一種去除豬圓環(huán)病毒中支原體污染的方法

張雅會(huì)，李少麗，李艷麗

（1.中央農(nóng)業(yè)廣播電視學(xué)校唐山分校，河北 唐山 063000；2.杭州薦量獸用生物制品有限公司，浙江 杭州 310018）

一種去除豬圓環(huán)病毒中支原體污染的方法

張雅會(huì)1，李少麗2*，李艷麗2

（1.中央農(nóng)業(yè)廣播電視學(xué)校唐山分校，河北 唐山 063000；2.杭州薦量獸用生物制品有限公司，浙江 杭州 310018）

針對(duì)目前病毒中普遍存在支原體污染的現(xiàn)狀，本研究擬采用一種聯(lián)合過(guò)濾和用Plasmocin兩種方法，去除PCV2病毒中的支原體。PCV2病毒處理后，套式PCR檢測(cè)處理病毒樣品為陰性，同時(shí)進(jìn)行IFA檢測(cè)，其效價(jià)仍能達(dá)107.3TCID50/mL以上。結(jié)果表明，采用這種聯(lián)合的方法在保證病毒效價(jià)不降低的情況下，徹底去除了PCV2病毒中污染的支原體，為同行關(guān)于去除病毒中污染的支原體提供了一種參考方法。

PCV2；支原體

在我國(guó)現(xiàn)階段，疫苗免疫被認(rèn)為是防控動(dòng)物疫病的有效手段，這些疫苗中絕大部分為病毒類疫苗，病毒類疫苗的制備一般均需先分離病毒，而在采集病料分離病毒及病毒傳代的過(guò)程中常因環(huán)境、使用器材污染等因素的影響，導(dǎo)致病毒被支原體污染。

支原體是一類缺乏細(xì)胞壁的原核細(xì)胞型微生物，大小一般在0.3～0.5 μm之間，呈高度多形性，有球形、桿形、絲狀、分枝狀等多種形態(tài)[1]，支原體約有1%可通過(guò)濾菌器。商品化的支原體抗生素Plasmocin主要用于治療或預(yù)防細(xì)胞培養(yǎng)中支原體的污染，使用推薦濃度5倍的高濃度Plasmocin處理細(xì)胞，雖未觀察到藥物對(duì)細(xì)胞新陳代謝的副作用，但據(jù)檢測(cè)，若在繁殖病毒的過(guò)程中，細(xì)胞培養(yǎng)液中反復(fù)加入Plasmocin，則會(huì)使病毒效價(jià)降低。

本研究以污染支原體的豬圓環(huán)病毒（Porcine circovirus type 2，PCV2）為例，研究出一種聯(lián)合過(guò)濾和用抗生素兩種途徑去除病毒中支原體的方法。

1 材料

PCV2病毒由杭州薦量獸用生物制品實(shí)驗(yàn)室保存；胎牛血清購(gòu)自Hyclone；MEM培養(yǎng)基購(gòu)自GIBCO；Plasmocin購(gòu)自Invivogen；0.1 μm濾菌器購(gòu)自Milliple，細(xì)胞培養(yǎng)瓶、細(xì)胞培養(yǎng)板均購(gòu)自Corning。

2 方法

2.10.1 μm濾器過(guò)濾PPCV2并連續(xù)繁殖四代用含5%胎牛血清的MEM培養(yǎng)PK-15細(xì)胞，細(xì)胞密度為2× 105個(gè)/mL。將PCV2用0.1 μm濾器過(guò)濾后，向MEM中接種PCV2，使PCV2接種量為MEM體積的1%，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱，培養(yǎng)72 h。之后反復(fù)凍融3次，得到PCV2懸液。

以得到的病毒懸液為種毒，重復(fù)步驟2.1操作3次，得到第四代繁殖的病毒懸液。

2.2PCV2用終濃度2.5 μgg//mmLL的Plasmocin處理兩代用含5%胎牛血清的MEM培養(yǎng)PK-15細(xì)胞，細(xì)胞密度2×105個(gè)/mL，再向MEM中接種上述步驟中最終得到的PCV2，使PCV2接種量為MEM體積的1%，并向MEM中加入Plasmocin至終濃度2.5 μg/mL，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱，培養(yǎng)72～96 h；細(xì)胞鋪滿后，將細(xì)胞瓶反復(fù)凍融3次，得到PCV2懸液；

重復(fù)步驟2.2操作1次，得到第六代繁殖的病毒懸液。

2.3常規(guī)繁殖PPCV2兩代用含5%胎牛血清的MEM培養(yǎng)PK-15細(xì)胞，細(xì)胞密度2×105個(gè)/mL，再向MEM中接種步驟2.2最終制得的PCV2，使PCV2接種量為MEM體積的1%，置于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱，培養(yǎng)72 h；將培養(yǎng)后的細(xì)胞瓶取出后，反復(fù)進(jìn)行3次凍融，得到細(xì)胞瓶中凍融好的PCV2懸液；

重復(fù)步驟2.3操作1次，即制得第八代所需的PCV2懸液。

2.4PCV2中支原體的檢測(cè)參考豬支原體基因序列（Genbank，NR-103095.1），采用DNAMAN軟件設(shè)計(jì)兩對(duì)上下游引物：P1：AAGTCGTAACAACCTATCCCTA，P2：GTGTCTGGTTAGTATTTAGCCTTA；P3：GCAAGTCGATGAAGGACG，P4：GCTTCGCTCGCCACTACT，采用套式PCR法，以步驟2.3最終制得的PCV2為樣品模板，并設(shè)滅菌雙蒸水為陰性對(duì)照，豬滑液囊支原體為陽(yáng)性對(duì)照，先用P1和P2引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將其擴(kuò)增產(chǎn)物作為PCR反應(yīng)模板，再用P3和P4引物擴(kuò)增目的基因片段。第2次PCR反應(yīng)條件為94℃ 3 min，94℃1 min，56℃ 1 min，68℃ 1 min，共30 cycle，第2次PCR反應(yīng)條件為94℃ 3 min，94℃ 1 min， 58℃ 30 s，68℃ 30 s，共30 cycle。PCR反應(yīng)體系均為dNTP 4 μL，PCR Buffer 5 μL，P1和P2（P3和P4）均為1 μL，rTaq酶1 μL，模板1 μL，滅菌水37 μL，共50 μL體系。第2次PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)支原體。

2.5PCV2 TCID50的測(cè)定先將PK-15細(xì)胞用MEM稀釋成2×105個(gè)/mL的細(xì)胞懸液，細(xì)胞懸液加入到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔100 μL，再將步驟2.3最終制得的PCV2 10倍梯度稀釋，選擇10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7共6個(gè)梯度，每孔100 μL加到細(xì)胞懸液中，每個(gè)梯度重復(fù)6個(gè)孔，同時(shí)，設(shè)MEM培養(yǎng)液作陰性對(duì)照、107.3TCID50/mL的PCV2作陽(yáng)性對(duì)照，陰性、陽(yáng)性對(duì)照各1孔，然后將細(xì)胞培養(yǎng)板置于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)72 h。

培養(yǎng)結(jié)束后，取出細(xì)胞培養(yǎng)板并棄掉細(xì)胞培養(yǎng)板中的液體，每孔加入100 μL冷的甲醇-丙酮固定液（甲醇和丙酮體積比1:1），-20℃固定30 min，棄固定液，再用pH 7.4的PBST洗滌1次細(xì)胞培養(yǎng)板后甩干。

將鼠源Cap蛋白單克隆抗體用PBS進(jìn)行1:2 000倍稀釋，100 μL/孔加入到甩干的細(xì)胞培養(yǎng)板中，將細(xì)胞培養(yǎng)板在37℃搖床孵育60 min，棄細(xì)胞培養(yǎng)板中液體，再用pH7.4的PBST洗滌3次細(xì)胞培養(yǎng)板后甩干。

將FITC-羊抗鼠二抗用PBS進(jìn)行1:200倍稀釋，100 μL/孔加入到甩干的細(xì)胞培養(yǎng)板中，錫箔紙包裹細(xì)胞培養(yǎng)板避光，將細(xì)胞培養(yǎng)板在37℃搖床孵育60 min，棄細(xì)胞培養(yǎng)板中液體，再用pH 7.4的PBST洗滌3次細(xì)胞培養(yǎng)板后甩干。

將甩干的細(xì)胞培養(yǎng)板于倒置熒光顯微鏡下觀察，按Reed和Muench法計(jì)算PCV2效價(jià)。

3 結(jié)果

3.1PCV2中支原體的檢測(cè)用濾菌器和Plasmocin處理過(guò)的PCV2 PCR檢測(cè)不到支原體，而未處理的PCV2則檢測(cè)出目的條帶，陰性對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照均成立，見(jiàn)圖1。

3.2PCV2病毒TCID50的測(cè)定從各梯度的熒光效果看，用濾菌器和Plasmocin處理過(guò)的PCV2比未處理過(guò)的PCV2熒光強(qiáng)度好，且處理過(guò)的PCV2病毒效價(jià)仍能維持在107.3TCID50/mL以上（見(jiàn)圖2，顯微鏡放大倍率為10×10）。

圖1 PCV2支原體檢測(cè)Fig.1 mycoplasma detection of PCV2

圖2 PCV2的TCID50測(cè)定Fig.2 TCID50detection of PCV2

4 討論

在細(xì)胞培養(yǎng)或在利用培養(yǎng)的細(xì)胞繁殖病毒的過(guò)程中，細(xì)胞或病毒被支原體污染是世界性的問(wèn)題，支原體的污染來(lái)源常包括工作環(huán)境的污染、操作者本身的污染、試驗(yàn)器材的污染以及用污染支原體的細(xì)胞繁殖病毒。為獲得無(wú)支原體污染的疫苗種毒或研究用病毒，以保證疫苗的純凈性和試驗(yàn)結(jié)果的可靠性，本試驗(yàn)聯(lián)合0.1 μm的濾菌器和Plasmocin兩種方法快速、徹底清除了PCV2中污染的支原體，且未影響到PCV2的病毒效價(jià)，為同行關(guān)于去除病毒中支原體的問(wèn)題提供了一種參考方法。

Eliminate the mycoplasma in PCV2

Zhang Yahui1,Li Shaoli2*,Li Yanli2
(1.The central agricultural broadcasting and television school of tangshan branch,Hebei Tangshan 063000；2.Hangzhou Jianliang Veterinary Biological Preparations Co．Ltd,Zhejiang Hangzhou 310018)

Since the mycoplasma common contaminate in virus,To eliminate mycoplasma in PCV2, the research adopted a combined filtering and plasmocin two methods.PCR detection of PCV2 virus after processing,the results were negative,at the sametime detection of IFA,its titer can reached more than 107.3TCID50/mL.The results showed that the method using the joint in the case thoroughly eliminate the contaminated mycoplasma in PCV2 without lowing the titer of virus，and this case can provide a reference for peers about mycoplasma removal in virus.

PCV2;Mycoplasma

S852.62 < class="emphasis_bold"> 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：B

B

1672-9692(2016)08-0042-03

2016-06-28

張雅會(huì)（1984-），女，本科，獸醫(yī)師，主要從事動(dòng)物類產(chǎn)品監(jiān)測(cè)研究。

李少麗（1983-），女，在職博士，獸醫(yī)師，主要從事動(dòng)物疫苗的開(kāi)發(fā)與檢測(cè)。