牛致病性大腸桿菌菌影的制備

王士霞，常春龍，翟軍軍，倪宏波

（黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)，黑龍江 大慶 163319）

牛致病性大腸桿菌菌影的制備

王士霞，常春龍，翟軍軍，倪宏波*

（黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)，黑龍江 大慶 163319）

制備牛源大腸桿菌菌影，為其作為疫苗及載體奠定基礎(chǔ)。將裂解質(zhì)粒PHH43-E電轉(zhuǎn)入牛大腸桿菌中，并通過溫度的改變誘導(dǎo)細(xì)菌裂解，即其在37℃條件下生長(zhǎng)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，然后進(jìn)行42℃升溫誘導(dǎo)。經(jīng)溫控誘導(dǎo)裂解質(zhì)粒表達(dá)后可將細(xì)胞壁裂解，形成細(xì)菌空殼，成功制備了菌影。

牛；致病性大腸桿菌；菌影；制備

菌影（bacterial ghosts）又稱菌蛻，是無繁殖能力、缺乏細(xì)胞漿和核酸的細(xì)菌空殼，通過噬菌體PhiX174的裂解基因E在革蘭氏陰性菌內(nèi)表達(dá)而形成[1-3]。裂解基因E表達(dá)后，細(xì)菌的內(nèi)外膜融合形成跨膜孔道，在滲透壓的作用下，細(xì)菌基因組和胞漿等內(nèi)容物通過跨膜孔道排出，留下細(xì)菌空殼，即形成一種空的“菌影”[4-5]。菌蛻完好地保留了菌體表面的各種抗原的天然結(jié)構(gòu)和粘附活性，可以類似活菌體誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生良好的免疫保護(hù)反應(yīng)[6-7]，此外，研究表明菌影還具有極好的載體和佐劑功能[8]，目前，裂解基因E誘導(dǎo)制備菌影的技術(shù)已經(jīng)廣泛用于多種革蘭氏陰性菌菌影的制備[9-10]。

成功制備菌蛻的關(guān)鍵是噬菌體phiX174的裂解基因E在宿主細(xì)胞內(nèi)的高效表達(dá)。目前的表達(dá)系統(tǒng)有：溫度敏感型λpL/pR-cI857啟動(dòng)子/阻遏子系統(tǒng)、化學(xué)誘導(dǎo)型LacpO-LacIq啟動(dòng)子/阻遏子系統(tǒng)、Pm-xylS啟動(dòng)子/阻遏子系統(tǒng)或者tol表達(dá)系統(tǒng)。目前應(yīng)用最多的是λpL/pR-cI857啟動(dòng)子/阻遏子表達(dá)系統(tǒng)。

本試驗(yàn)擬利用λpL/pR-cI857啟動(dòng)阻遏系統(tǒng)，通過改變溫度調(diào)控裂解基因E的表達(dá)，來制備制備致病性大腸桿菌菌影，為進(jìn)一步研制和開發(fā)大腸桿菌新型疫苗及新型佐劑進(jìn)行前期的探索。

1 材料與方法

1.1材料裂解質(zhì)粒pHH43-E質(zhì)粒由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所細(xì)菌室惠贈(zèng)；牛源致病性大腸桿菌為本實(shí)驗(yàn)室分離并保存；Taq DNA聚合酶購(gòu)自美國(guó)Fermentas公司；DL2000 DNA marker購(gòu)自Takara（大連）公司；氯霉素購(gòu)自Sigma公司。

1.2方法

1.2.1 大腸桿菌感受態(tài)的制備 按照文獻(xiàn)[11]，-80℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 質(zhì)粒的電轉(zhuǎn)及鑒定 將1.2.1制備的感受態(tài)細(xì)胞從-80℃冰箱中取出置冰上待融化后加入1 μL的裂解質(zhì)粒pHH43-E，按照常規(guī)電轉(zhuǎn)的方法進(jìn)行電轉(zhuǎn)，參數(shù)為12.5 kV/cm、200 Ω、25μF、4.9 ms。將電轉(zhuǎn)后的質(zhì)粒搖菌并涂板，放置37℃溫箱過夜培養(yǎng)。第2天挑取單菌落進(jìn)行37℃搖菌，并進(jìn)行菌液PCR鑒定。

1.2.3 裂解條件的優(yōu)化 在5 mL含34 μg/mL氯霉素的LB培養(yǎng)液中接種含裂解質(zhì)粒的菌株，37℃過夜震蕩培養(yǎng)。轉(zhuǎn)接后37℃培養(yǎng)至OD600值分別為0.4、0.6、0.8、1.0、1.2。然后升溫至42℃誘導(dǎo)表達(dá)。每隔15 min取樣測(cè)定OD600值，直至培養(yǎng)物的OD600值不再下降為止。同時(shí)取適量菌液，用無菌PBS稀釋適當(dāng)倍數(shù)后涂板進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)（每板涂100 μL菌液）。

1.2.4 菌體裂解率的計(jì)算 取誘導(dǎo)之前100 μL的菌液和誘導(dǎo)之后的100 μL菌液分別稀釋合適倍數(shù)，涂布于含有氯霉素的LB平板，37℃過夜培養(yǎng)，計(jì)算活菌數(shù)。

裂解率（%）＝（1-誘導(dǎo)后CFU/誘導(dǎo)前CFU）×100%

2 結(jié)果

2.1溶菌質(zhì)粒的鑒定以電轉(zhuǎn)化后的單菌落的過夜培養(yǎng)物為模板進(jìn)行菌液PCR鑒定，結(jié)果如圖1所示，在1 429 bp處有一條特異性條帶，與預(yù)期相符。

圖1 裂解質(zhì)粒PHH43-E成功轉(zhuǎn)入大腸桿菌結(jié)果圖Fig.1 Plasmid PHH43-E was successfully transferred to E.coli results map

2.2不同初始濃度誘導(dǎo)下的裂解情況觀察42℃誘導(dǎo)后，裂解情況觀察結(jié)果，與對(duì)照組相比，0.4和0.6時(shí)，差別最明顯，因此，0.4和0.6時(shí)，裂解效果好。

2.3不同起始濃度裂解曲線分別對(duì)起始濃度為0.4、0.6、0.8、1.0和1.2時(shí)其進(jìn)行了裂解曲線的繪制，但因試驗(yàn)中起始濃度為0.8、1.0和1.2的裂解效果不是很好，所以只對(duì)起始濃度為0.4和0.6的裂解曲線進(jìn)行了分析，由圖3可看出，當(dāng)初始濃度為0.6時(shí)，該曲線較為平穩(wěn)，且OD值也較低，菌落數(shù)較少。因此，起始濃度為0.6時(shí)為最佳起始濃度。

2.4 裂解率計(jì)算結(jié)果將升溫誘導(dǎo)之前和誘導(dǎo)結(jié)束后2～3 h的菌液分別用無菌PBS進(jìn)行105和103倍稀釋，重復(fù)3次試驗(yàn)后取平均數(shù)，37℃恒溫箱培養(yǎng)24 h，分別計(jì)算誘導(dǎo)前細(xì)菌數(shù)和誘導(dǎo)后菌液濃度。

裂解率=1-5.8×103/5.2×106=99.89%

3 分析與討論

本試驗(yàn)將pHH43-E裂解質(zhì)粒成功轉(zhuǎn)入大腸桿菌中，含有裂解質(zhì)粒的大腸桿菌在37℃條件下培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后，升溫誘導(dǎo)制備大腸桿菌菌影。升溫誘導(dǎo)15 min后OD600值達(dá)到最高之后下降，在誘導(dǎo)60 min后OD600值下降到最低，同時(shí)菌液最為澄清，并穩(wěn)定持續(xù)60 min不再變化。

圖2 不同初始濃度誘導(dǎo)下的裂解結(jié)果Fig.2 Under different initial concentration induced cracking results

圖3 裂解曲線的繪制結(jié)果Fig.3 Plot results of pyrolysis curve

將不同起始濃度的菌液同時(shí)進(jìn)行升溫誘導(dǎo)，對(duì)比其裂解是否有差異，篩選出裂解效率最高的起始濃度。結(jié)果顯示，菌液起始濃度OD600值為0.4或0.6左右時(shí)升溫誘導(dǎo)，其裂解效率要明顯高于起始濃度OD600為0.8、1.0和1.2時(shí)的裂解效率。雖然起始濃度OD600值為0.4和0.6時(shí)的裂解效率相近，但是由于菌液起始濃度為0.6時(shí)，OD600值較為平穩(wěn)，因此，本試驗(yàn)選擇菌液濃度為0.6作為起始菌液誘導(dǎo)濃度。

本試驗(yàn)中采用的裂解系統(tǒng)為目前應(yīng)用最多λpL/ pR-cI857溫控表達(dá)系統(tǒng)。最初的λpL/pR-cI857系統(tǒng)在溫度低于30℃時(shí)，阻遏蛋白cI857的表達(dá)使基因E被穩(wěn)定抑制；溫度高于30℃時(shí)，阻遏蛋白cI857熱失活，導(dǎo)致基因E表達(dá)；在42℃時(shí)，細(xì)菌裂解達(dá)到最佳狀態(tài)。由于30℃時(shí)培養(yǎng)細(xì)菌不利于菌體的大量繁殖，同時(shí)，當(dāng)溫度由30℃向42℃轉(zhuǎn)變時(shí)，熱沖擊會(huì)對(duì)細(xì)胞表面的抗原決定簇產(chǎn)生影響，因此，通過基因定點(diǎn)突變技術(shù)，使λpL/pR啟動(dòng)子的操縱基因OR2中的一個(gè)堿基由T誘變?yōu)镃，突變后在37℃下也能穩(wěn)定抑制基因E的表達(dá)，經(jīng)此改造后，該溫控表達(dá)表達(dá)系統(tǒng)的熱穩(wěn)定性大大提高[12]，這對(duì)細(xì)菌菌影的制備提供了便利條件。

在菌影制備過程中，100%的完全裂解往往不易實(shí)現(xiàn)，為了達(dá)到完全滅活，筆者采用凍干法將制備的菌影凍干兩次，每次置于凍干機(jī)中凍干12 h，經(jīng)過檢測(cè)細(xì)菌已被完全滅活，其原因可能是細(xì)菌在凍干的過程中會(huì)有一部分活菌死亡，在不加保護(hù)劑的情況下死亡的細(xì)菌數(shù)量會(huì)更多，而且菌影中存留的活菌數(shù)量本身很低，導(dǎo)致菌影在凍干過程中存留的少量活菌被全部滅活，但是在此過程中，菌體可能由于反復(fù)凍融可能受到破壞，導(dǎo)致其免疫原性降低。因此提高菌影的打孔效率將是今后研究的重點(diǎn)。

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The Preparation of bovine pathogenic Escherichia coli Ghosts

Wang Shixia,Chang Chunlong,Zhai Junjun,Ni Hongbo*
(Heilongjiang Bayi Agricultural University,Heilongjiang Daqing 163319)

Preparation bovine E.coli bacterial ghost,the as carrier vaccine and lay the foundation.The cleavage of plasmid PHH43-E electro transformed into bovine Escherichia coli,and by the change of temperature induced bacterial lysis,namely the at 37℃ for growth to logarithmic growth phase,then 42℃ for heat induced.The temperature induced cleavage of plasmid expression can be the cell wall lysis,forming bacteria ghosts,that were prepared bacterial ghosts successfully.

Cattle;Pathogenic Escherichia coli;Bacterial shadow;Preparation

S852.61 < class="emphasis_bold"> 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：B

B

1672-9692(2016)08-0006-04

2016-07-01

王士霞（1990-），女，黑龍江人，在讀碩士，研究方向?yàn)榉肿蛹?xì)菌學(xué)與免疫學(xué)。

倪宏波（1972-），男，黑龍江人，教授，博士生導(dǎo)師，主要從事分子細(xì)菌學(xué)和免疫學(xué)研究。