cm深處土壤,大約各取50~100 g保存在采樣袋中,分別編號(hào)并記錄采集地點(diǎn)和時(shí)間。

    1.1.2 培養(yǎng)基

    1.1.2.1 菌株篩選培養(yǎng)基

    NB培養(yǎng)基:牛肉膏5.0 g,蛋白胨10 g,氯化鈉5.0 g,加水至1 000 ml,pH值7.2~7.4。

    NA培養(yǎng)基:為NB培養(yǎng)基加入2%的瓊脂。

    產(chǎn)木聚糖酶富集培養(yǎng)基:玉米芯木聚糖10.0 g,氯化鈉5.0 g,蛋白胨3.0 g,硝酸銨2.0 g,磷酸氫二鉀 2.0 g,七水合硫酸鎂 0.2 g,蒸餾水 1 000 ml,pH值自然。

    產(chǎn)木聚糖酶分離培養(yǎng)基:瓊脂20.0 g,玉米芯木聚糖10.0 g,硝酸鉀1.0 g,磷酸氫二鉀0.5 g,氯化鈉0.5 g,七水合硫酸鎂0.2 g,蒸餾水1 000 ml,pH值自然。

    1.1.2.2 菌株生理生化試驗(yàn)培養(yǎng)基

    參照《常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》配制。

    1.1.3 試劑

    菌種鑒定試劑:根據(jù)《常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》配制,包括本尼迪克特氏試劑、格里斯氏試劑、Kovac's試劑、甲基紅試劑、V-P測(cè)定試劑等。

    人工胃液、人工腸液參照Galindo A B方法配制[12]。

    膽酸鹽溶液配制:在100 mlNB培養(yǎng)基中加入膽酸鹽,配成濃度分別為0.5%、0.3%、0.1%的溶液,115℃滅菌30 min。

    1.1.4 試驗(yàn)動(dòng)物

    試驗(yàn)小鼠:購(gòu)買60只健康小白鼠,體重為(20±2)g,購(gòu)回后進(jìn)行3 d預(yù)飼養(yǎng),然后分組進(jìn)行試驗(yàn)。房間溫度為(20±1)℃,相對(duì)濕度為50%。

    肉兔:河北農(nóng)業(yè)大學(xué)標(biāo)本園養(yǎng)殖基地購(gòu)買的60日齡肉兔60只,隨機(jī)分為6組,每組10只,不分公母。采用籠內(nèi)飼養(yǎng)。

    肉兔飼料:河北省禽塔集團(tuán)購(gòu)買。

    配方見(jiàn)表1。

    表1 基礎(chǔ)飼糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平(風(fēng)干基礎(chǔ))

    1.1.5 試驗(yàn)菌粉

    由河北民得富生物科技有限公司進(jìn)行液體發(fā)酵,噴霧干燥,制成菌粉,最終制得含生物量為1.5×1011cfu/g的試驗(yàn)菌粉。

    1.2 產(chǎn)木聚糖酶芽孢桿菌的分離篩選

    1.2.1 產(chǎn)木聚糖酶芽孢桿菌的富集培養(yǎng)與分離

    將菌源樣品5.00 g放入含100 ml無(wú)菌水的三角瓶中,充分搖勻使成菌懸液,置80℃水浴20 min。進(jìn)行稀釋涂布,培養(yǎng)到長(zhǎng)出菌落,挑取形態(tài)不同的單菌落編號(hào)保藏于NA培養(yǎng)基斜面上。

    1.2.2 產(chǎn)木聚糖酶芽孢細(xì)菌的篩選

    分別挑取初篩菌株點(diǎn)種在產(chǎn)木聚糖酶分離培養(yǎng)基平板上,然后37℃培養(yǎng)48 h,用1.0%剛果紅溶液覆蓋培養(yǎng)基平板表面30 min,培養(yǎng)基表面用飽和氯化鈉溶液沖洗,觀察是否存在透明圈,將產(chǎn)生透明圈的菌株進(jìn)行菌種保藏,并編號(hào)。

    將初篩菌株接種于NB培養(yǎng)基中,搖床培養(yǎng)12 h,接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中,同樣條件培養(yǎng)24 h,取發(fā)酵液10 000 r/min離心5 min,取上清液測(cè)定木聚糖酶活力,選用GB/T23874—2009飼料添加劑木聚糖酶活力方法測(cè)定。

    1.3 菌株的種屬鑒定

    1.3.1 形態(tài)觀察

    從NA培養(yǎng)基斜面上挑取菌株于NB培養(yǎng)基中,搖床培養(yǎng)24 h,稀釋涂布,倒置培養(yǎng)24 h后觀察菌落形態(tài)。挑取單菌落進(jìn)行制片,革蘭氏染色后觀察單菌體形態(tài)。

    1.3.2 生理生化試驗(yàn)

    參照《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》第八版[13]和《常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》[14],對(duì)細(xì)菌進(jìn)行生理生化鑒定。

    1.3.3 菌株DNA提取和16S rDNA序列分析及系統(tǒng)發(fā)育樹繪制

    參考李云程等[15]方法進(jìn)行菌株DNA提取和16S rDNA序列分析及系統(tǒng)發(fā)育樹繪制。

    1.4 產(chǎn)木聚糖酶芽孢桿菌菌株安全性、胃腸道環(huán)境耐受性試驗(yàn)

    菌株A-5種子液的制備:從活化好的菌株A-5斜面挑取少量菌苔于NB培養(yǎng)基中,37℃、200 r/min搖床培養(yǎng)24 h,在超凈臺(tái)中用無(wú)菌水稀釋成濃度為1.0×108cfu/ml的種子液。

    菌株的安全性試驗(yàn):根據(jù)GB159193.3—2003窛氏(KORBOR)法對(duì)菌株A-5進(jìn)行毒性、一般體征和臟器安全性檢測(cè)。試驗(yàn)小鼠灌入劑量分別為0.5、1.0 g/kg和5.0 g/kg體重,連續(xù)喂養(yǎng)14 d。試驗(yàn)開(kāi)始后每天觀察小鼠精神狀態(tài)、是否有中毒癥狀、生長(zhǎng)及排便狀況。在小鼠斷頸處死前12 h對(duì)小鼠進(jìn)行禁食,然后稱量各組小鼠重量,并對(duì)臟器進(jìn)行觀察和稱重。

    菌株人工胃液耐受性:將接種量1%菌株A-5種子液接入到人工胃液中,搖床培養(yǎng)并進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)。

    菌株耐膽酸鹽試驗(yàn):將菌株A-5種子液按1%的接種量接種至膽鹽濃度分別為0.5%、0.3%、0.1%的NB培養(yǎng)基于37℃、200 r/min培養(yǎng)24 h后,進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)。

    菌株人工腸液耐受性:將接種量1%菌株A~5種子液按1%的接種量接入到人工腸液中,搖床培養(yǎng)并進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)。

    1.5 產(chǎn)木聚糖酶芽孢桿菌制劑的肉兔飼喂效果

    1.5.1 肉兔的分組和飼養(yǎng)管理

    試驗(yàn)設(shè)計(jì)成6組。對(duì)照組:飼喂全價(jià)飼料。試驗(yàn)1~5組在全價(jià)飼料的基礎(chǔ)上添加A-5菌劑:添加量分別為0.10%、0.25%、0.50%、0.75%、1.00%,即分別配制成活菌體生物量為1.500×108、3.750×108、7.500×108、1.125×109、1.500×109cfu/g的飼料。

    飼喂:每天飼喂肉兔3次,保持水槽內(nèi)水量充足。預(yù)試期2 d,正試期28 d。

    1.5.2 試兔生長(zhǎng)性能測(cè)定

    試驗(yàn)前后對(duì)肉兔分別稱重,記錄給料量。計(jì)算肉兔平均日采食量(ADFI)、平均日增重(ADG)和料重比(F/G)。

    平均日采食量[g/(d·只)]=(給料量-剩料量)/(天數(shù)·只數(shù));

    平均日增重[g/(d·只)]=(試驗(yàn)后體重-試驗(yàn)初體重)/(天數(shù)·只數(shù));

    料重比=采食量/增重。

    1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

    利用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)生長(zhǎng)指標(biāo)的數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,P<0.05,表示差異顯著。

    2 結(jié)果

    2.1 產(chǎn)木聚糖酶芽孢桿菌的篩選

    在篩到的芽孢桿菌中用剛果紅法進(jìn)行初篩,得到有透明圈菌株的48株(見(jiàn)圖1)。篩到的菌株大多數(shù)符合細(xì)菌的菌株形態(tài)。

    圖1 菌株剛果紅初篩照片

    將在產(chǎn)木聚糖酶發(fā)酵培養(yǎng)基中酶活力較高的14株菌株重新編號(hào)(見(jiàn)表2),其中菌株A-5酶活力最高,達(dá)到56.848 U/ml。

    表2 木聚糖酶活力測(cè)定結(jié)果

    2.2 菌株的種屬鑒定

    2.2.1 菌株的形態(tài)觀察

    圖2 菌株A-5的單菌落及菌體形態(tài)

    由圖2可見(jiàn),菌株A-5表面呈乳白色,光滑,邊緣呈鋸齒狀,菌體成桿狀,革蘭氏染色反應(yīng)呈陽(yáng)性,大小為5.1×0.9 μm。

    2.2.2 菌株的生理生化試驗(yàn)

    參照《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》第八版和《常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》,對(duì)細(xì)菌進(jìn)行了生理生化鑒定。主要進(jìn)行蔗糖發(fā)酵、V-P試驗(yàn)、甲基紅、乳糖發(fā)酵、明膠液化等20多項(xiàng)試驗(yàn)。以Bacillus subtilis標(biāo)準(zhǔn)菌株36K(登陸號(hào)EF433406)作為對(duì)照,見(jiàn)表3。2.2.3 菌株的16S rDNA序列分析和系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建

    表3 菌株A-5生理生化試驗(yàn)結(jié)果

    將菌株A-5的16S rDNA序列結(jié)果放在GenBank上進(jìn)行序列比對(duì),構(gòu)建了系統(tǒng)發(fā)育樹(見(jiàn)圖3)。

    圖3 菌株A-5的系統(tǒng)發(fā)育樹

    經(jīng)過(guò)序列比對(duì),供試菌株A-5應(yīng)屬于芽孢桿菌屬。另外,供試菌株A-5與Bacillus subtilis36K的標(biāo)準(zhǔn)菌株16S rDNA序列的同源相似性高達(dá)99.95%,因此鑒定此菌株為Bacillus subtilis。

    2.3 產(chǎn)木聚糖酶芽孢桿菌菌株安全性、胃腸道環(huán)境耐受性試驗(yàn)

    2.3.1 菌株安全性試驗(yàn)

    小鼠攝入含菌株A-5的菌粉后呼吸平穩(wěn),沒(méi)有出現(xiàn)中毒癥狀,更無(wú)死亡現(xiàn)象,無(wú)異常表現(xiàn),生長(zhǎng)狀況良好。經(jīng)過(guò)稱重,對(duì)照組和空白組體重相近。

    2.3.2 菌株人工胃液耐受性情況

    菌株A-5在pH值為3.0的人工胃液中0、1、2 h后平均存活率分別為100%、95.66%、90.13%,在pH值為2.0的人工胃液中0、1、2 h后平均存活率分別為100%、97.58%、92.07%。

    2.3.3 菌株耐膽酸鹽試驗(yàn)情況

    菌株A-5在濃度分別為0.1%、0.3%、0.5%膽鹽溶液中,平均存活率分別為91.75%、16.55%、5.00%。

    2.3.4 菌株人工腸液耐受性情況

    菌株A-5在人工腸液中0、1、2 h后平均存活率分別為100%、92.35%、88.45%。

    2.4 產(chǎn)木聚糖酶芽孢制劑的肉兔飼喂效果(見(jiàn)表4)

    由表4可知,各試驗(yàn)組平均日增重較對(duì)照組都有提高,料重比較對(duì)照組均有降低,試驗(yàn)1~5組日均增重較對(duì)照組分別提高 5.57%(P<0.01)、7.92%(P<0.01)、5.48%(P<0.01)、4.74%(P<0.05)和 2.48%(P>0.05),料重比較對(duì)照組分別降低了5.23%(P<0.01)、6.09%(P<0.01)、4.38%(P<0.05)、4.03%(P<0.05)和2.01%(P>0.05)。菌劑添加量太少,產(chǎn)酶量過(guò)低,不能充分酶解飼料中的木聚糖;菌劑添加量太多,會(huì)使動(dòng)物胃本身腸道菌群失衡。所以菌劑添加量太少或太多都不能使試驗(yàn)動(dòng)物生長(zhǎng)性能達(dá)到最佳。

    表4 試兔生長(zhǎng)性能變化統(tǒng)計(jì)

    3 討論

    由于微生物來(lái)源的木聚糖酶是目前工業(yè)生產(chǎn)中木聚糖酶的主要來(lái)源。而微生物來(lái)源的木聚糖酶其產(chǎn)生菌則以芽孢桿菌屬菌株為主。前人已有對(duì)木聚糖酶生產(chǎn)菌株的報(bào)道,如羅玲等[16]獲得一株木聚糖酶生產(chǎn)菌株LMZY為異硫鏈霉菌,酶活力達(dá)3.543 U/ml;戚永躍等[17]得到一株產(chǎn)木聚糖酶菌株50647,鑒定其屬于擬盤多毛孢屬,木聚糖酶的酶活峰值為49.3 U/ml;鐘敏等[18]分離到一株產(chǎn)木聚糖酶的霉菌菌株X-1,木聚糖酶酶活達(dá)724.63 U/ml等。本研究獲得了產(chǎn)木聚糖酶的野生菌株,酶活力較高。但是在飼料中直接添加木聚糖酶產(chǎn)酶菌劑的研究卻未見(jiàn)報(bào)道,此法較酶制劑法成本更低。

    目前,越來(lái)越多的學(xué)者關(guān)注腸道微生物結(jié)構(gòu)與動(dòng)物生長(zhǎng)與健康的相關(guān)性的關(guān)系。本試驗(yàn)結(jié)果表明,在肉兔日糧中添加比例為0.25%木聚糖酶產(chǎn)酶菌劑可以提高肉兔的平均日增重,促進(jìn)肉兔生長(zhǎng)。分析原因可能是隨著菌劑的添加,會(huì)改善試兔的腸道菌群構(gòu)成,同時(shí),菌劑進(jìn)入兔的腸道環(huán)境后定植并產(chǎn)酶,增加了腸道消化酶的活力,雙方面的共同作用,致使動(dòng)物增加了對(duì)日糧的消化利用能力,最終達(dá)到促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)的目的。

    4 結(jié)論

    本試驗(yàn)篩選得到一株產(chǎn)木聚糖酶的野生菌株A-5,經(jīng)鑒定為枯草芽孢桿菌,其產(chǎn)酶活力為56.848 U/ml。在肉兔日糧中添加該菌劑對(duì)肉兔的生長(zhǎng)性能有顯著促進(jìn)作用,研究結(jié)果為肉兔飼料的合理利用、肉兔的高效養(yǎng)殖提供了新的思路。

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