• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    產(chǎn)木聚糖酶芽孢桿菌的篩選鑒定及肉兔飼喂效果研究

    2017-01-05 08:12:50楊佳蕾張學(xué)雯李術(shù)娜
    飼料工業(yè) 2017年12期
    關(guān)鍵詞:聚糖菌劑芽孢

    ■楊佳蕾 張學(xué)雯 李術(shù)娜*

    (1.西北農(nóng)林科技大學(xué)經(jīng)濟(jì)管理學(xué)院,陜西楊凌 712100;2.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,河北保定 071001)

    我國(guó)的畜禽主要食用玉米-豆粕型日糧,這種飼料富含半纖維素。木聚糖是半纖維素的一種主要組成部分,占植物干重的35%,是自然界中第二豐富的物質(zhì)資源[1-3]。研究表明畜禽食用木聚糖后使消化道內(nèi)容物具有較強(qiáng)的黏性,導(dǎo)致畜禽消化道功能減弱,影響畜禽的生長(zhǎng)性能與飼料利用率。動(dòng)物自身分泌的酶不能將攝入的木聚糖完全消化,畜禽會(huì)出現(xiàn)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)利用率降低,生長(zhǎng)性能下降等現(xiàn)象。

    大量研究證實(shí),飼糧中輔加相應(yīng)酶制劑,能夠提高動(dòng)物對(duì)飼料的利用率,進(jìn)而提高動(dòng)物生長(zhǎng)性能。譚權(quán)等[4]在日糧中添加木聚糖酶,發(fā)現(xiàn)其可促進(jìn)肉雞生長(zhǎng)性能;李建民等[5]在日糧中添加混合飼用酶制劑,結(jié)果表明可促進(jìn)肉兔生長(zhǎng)性能;胡向東等[6]在飼糧中添加木聚糖酶,證實(shí)可促進(jìn)生長(zhǎng)豬生長(zhǎng)性能;張仁祥等[7]在日糧中添加復(fù)合酶,證實(shí)可促進(jìn)泰山肉兔增重。但此法成本較高,因此有學(xué)者[8-9]嘗試在日糧中直接添加益生菌、產(chǎn)酶菌的方式來(lái)促進(jìn)動(dòng)物的健康節(jié)糧養(yǎng)殖,這種方法對(duì)菌劑提出了更高的要求:菌株不僅具有明確的產(chǎn)酶能力,還要易于生產(chǎn),最重要的是要耐受動(dòng)物胃腸道的極端環(huán)境。目前已報(bào)道的木聚糖菌株中[10-11],學(xué)者們多注重對(duì)酶活力與酶性質(zhì)的研究,缺少對(duì)耐受動(dòng)物胃腸道能力、生產(chǎn)能力及安全性的考察。

    本研究通過(guò)篩選耐受動(dòng)物胃腸道環(huán)境的產(chǎn)木聚糖酶的芽孢桿菌,并對(duì)菌株進(jìn)行菌種鑒定與安全性試驗(yàn),為飼用產(chǎn)酶菌劑的研制開(kāi)發(fā)積累菌種資源,奠定科學(xué)基礎(chǔ)。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    1.1.1 菌源樣品

    用對(duì)角線法采集保定市南市區(qū)牛糞便以及長(zhǎng)期堆放腐敗秸稈、樹葉的10~15 cm深處土壤,大約各取50~100 g保存在采樣袋中,分別編號(hào)并記錄采集地點(diǎn)和時(shí)間。

    1.1.2 培養(yǎng)基

    1.1.2.1 菌株篩選培養(yǎng)基

    NB培養(yǎng)基:牛肉膏5.0 g,蛋白胨10 g,氯化鈉5.0 g,加水至1 000 ml,pH值7.2~7.4。

    NA培養(yǎng)基:為NB培養(yǎng)基加入2%的瓊脂。

    產(chǎn)木聚糖酶富集培養(yǎng)基:玉米芯木聚糖10.0 g,氯化鈉5.0 g,蛋白胨3.0 g,硝酸銨2.0 g,磷酸氫二鉀 2.0 g,七水合硫酸鎂 0.2 g,蒸餾水 1 000 ml,pH值自然。

    產(chǎn)木聚糖酶分離培養(yǎng)基:瓊脂20.0 g,玉米芯木聚糖10.0 g,硝酸鉀1.0 g,磷酸氫二鉀0.5 g,氯化鈉0.5 g,七水合硫酸鎂0.2 g,蒸餾水1 000 ml,pH值自然。

    1.1.2.2 菌株生理生化試驗(yàn)培養(yǎng)基

    參照《常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》配制。

    1.1.3 試劑

    菌種鑒定試劑:根據(jù)《常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》配制,包括本尼迪克特氏試劑、格里斯氏試劑、Kovac's試劑、甲基紅試劑、V-P測(cè)定試劑等。

    人工胃液、人工腸液參照Galindo A B方法配制[12]。

    膽酸鹽溶液配制:在100 mlNB培養(yǎng)基中加入膽酸鹽,配成濃度分別為0.5%、0.3%、0.1%的溶液,115℃滅菌30 min。

    1.1.4 試驗(yàn)動(dòng)物

    試驗(yàn)小鼠:購(gòu)買60只健康小白鼠,體重為(20±2)g,購(gòu)回后進(jìn)行3 d預(yù)飼養(yǎng),然后分組進(jìn)行試驗(yàn)。房間溫度為(20±1)℃,相對(duì)濕度為50%。

    肉兔:河北農(nóng)業(yè)大學(xué)標(biāo)本園養(yǎng)殖基地購(gòu)買的60日齡肉兔60只,隨機(jī)分為6組,每組10只,不分公母。采用籠內(nèi)飼養(yǎng)。

    肉兔飼料:河北省禽塔集團(tuán)購(gòu)買。

    配方見(jiàn)表1。

    表1 基礎(chǔ)飼糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平(風(fēng)干基礎(chǔ))

    1.1.5 試驗(yàn)菌粉

    由河北民得富生物科技有限公司進(jìn)行液體發(fā)酵,噴霧干燥,制成菌粉,最終制得含生物量為1.5×1011cfu/g的試驗(yàn)菌粉。

    1.2 產(chǎn)木聚糖酶芽孢桿菌的分離篩選

    1.2.1 產(chǎn)木聚糖酶芽孢桿菌的富集培養(yǎng)與分離

    將菌源樣品5.00 g放入含100 ml無(wú)菌水的三角瓶中,充分搖勻使成菌懸液,置80℃水浴20 min。進(jìn)行稀釋涂布,培養(yǎng)到長(zhǎng)出菌落,挑取形態(tài)不同的單菌落編號(hào)保藏于NA培養(yǎng)基斜面上。

    1.2.2 產(chǎn)木聚糖酶芽孢細(xì)菌的篩選

    分別挑取初篩菌株點(diǎn)種在產(chǎn)木聚糖酶分離培養(yǎng)基平板上,然后37℃培養(yǎng)48 h,用1.0%剛果紅溶液覆蓋培養(yǎng)基平板表面30 min,培養(yǎng)基表面用飽和氯化鈉溶液沖洗,觀察是否存在透明圈,將產(chǎn)生透明圈的菌株進(jìn)行菌種保藏,并編號(hào)。

    將初篩菌株接種于NB培養(yǎng)基中,搖床培養(yǎng)12 h,接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中,同樣條件培養(yǎng)24 h,取發(fā)酵液10 000 r/min離心5 min,取上清液測(cè)定木聚糖酶活力,選用GB/T23874—2009飼料添加劑木聚糖酶活力方法測(cè)定。

    1.3 菌株的種屬鑒定

    1.3.1 形態(tài)觀察

    從NA培養(yǎng)基斜面上挑取菌株于NB培養(yǎng)基中,搖床培養(yǎng)24 h,稀釋涂布,倒置培養(yǎng)24 h后觀察菌落形態(tài)。挑取單菌落進(jìn)行制片,革蘭氏染色后觀察單菌體形態(tài)。

    1.3.2 生理生化試驗(yàn)

    參照《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》第八版[13]和《常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》[14],對(duì)細(xì)菌進(jìn)行生理生化鑒定。

    1.3.3 菌株DNA提取和16S rDNA序列分析及系統(tǒng)發(fā)育樹繪制

    參考李云程等[15]方法進(jìn)行菌株DNA提取和16S rDNA序列分析及系統(tǒng)發(fā)育樹繪制。

    1.4 產(chǎn)木聚糖酶芽孢桿菌菌株安全性、胃腸道環(huán)境耐受性試驗(yàn)

    菌株A-5種子液的制備:從活化好的菌株A-5斜面挑取少量菌苔于NB培養(yǎng)基中,37℃、200 r/min搖床培養(yǎng)24 h,在超凈臺(tái)中用無(wú)菌水稀釋成濃度為1.0×108cfu/ml的種子液。

    菌株的安全性試驗(yàn):根據(jù)GB159193.3—2003窛氏(KORBOR)法對(duì)菌株A-5進(jìn)行毒性、一般體征和臟器安全性檢測(cè)。試驗(yàn)小鼠灌入劑量分別為0.5、1.0 g/kg和5.0 g/kg體重,連續(xù)喂養(yǎng)14 d。試驗(yàn)開(kāi)始后每天觀察小鼠精神狀態(tài)、是否有中毒癥狀、生長(zhǎng)及排便狀況。在小鼠斷頸處死前12 h對(duì)小鼠進(jìn)行禁食,然后稱量各組小鼠重量,并對(duì)臟器進(jìn)行觀察和稱重。

    菌株人工胃液耐受性:將接種量1%菌株A-5種子液接入到人工胃液中,搖床培養(yǎng)并進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)。

    菌株耐膽酸鹽試驗(yàn):將菌株A-5種子液按1%的接種量接種至膽鹽濃度分別為0.5%、0.3%、0.1%的NB培養(yǎng)基于37℃、200 r/min培養(yǎng)24 h后,進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)。

    菌株人工腸液耐受性:將接種量1%菌株A~5種子液按1%的接種量接入到人工腸液中,搖床培養(yǎng)并進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)。

    1.5 產(chǎn)木聚糖酶芽孢桿菌制劑的肉兔飼喂效果

    1.5.1 肉兔的分組和飼養(yǎng)管理

    試驗(yàn)設(shè)計(jì)成6組。對(duì)照組:飼喂全價(jià)飼料。試驗(yàn)1~5組在全價(jià)飼料的基礎(chǔ)上添加A-5菌劑:添加量分別為0.10%、0.25%、0.50%、0.75%、1.00%,即分別配制成活菌體生物量為1.500×108、3.750×108、7.500×108、1.125×109、1.500×109cfu/g的飼料。

    飼喂:每天飼喂肉兔3次,保持水槽內(nèi)水量充足。預(yù)試期2 d,正試期28 d。

    1.5.2 試兔生長(zhǎng)性能測(cè)定

    試驗(yàn)前后對(duì)肉兔分別稱重,記錄給料量。計(jì)算肉兔平均日采食量(ADFI)、平均日增重(ADG)和料重比(F/G)。

    平均日采食量[g/(d·只)]=(給料量-剩料量)/(天數(shù)·只數(shù));

    平均日增重[g/(d·只)]=(試驗(yàn)后體重-試驗(yàn)初體重)/(天數(shù)·只數(shù));

    料重比=采食量/增重。

    1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

    利用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)生長(zhǎng)指標(biāo)的數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,P<0.05,表示差異顯著。

    2 結(jié)果

    2.1 產(chǎn)木聚糖酶芽孢桿菌的篩選

    在篩到的芽孢桿菌中用剛果紅法進(jìn)行初篩,得到有透明圈菌株的48株(見(jiàn)圖1)。篩到的菌株大多數(shù)符合細(xì)菌的菌株形態(tài)。

    圖1 菌株剛果紅初篩照片

    將在產(chǎn)木聚糖酶發(fā)酵培養(yǎng)基中酶活力較高的14株菌株重新編號(hào)(見(jiàn)表2),其中菌株A-5酶活力最高,達(dá)到56.848 U/ml。

    表2 木聚糖酶活力測(cè)定結(jié)果

    2.2 菌株的種屬鑒定

    2.2.1 菌株的形態(tài)觀察

    圖2 菌株A-5的單菌落及菌體形態(tài)

    由圖2可見(jiàn),菌株A-5表面呈乳白色,光滑,邊緣呈鋸齒狀,菌體成桿狀,革蘭氏染色反應(yīng)呈陽(yáng)性,大小為5.1×0.9 μm。

    2.2.2 菌株的生理生化試驗(yàn)

    參照《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》第八版和《常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》,對(duì)細(xì)菌進(jìn)行了生理生化鑒定。主要進(jìn)行蔗糖發(fā)酵、V-P試驗(yàn)、甲基紅、乳糖發(fā)酵、明膠液化等20多項(xiàng)試驗(yàn)。以Bacillus subtilis標(biāo)準(zhǔn)菌株36K(登陸號(hào)EF433406)作為對(duì)照,見(jiàn)表3。2.2.3 菌株的16S rDNA序列分析和系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建

    表3 菌株A-5生理生化試驗(yàn)結(jié)果

    將菌株A-5的16S rDNA序列結(jié)果放在GenBank上進(jìn)行序列比對(duì),構(gòu)建了系統(tǒng)發(fā)育樹(見(jiàn)圖3)。

    圖3 菌株A-5的系統(tǒng)發(fā)育樹

    經(jīng)過(guò)序列比對(duì),供試菌株A-5應(yīng)屬于芽孢桿菌屬。另外,供試菌株A-5與Bacillus subtilis36K的標(biāo)準(zhǔn)菌株16S rDNA序列的同源相似性高達(dá)99.95%,因此鑒定此菌株為Bacillus subtilis。

    2.3 產(chǎn)木聚糖酶芽孢桿菌菌株安全性、胃腸道環(huán)境耐受性試驗(yàn)

    2.3.1 菌株安全性試驗(yàn)

    小鼠攝入含菌株A-5的菌粉后呼吸平穩(wěn),沒(méi)有出現(xiàn)中毒癥狀,更無(wú)死亡現(xiàn)象,無(wú)異常表現(xiàn),生長(zhǎng)狀況良好。經(jīng)過(guò)稱重,對(duì)照組和空白組體重相近。

    2.3.2 菌株人工胃液耐受性情況

    菌株A-5在pH值為3.0的人工胃液中0、1、2 h后平均存活率分別為100%、95.66%、90.13%,在pH值為2.0的人工胃液中0、1、2 h后平均存活率分別為100%、97.58%、92.07%。

    2.3.3 菌株耐膽酸鹽試驗(yàn)情況

    菌株A-5在濃度分別為0.1%、0.3%、0.5%膽鹽溶液中,平均存活率分別為91.75%、16.55%、5.00%。

    2.3.4 菌株人工腸液耐受性情況

    菌株A-5在人工腸液中0、1、2 h后平均存活率分別為100%、92.35%、88.45%。

    2.4 產(chǎn)木聚糖酶芽孢制劑的肉兔飼喂效果(見(jiàn)表4)

    由表4可知,各試驗(yàn)組平均日增重較對(duì)照組都有提高,料重比較對(duì)照組均有降低,試驗(yàn)1~5組日均增重較對(duì)照組分別提高 5.57%(P<0.01)、7.92%(P<0.01)、5.48%(P<0.01)、4.74%(P<0.05)和 2.48%(P>0.05),料重比較對(duì)照組分別降低了5.23%(P<0.01)、6.09%(P<0.01)、4.38%(P<0.05)、4.03%(P<0.05)和2.01%(P>0.05)。菌劑添加量太少,產(chǎn)酶量過(guò)低,不能充分酶解飼料中的木聚糖;菌劑添加量太多,會(huì)使動(dòng)物胃本身腸道菌群失衡。所以菌劑添加量太少或太多都不能使試驗(yàn)動(dòng)物生長(zhǎng)性能達(dá)到最佳。

    表4 試兔生長(zhǎng)性能變化統(tǒng)計(jì)

    3 討論

    由于微生物來(lái)源的木聚糖酶是目前工業(yè)生產(chǎn)中木聚糖酶的主要來(lái)源。而微生物來(lái)源的木聚糖酶其產(chǎn)生菌則以芽孢桿菌屬菌株為主。前人已有對(duì)木聚糖酶生產(chǎn)菌株的報(bào)道,如羅玲等[16]獲得一株木聚糖酶生產(chǎn)菌株LMZY為異硫鏈霉菌,酶活力達(dá)3.543 U/ml;戚永躍等[17]得到一株產(chǎn)木聚糖酶菌株50647,鑒定其屬于擬盤多毛孢屬,木聚糖酶的酶活峰值為49.3 U/ml;鐘敏等[18]分離到一株產(chǎn)木聚糖酶的霉菌菌株X-1,木聚糖酶酶活達(dá)724.63 U/ml等。本研究獲得了產(chǎn)木聚糖酶的野生菌株,酶活力較高。但是在飼料中直接添加木聚糖酶產(chǎn)酶菌劑的研究卻未見(jiàn)報(bào)道,此法較酶制劑法成本更低。

    目前,越來(lái)越多的學(xué)者關(guān)注腸道微生物結(jié)構(gòu)與動(dòng)物生長(zhǎng)與健康的相關(guān)性的關(guān)系。本試驗(yàn)結(jié)果表明,在肉兔日糧中添加比例為0.25%木聚糖酶產(chǎn)酶菌劑可以提高肉兔的平均日增重,促進(jìn)肉兔生長(zhǎng)。分析原因可能是隨著菌劑的添加,會(huì)改善試兔的腸道菌群構(gòu)成,同時(shí),菌劑進(jìn)入兔的腸道環(huán)境后定植并產(chǎn)酶,增加了腸道消化酶的活力,雙方面的共同作用,致使動(dòng)物增加了對(duì)日糧的消化利用能力,最終達(dá)到促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)的目的。

    4 結(jié)論

    本試驗(yàn)篩選得到一株產(chǎn)木聚糖酶的野生菌株A-5,經(jīng)鑒定為枯草芽孢桿菌,其產(chǎn)酶活力為56.848 U/ml。在肉兔日糧中添加該菌劑對(duì)肉兔的生長(zhǎng)性能有顯著促進(jìn)作用,研究結(jié)果為肉兔飼料的合理利用、肉兔的高效養(yǎng)殖提供了新的思路。

    猜你喜歡
    聚糖菌劑芽孢
    相對(duì)分子質(zhì)量對(duì)木聚糖結(jié)晶能力的影響
    復(fù)合微生物菌劑在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的應(yīng)用
    外生菌根真菌菌劑的制備及保存研究
    園林科技(2020年2期)2020-01-18 03:28:26
    解淀粉芽孢桿菌Lx-11
    解淀粉芽孢桿菌的作用及其產(chǎn)品開(kāi)發(fā)
    側(cè)孢短芽孢桿菌A60
    飼料用β-甘露聚糖酶活力的測(cè)定
    湖南飼料(2019年5期)2019-10-15 08:59:10
    新型液體菌劑研制成功
    30L發(fā)酵罐培養(yǎng)枯草芽孢桿菌產(chǎn)高密度芽孢的研究
    產(chǎn)木聚糖酶菌株的篩選、鑒定及其酶學(xué)性質(zhì)研究
    80岁老熟妇乱子伦牲交| 少妇的丰满在线观看| 日韩欧美一区二区三区在线观看| 欧美成人午夜精品| 一本综合久久免费| 久久久久精品国产欧美久久久| 免费不卡黄色视频| 国产亚洲精品久久久久5区| 黄片小视频在线播放| 亚洲少妇的诱惑av| 黄网站色视频无遮挡免费观看| 在线播放国产精品三级| 国产精华一区二区三区| 十八禁网站免费在线| 精品电影一区二区在线| 日韩国内少妇激情av| 国产av一区在线观看免费| 欧美人与性动交α欧美精品济南到| 女性生殖器流出的白浆| 国产亚洲精品第一综合不卡| 欧美日韩av久久| 久久 成人 亚洲| 久久久久国产一级毛片高清牌| 久久久久九九精品影院| 露出奶头的视频| 久久精品aⅴ一区二区三区四区| 色精品久久人妻99蜜桃| 亚洲av美国av| 一级黄色大片毛片| 亚洲精品久久午夜乱码| 亚洲avbb在线观看| 久99久视频精品免费| 99riav亚洲国产免费| 十八禁人妻一区二区| 亚洲熟妇熟女久久| av在线播放免费不卡| 亚洲中文字幕日韩| 看黄色毛片网站| 亚洲精品国产色婷婷电影| 久久久国产成人精品二区 | 亚洲精品国产一区二区精华液| 美女午夜性视频免费| 无限看片的www在线观看| 99久久精品国产亚洲精品| 一边摸一边抽搐一进一小说| 大型av网站在线播放| 嫩草影院精品99| 国产一区二区在线av高清观看| 日韩中文字幕欧美一区二区| 久久 成人 亚洲| 欧美日韩亚洲国产一区二区在线观看| 久久精品成人免费网站| 99热只有精品国产| 亚洲片人在线观看| 男人舔女人的私密视频| 激情视频va一区二区三区| 国产亚洲精品久久久久久毛片| 岛国在线观看网站| 9191精品国产免费久久| 亚洲国产中文字幕在线视频| 久9热在线精品视频| 18禁美女被吸乳视频| 女生性感内裤真人,穿戴方法视频| 80岁老熟妇乱子伦牲交| 女人高潮潮喷娇喘18禁视频| 亚洲三区欧美一区| 欧美 亚洲 国产 日韩一| 日韩大尺度精品在线看网址 | 成人黄色视频免费在线看| 天堂中文最新版在线下载| 成人三级黄色视频| 一进一出抽搐gif免费好疼 | 久久精品影院6| 另类亚洲欧美激情| 欧美日韩瑟瑟在线播放| 看片在线看免费视频| 久久青草综合色| 欧洲精品卡2卡3卡4卡5卡区| 精品久久蜜臀av无| 亚洲一区高清亚洲精品| 女警被强在线播放| 精品福利永久在线观看| 日韩三级视频一区二区三区| 免费在线观看完整版高清| 亚洲精品一区av在线观看| 亚洲成人精品中文字幕电影 | 日韩欧美一区视频在线观看| 无遮挡黄片免费观看| 女同久久另类99精品国产91| 超碰成人久久| 亚洲精品久久午夜乱码| 日韩欧美在线二视频| 日本vs欧美在线观看视频| 中文欧美无线码| 日韩人妻精品一区2区三区| 久久久久久人人人人人| 欧美激情久久久久久爽电影 | 一级毛片高清免费大全| 高清av免费在线| 国产精品秋霞免费鲁丝片| 成年人黄色毛片网站| 国产成人影院久久av| 一级片免费观看大全| av网站免费在线观看视频| 日韩av在线大香蕉| 五月开心婷婷网| 中文字幕人妻丝袜一区二区| 成年人免费黄色播放视频| 琪琪午夜伦伦电影理论片6080| 久久亚洲精品不卡| 国产男靠女视频免费网站| 国产成人欧美| 亚洲精品成人av观看孕妇| 欧美日韩精品网址| 亚洲午夜理论影院| 香蕉久久夜色| 在线国产一区二区在线| 脱女人内裤的视频| 精品一区二区三区av网在线观看| 国产av一区在线观看免费| 久久青草综合色| 丰满迷人的少妇在线观看| 黄色怎么调成土黄色| 99精品在免费线老司机午夜| 中文字幕高清在线视频| 国产亚洲精品一区二区www| 成年版毛片免费区| 亚洲熟女毛片儿| 色婷婷久久久亚洲欧美| 99精品在免费线老司机午夜| 美女 人体艺术 gogo| 国产欧美日韩一区二区精品| 久久精品亚洲av国产电影网| 国产国语露脸激情在线看| 国产精品成人在线| 国产精品成人在线| 久久性视频一级片| 在线观看免费日韩欧美大片| 亚洲精华国产精华精| 久久久久久久精品吃奶| 日本a在线网址| 男女之事视频高清在线观看| 日本免费a在线| 黑丝袜美女国产一区| 久久精品国产亚洲av高清一级| 欧美成人性av电影在线观看| 亚洲七黄色美女视频| 日本a在线网址| 18美女黄网站色大片免费观看| 久99久视频精品免费| 一级片免费观看大全| 色综合站精品国产| 香蕉丝袜av| 中亚洲国语对白在线视频| 制服诱惑二区| tocl精华| 免费在线观看亚洲国产| 久久久久国产一级毛片高清牌| 亚洲一区高清亚洲精品| 男女高潮啪啪啪动态图| 最近最新中文字幕大全电影3 | 高清av免费在线| 久久午夜综合久久蜜桃| 99久久99久久久精品蜜桃| 欧美精品啪啪一区二区三区| 女性被躁到高潮视频| 国产精品乱码一区二三区的特点 | 精品国内亚洲2022精品成人| 窝窝影院91人妻| 9191精品国产免费久久| 美国免费a级毛片| 久久久久国产精品人妻aⅴ院| 777久久人妻少妇嫩草av网站| 一边摸一边做爽爽视频免费| 黑人巨大精品欧美一区二区mp4| 国产亚洲精品久久久久久毛片| 国产无遮挡羞羞视频在线观看| 99久久久亚洲精品蜜臀av| 欧美+亚洲+日韩+国产| 男女午夜视频在线观看| 亚洲va日本ⅴa欧美va伊人久久| 亚洲午夜精品一区,二区,三区| 精品少妇一区二区三区视频日本电影| 日韩免费av在线播放| 免费看a级黄色片| 亚洲自拍偷在线| 一a级毛片在线观看| 国产精品久久久人人做人人爽| 黄片小视频在线播放| 欧美日韩中文字幕国产精品一区二区三区 | 亚洲人成伊人成综合网2020| 国产成人欧美在线观看| 欧美丝袜亚洲另类 | 91精品三级在线观看| 美女高潮到喷水免费观看| 午夜亚洲福利在线播放| 久久99一区二区三区| 亚洲一卡2卡3卡4卡5卡精品中文| 久久久国产一区二区| 午夜久久久在线观看| 国内久久婷婷六月综合欲色啪| 欧美精品亚洲一区二区| 精品一区二区三卡| 国产黄a三级三级三级人| 免费观看人在逋| 亚洲人成电影观看| 国产欧美日韩综合在线一区二区| 精品欧美一区二区三区在线| 免费久久久久久久精品成人欧美视频| 黄色怎么调成土黄色| 亚洲自偷自拍图片 自拍| 身体一侧抽搐| 久久人人97超碰香蕉20202| 亚洲少妇的诱惑av| 男女下面进入的视频免费午夜 | 国产有黄有色有爽视频| 在线观看舔阴道视频| 老司机深夜福利视频在线观看| 女人被躁到高潮嗷嗷叫费观| 91字幕亚洲| 午夜影院日韩av| 他把我摸到了高潮在线观看| 国产一区二区在线av高清观看| 日本免费a在线| 高清毛片免费观看视频网站 | 国产aⅴ精品一区二区三区波| 脱女人内裤的视频| 两性午夜刺激爽爽歪歪视频在线观看 | 精品国产超薄肉色丝袜足j| 999精品在线视频| 男人舔女人下体高潮全视频| 大陆偷拍与自拍| 超色免费av| 99在线视频只有这里精品首页| 成人国语在线视频| 亚洲精品av麻豆狂野| 亚洲人成网站在线播放欧美日韩| 亚洲国产毛片av蜜桃av| 精品国产美女av久久久久小说| 久久中文字幕人妻熟女| 亚洲色图 男人天堂 中文字幕| 性欧美人与动物交配| 久久影院123| 欧美乱色亚洲激情| 一二三四在线观看免费中文在| 亚洲精品中文字幕在线视频| 久久亚洲精品不卡| 日韩三级视频一区二区三区| 午夜福利在线观看吧| 精品久久蜜臀av无| 久久久久久久久中文| 午夜两性在线视频| 日本五十路高清| 国产精品国产av在线观看| 久久久久久久午夜电影 | 丰满迷人的少妇在线观看| 久久精品国产综合久久久| 水蜜桃什么品种好| 亚洲专区中文字幕在线| 两个人免费观看高清视频| 琪琪午夜伦伦电影理论片6080| 老鸭窝网址在线观看| 热99re8久久精品国产| 久久草成人影院| 50天的宝宝边吃奶边哭怎么回事| 国产免费男女视频| 精品国产超薄肉色丝袜足j| av天堂在线播放| 另类亚洲欧美激情| 天天添夜夜摸| 亚洲黑人精品在线| 国产麻豆69| 9色porny在线观看| 国产亚洲精品一区二区www| 久久精品91蜜桃| 好男人电影高清在线观看| 美女午夜性视频免费| 99精品欧美一区二区三区四区| 一个人观看的视频www高清免费观看 | 美女高潮喷水抽搐中文字幕| 亚洲七黄色美女视频| 国产欧美日韩一区二区精品| 免费久久久久久久精品成人欧美视频| 欧美最黄视频在线播放免费 | 无遮挡黄片免费观看| 亚洲熟妇中文字幕五十中出 | 不卡av一区二区三区| 欧美一区二区精品小视频在线| 午夜免费观看网址| 久久久久久久精品吃奶| 亚洲免费av在线视频| 亚洲色图综合在线观看| 一边摸一边做爽爽视频免费| 亚洲国产毛片av蜜桃av| 久久人妻福利社区极品人妻图片| 99久久精品国产亚洲精品| 久久久久久久久中文| 欧美av亚洲av综合av国产av| 成在线人永久免费视频| 在线观看午夜福利视频| 日本三级黄在线观看| 精品久久久精品久久久| 日韩免费av在线播放| 国产午夜精品久久久久久| 18美女黄网站色大片免费观看| 久久精品国产99精品国产亚洲性色 | av欧美777| 18禁裸乳无遮挡免费网站照片 | 国产亚洲精品综合一区在线观看 | 亚洲国产精品合色在线| 99久久久亚洲精品蜜臀av| 日韩精品青青久久久久久| 国产高清激情床上av| 亚洲成av片中文字幕在线观看| 日韩三级视频一区二区三区| 高清毛片免费观看视频网站 | 中文字幕最新亚洲高清| 久久精品亚洲熟妇少妇任你| 99久久久亚洲精品蜜臀av| 欧美午夜高清在线| 亚洲精品中文字幕一二三四区| 久久这里只有精品19| av国产精品久久久久影院| 亚洲三区欧美一区| 国产高清激情床上av| 亚洲av第一区精品v没综合| 午夜老司机福利片| 99精品在免费线老司机午夜| 国产精品免费视频内射| 色在线成人网| 亚洲狠狠婷婷综合久久图片| 久99久视频精品免费| 午夜免费鲁丝| 精品国产超薄肉色丝袜足j| 精品乱码久久久久久99久播| 亚洲欧美一区二区三区黑人| 97超级碰碰碰精品色视频在线观看| xxxhd国产人妻xxx| 少妇粗大呻吟视频| 国产黄a三级三级三级人| 成人黄色视频免费在线看| 法律面前人人平等表现在哪些方面| 老司机亚洲免费影院| 搡老岳熟女国产| 啪啪无遮挡十八禁网站| 级片在线观看| 激情视频va一区二区三区| 亚洲精品久久成人aⅴ小说| 精品福利永久在线观看| 国产亚洲欧美精品永久| 午夜91福利影院| 久久久国产欧美日韩av| 51午夜福利影视在线观看| 亚洲人成电影免费在线| 91精品国产国语对白视频| 波多野结衣高清无吗| 成在线人永久免费视频| 色婷婷av一区二区三区视频| 中文字幕精品免费在线观看视频| av在线播放免费不卡| 最近最新免费中文字幕在线| 亚洲情色 制服丝袜| 热re99久久精品国产66热6| 91麻豆精品激情在线观看国产 | 日日爽夜夜爽网站| 精品电影一区二区在线| 啦啦啦 在线观看视频| 亚洲一卡2卡3卡4卡5卡精品中文| 人人澡人人妻人| 激情视频va一区二区三区| 88av欧美| 久久久国产成人免费| 黄色毛片三级朝国网站| 12—13女人毛片做爰片一| 精品乱码久久久久久99久播| 91国产中文字幕| 久久久久久久久免费视频了| 身体一侧抽搐| 亚洲精品粉嫩美女一区| av福利片在线| 午夜日韩欧美国产| 纯流量卡能插随身wifi吗| 免费在线观看完整版高清| 亚洲人成电影免费在线| 可以在线观看毛片的网站| 涩涩av久久男人的天堂| 日韩av在线大香蕉| 午夜成年电影在线免费观看| 色综合婷婷激情| 男女午夜视频在线观看| 亚洲av第一区精品v没综合| 久久久国产一区二区| 亚洲色图av天堂| 精品国产美女av久久久久小说| 国产精品偷伦视频观看了| 日日摸夜夜添夜夜添小说| 99国产极品粉嫩在线观看| 18禁美女被吸乳视频| 亚洲男人的天堂狠狠| 国产精品一区二区精品视频观看| 黄色女人牲交| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频| 精品卡一卡二卡四卡免费| 一级a爱片免费观看的视频| 亚洲人成电影观看| 日韩大尺度精品在线看网址 | 亚洲人成网站在线播放欧美日韩| 午夜福利,免费看| 精品熟女少妇八av免费久了| 女人爽到高潮嗷嗷叫在线视频| 日韩精品免费视频一区二区三区| 色精品久久人妻99蜜桃| 亚洲欧美日韩高清在线视频| av天堂在线播放| 久久亚洲真实| 成人18禁高潮啪啪吃奶动态图| 老汉色∧v一级毛片| 免费高清在线观看日韩| 美女扒开内裤让男人捅视频| 成人av一区二区三区在线看| 中国美女看黄片| 脱女人内裤的视频| 日本 av在线| 99riav亚洲国产免费| 国产1区2区3区精品| 精品一区二区三卡| 日韩大码丰满熟妇| 亚洲精品av麻豆狂野| 亚洲成人精品中文字幕电影 | 国产精品亚洲av一区麻豆| 麻豆成人av在线观看| 长腿黑丝高跟| 日本vs欧美在线观看视频| 亚洲国产精品合色在线| 国产精品免费一区二区三区在线| 欧美日韩福利视频一区二区| 国产亚洲精品一区二区www| 在线观看免费视频网站a站| 香蕉国产在线看| 午夜日韩欧美国产| av在线播放免费不卡| 中文欧美无线码| 99久久99久久久精品蜜桃| 中文字幕色久视频| 国产精品1区2区在线观看.| 很黄的视频免费| 成人永久免费在线观看视频| 亚洲成人国产一区在线观看| 日本vs欧美在线观看视频| 女同久久另类99精品国产91| 一个人免费在线观看的高清视频| 日本三级黄在线观看| 韩国精品一区二区三区| 亚洲精华国产精华精| 久久精品国产综合久久久| 宅男免费午夜| 亚洲免费av在线视频| 夜夜看夜夜爽夜夜摸 | 18禁裸乳无遮挡免费网站照片 | 精品电影一区二区在线| 欧美在线一区亚洲| 久久 成人 亚洲| 男人舔女人下体高潮全视频| 久久久国产成人免费| 欧美激情久久久久久爽电影 | 一区福利在线观看| 免费在线观看黄色视频的| 国产精品98久久久久久宅男小说| 久久精品人人爽人人爽视色| 免费av中文字幕在线| 99久久人妻综合| 亚洲精华国产精华精| 看片在线看免费视频| 亚洲精品久久成人aⅴ小说| 亚洲人成电影免费在线| 手机成人av网站| 欧美日本中文国产一区发布| 自拍欧美九色日韩亚洲蝌蚪91| 亚洲精品国产区一区二| 天堂中文最新版在线下载| 精品久久久久久久久久免费视频 | 国产黄a三级三级三级人| 自拍欧美九色日韩亚洲蝌蚪91| 色哟哟哟哟哟哟| 亚洲av熟女| 黄色毛片三级朝国网站| 亚洲精品久久成人aⅴ小说| 18禁黄网站禁片午夜丰满| 午夜两性在线视频| 国产伦人伦偷精品视频| 窝窝影院91人妻| 欧美黄色片欧美黄色片| 欧美中文日本在线观看视频| 12—13女人毛片做爰片一| 中亚洲国语对白在线视频| 韩国av一区二区三区四区| 国产一区二区三区综合在线观看| 精品日产1卡2卡| 一进一出抽搐gif免费好疼 | 国产熟女xx| 亚洲熟妇中文字幕五十中出 | 国产三级在线视频| 波多野结衣一区麻豆| 国产精品99久久99久久久不卡| 亚洲人成77777在线视频| 精品一区二区三区av网在线观看| 久久狼人影院| e午夜精品久久久久久久| 国产成人欧美| 这个男人来自地球电影免费观看| 欧美激情久久久久久爽电影 | 久久精品影院6| 正在播放国产对白刺激| 99re在线观看精品视频| 亚洲人成伊人成综合网2020| 丰满饥渴人妻一区二区三| 亚洲av熟女| 咕卡用的链子| 久久久水蜜桃国产精品网| 在线播放国产精品三级| 精品久久久久久,| 国产麻豆69| 一进一出抽搐gif免费好疼 | 女性被躁到高潮视频| 国产三级黄色录像| 欧美大码av| 精品人妻在线不人妻| 亚洲欧美精品综合久久99| 成人国产一区最新在线观看| 高清毛片免费观看视频网站 | 韩国精品一区二区三区| 高清毛片免费观看视频网站 | 久久人人精品亚洲av| 一进一出抽搐动态| 超碰97精品在线观看| 亚洲国产欧美一区二区综合| 日韩免费高清中文字幕av| 淫秽高清视频在线观看| 国产激情欧美一区二区| 亚洲久久久国产精品| 成人影院久久| 少妇被粗大的猛进出69影院| 成年女人毛片免费观看观看9| 欧美+亚洲+日韩+国产| 国产成人av教育| 女人被躁到高潮嗷嗷叫费观| 视频区图区小说| 亚洲 国产 在线| 黄色片一级片一级黄色片| 精品国产超薄肉色丝袜足j| 一级片免费观看大全| 日韩国内少妇激情av| 亚洲九九香蕉| 精品卡一卡二卡四卡免费| 欧美激情极品国产一区二区三区| 国产在线精品亚洲第一网站| 一区二区日韩欧美中文字幕| 色综合欧美亚洲国产小说| 村上凉子中文字幕在线| 国产麻豆69| 亚洲全国av大片| 欧美日韩一级在线毛片| 老汉色∧v一级毛片| 91国产中文字幕| 午夜两性在线视频| 18美女黄网站色大片免费观看| 9热在线视频观看99| 日日干狠狠操夜夜爽| 一本大道久久a久久精品| 黄色视频,在线免费观看| 一区二区三区国产精品乱码| 国产午夜精品久久久久久| 精品国产乱子伦一区二区三区| 久久天堂一区二区三区四区| 色尼玛亚洲综合影院| 麻豆国产av国片精品| 黄色成人免费大全| 夜夜爽天天搞| 欧美日韩精品网址| 一夜夜www| 99国产精品一区二区三区| 国产亚洲精品久久久久5区| 美国免费a级毛片| 国产精品av久久久久免费| 91在线观看av| 香蕉丝袜av| 高清欧美精品videossex| 中文字幕另类日韩欧美亚洲嫩草| 国产熟女xx| 亚洲七黄色美女视频| 美国免费a级毛片| 性色av乱码一区二区三区2| 热99国产精品久久久久久7| 久久精品国产亚洲av高清一级| 精品午夜福利视频在线观看一区| 亚洲国产毛片av蜜桃av| 狂野欧美激情性xxxx| 欧美在线黄色| 日韩欧美在线二视频| 午夜福利一区二区在线看| 国产人伦9x9x在线观看| 国产蜜桃级精品一区二区三区| 国内久久婷婷六月综合欲色啪| avwww免费| √禁漫天堂资源中文www| 欧美黑人精品巨大| 丰满人妻熟妇乱又伦精品不卡| 他把我摸到了高潮在线观看| 久久影院123| 国产精品一区二区三区四区久久 | www日本在线高清视频| 黄频高清免费视频| 国产免费男女视频| 最近最新中文字幕大全免费视频| 亚洲午夜精品一区,二区,三区|