• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    豬圓環(huán)病毒病PCR檢測方法的建立與應(yīng)用

    2017-01-05 05:24:48師麗剛
    現(xiàn)代畜牧獸醫(yī) 2016年8期
    關(guān)鍵詞:圓環(huán)特異性引物

    師麗剛

    (河南省洛陽市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心,河南 洛陽 471002)

    豬圓環(huán)病毒病PCR檢測方法的建立與應(yīng)用

    師麗剛

    (河南省洛陽市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心,河南 洛陽 471002)

    根據(jù)豬圓環(huán)病毒2型(PCV2)基因(Rep基因)保守序列設(shè)計(jì)1對引物P1和P2,擴(kuò)增700 bp的目的片段,該方法對豬細(xì)小病毒、豬瘟病毒、豬偽狂犬病毒均成陰性,但可以特異地檢測出PCV2;本法能檢測出1.80 ng/μL圓環(huán)病毒的DNA。對擴(kuò)增目的片段測序,結(jié)果顯示,擴(kuò)增片段屬于PCV2。應(yīng)用本方法對14份臨床樣本進(jìn)行檢測,結(jié)果表明,陽性樣本為6份。本研究結(jié)果表明,本試驗(yàn)建立的PCR方法檢測PCV2具有較好的敏感性和特異性,可用于PCV2感染疑似病例的診斷及分子流行病學(xué)調(diào)查。

    豬圓環(huán)病毒2型;PCR;檢測

    豬圓環(huán)病毒2型屬于圓環(huán)病毒屬,是已知最小的動(dòng)物病毒,PCV2基因組全長1 7681 768 bp[1]。PCV2的宿主主要是豬,各種年齡階段的豬均可以感染,而仔豬發(fā)病較嚴(yán)重,6~12周比較常見。1998年由于斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征作為新的疾病出現(xiàn)而發(fā)現(xiàn)了PCV2[2-3],加拿大早在1990年已經(jīng)發(fā)生這種疾病。早在1962年就已用PCR檢測該病毒,PCV2疾病診斷標(biāo)準(zhǔn)在1985年已開始在豬群中執(zhí)行[4]。中國在2000年第一次報(bào)道本病,而郎洪武等搜集了來自北京、河北等7個(gè)省市22個(gè)豬場的559份血清,并用ELISA方法檢測陽性率高達(dá)42.9%,而且斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征(PMWS)抗體陽性隨著豬的年齡增長而升高。目前,本病在世界范圍內(nèi)廣泛流行,死亡率10%~30%不等[5]。

    分析全球的不同PCV2的序列,核酸序列的一致性高達(dá)93%以上[6]。根據(jù)3.5%核酸序列的不同PCV2的序列,將PCV2分為PCV2a和PCV2b基因亞型[7]。在1980年來自Denmark報(bào)道了第三個(gè)基因亞型,命名為PCV2d[8],還有一些數(shù)據(jù)表明存在第五個(gè)基因亞型[9]。PCV2可引起斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征、豬皮炎腎病綜合征、增生性壞死性肺炎等多種疾病[10],其中以斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征最常見。由PCV2引起的疾病嚴(yán)重制約了我國養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展,流行病學(xué)調(diào)查研究結(jié)果顯示,PCV2感染廣泛存在國內(nèi)外豬群中,而且由于PCV2感染及與其他病原體感染造成臨床癥狀和病理變化的多樣性和復(fù)雜性,給PCV2感染的臨床診斷增加了難度[11]。目前PCV2的傳統(tǒng)檢測方法有病毒分離免疫熒光試驗(yàn)、免疫組化法和酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)等[12]。費(fèi)時(shí)長、檢測靈敏度較低、準(zhǔn)確性差、成本高、特異性低是這些方法共有的缺點(diǎn),尤其不能檢測亞臨床感染的豬,嚴(yán)重制約著豬業(yè)的發(fā)展。而分子生物學(xué)檢測方法則以檢測速度快、靈敏度高、特異性好等特點(diǎn)迅速占領(lǐng)市場,具有良好的前景。因此,建立一種既敏感又特異的檢測PCV2的方法顯得尤為重要,該方法的建立將有助于進(jìn)行PCV2病毒的檢測。由于目前對圓環(huán)病毒引起的相關(guān)疾病尚無有效的治療措施,而該方法可以及時(shí)發(fā)現(xiàn)亞臨床癥狀的豬,以便對疾病的控制。

    1.1病毒感染豬圓環(huán)病毒(PCV)、豬細(xì)小病毒(PPV)、副豬嗜血桿菌(HP)、豬偽狂犬病毒(PRV)均由洛陽市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心實(shí)驗(yàn)室分離、鑒別并保存。

    1.2主要試劑和主要儀器設(shè)備主要試劑:Ex Taq(5 U/μL)購自TaKaRa公司,2×Taq Mix Master(含染料)購自上海萊楓科技有限公司,病毒基因組DNA提取試劑盒購自生工生物工程(上海)有限公司,引物由上海生物工程有限公司合成,DL2000 DNA Marker購自TaKaRa公司,4 s Red Plus Nucleic Acid stain購自TaKaRa公司,瓊脂糖購自BIOWEST公司。

    1.3引物的設(shè)計(jì)與合成根據(jù)GenBank中PCV(2登錄號(hào)為EF524532 PCV2)設(shè)計(jì)引物由上海生物工程有限公司合成,引物序列:上游引物P1:5、-TTGCTGAGCCTAGCGACACC-3、,下游引物P2:5、-TCGATCACACAGTCTCAGTAG-3、。預(yù)計(jì)擴(kuò)增目的片段為700 bp。

    1.4病毒基因組DDNNAA的提取按照病毒基因組DNA抽提試劑盒進(jìn)行操作,提取的DNA保存在-20℃?zhèn)溆谩?/p>

    1.5PPCCRR反應(yīng)

    1.5.1 PCR擴(kuò)增反應(yīng) PCR反應(yīng)在50 μL反應(yīng)體系中進(jìn)行,引物Forward Primer 1 μL,Reverse Primer 1 μL,DNA模板各1 μL,Mix 25 μL,

    1 材料與方法

    H2O 22 μL。反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性5 min;95℃變性30 s,55℃退火30 s,72℃延伸30 s,30個(gè)循環(huán),最后72℃延伸10 min,4℃保存。取5 μL PCR擴(kuò)增產(chǎn)物于1%瓊脂糖凝膠電泳中進(jìn)行電泳測定,觀察結(jié)果。

    1.5.2 PCR反應(yīng)條件的優(yōu)化

    1.5.2.1 最適模板用量的確立 分別取0.5、0.8、1、2、3、4、5、6 μL DNA模板,進(jìn)行PCR反應(yīng),以確定最適的模板用量。

    1.5.2.2 最適引物用量的確立 分別取不同用量的引物在50 μL的反應(yīng)體系中,上、下游引物各加入0.1、0.3、0.5、0.7、1.0、1.2 μL進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng),以確定最適的引物用量。

    1.5.2.3 最適退火溫度的確立 分別設(shè)51、53、55、57、59℃進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng),以確定最適的退火溫度。

    1.6PCR特異性試驗(yàn)以陽性病料提取PCV2的DNA、PPV、HP和PRV疫苗株中提取DNA,用已建立好的方法進(jìn)行擴(kuò)增,與其他疾病比較,來驗(yàn)證該方法的特異性。

    1.7PCR敏感性試驗(yàn)將提取的DNA用蛋白質(zhì)核酸測定儀測定核酸濃度為180 ng/μL,將DNA進(jìn)行10倍系列稀釋1~8孔。

    1.8臨床應(yīng)用用建立優(yōu)化的PCR檢測方法,對臨床送檢的14份疑似病料先提取DNA,對PCR陽性可增產(chǎn)物進(jìn)行測序。

    2 結(jié)果與分析

    2.1擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測及鑒定取5 μL PCR擴(kuò)增產(chǎn)物加入到1%瓊脂糖凝膠電泳中,電泳結(jié)果顯示該P(yáng)CR體系可以擴(kuò)增出一條約為700 bp的豬圓環(huán)病毒2型的基因片段(圖1),與預(yù)期大小相符合。

    2.2特異性試驗(yàn)結(jié)果利用設(shè)計(jì)的引物對豬圓環(huán)病毒2型擴(kuò)增出了700 bp的目的基因片段,而PPV、CSFV和PRV均未擴(kuò)增出目的片段(圖2)。

    2.3敏感性試驗(yàn)結(jié)果將模板DNA經(jīng)10倍系列稀釋后分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳,在濃度180×10-2ng/μL時(shí)仍出現(xiàn)目的片段,而在濃度180×10-3ng/μL時(shí)不出現(xiàn)目的片段,可檢測出濃度1.80 ng/μL的模板,結(jié)果見圖3。

    2.4臨床應(yīng)用應(yīng)用本方法建立的豬圓環(huán)病毒2型PCR方法檢測了14份在不同地方采集的豬組織病料。結(jié)果顯示陽性樣品6份(圖4),將陽性樣品的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物切膠、純化、克隆、測序,證明是豬圓環(huán)病毒2型。同時(shí)應(yīng)用市場現(xiàn)有試劑盒進(jìn)行驗(yàn)證,符合率為100%。

    圖1 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物凝膠電泳圖Fig.1 Agarose gel electrophoresis of the PCR products

    圖2 PCR特異性試驗(yàn)結(jié)果Fig.2 The specific test results of PCR

    3 討論與結(jié)論

    PCV2感染不僅可引起豬皮炎腎病綜合征(porcine dermatitis andnephropathy syndrome,PDNS)、斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征(post-weaning multisystem wasting syndrome,PMWS)、增生性壞死性肺炎(porcine proliferative and necrotizing pneumonia,PNP)、豬繁殖與呼吸綜合征以及仔豬傳染性先天震顫等多種疾病,而且PCV2感染機(jī)體后侵害宿主免疫系統(tǒng),并引起病豬免疫抑制,所以更易與其他病原發(fā)生混合感染或繼發(fā)感染,進(jìn)一步加劇了當(dāng)前豬病的復(fù)雜性,包括其他病毒、細(xì)菌、寄生蟲及其他重大動(dòng)物傳染病[13-14]。而且引起疫苗效力的下降,給國內(nèi)外養(yǎng)豬業(yè)造成很大的經(jīng)濟(jì)損失,因此,為了給養(yǎng)豬業(yè)健康發(fā)展提供重要保障,必須防止豬群中的PCV2感染。目前針對PCV2的血清學(xué)技術(shù)大多數(shù)都是檢測PCV2抗體的總量,不能決定抗體中和能力。試驗(yàn)表明即便在PCV2抗體高滴度情況下,PCV2也能持續(xù)存在于組織中[15-18]。因此,為了給PCV2相關(guān)疾病的防控提供技術(shù)保障,減少由于PCV2對豬場造成的經(jīng)濟(jì)損失,有必要建立一種更加有效且方便的的PCV2檢測方法。血清學(xué)試驗(yàn)只能檢測抗體而無法判斷是否存在PCV2,而本研究這可以很好的避免血清學(xué)存在的弊端。然而,在實(shí)際應(yīng)用時(shí)更應(yīng)該結(jié)合組織病變、臨床癥狀和流行病學(xué)等輔助手段進(jìn)行綜合診斷,盡可能地避免本研究建立的PCR方法出現(xiàn)假陽性結(jié)果的情況。相對于目前我國常用的免疫熒光試驗(yàn)和免疫組化法以及酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)等方法,而快速、敏感、準(zhǔn)確、特異性高等是PCR檢測技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)。但是,很多試驗(yàn)因素影響著PCR檢測方法,比如,DNA的純度及電泳時(shí)的用量、引物的特異性、退火的溫度、病料的采取及保存等都會(huì)影響試驗(yàn)的結(jié)果。但最重要的還是試驗(yàn)中所設(shè)計(jì)引物的敏感性和特異性,快速有效地檢測必須要有較高敏感性和特異性的引物。所以本研究首先針對PCR擴(kuò)增反應(yīng)的條件進(jìn)行優(yōu)化,以保證整個(gè)反應(yīng)準(zhǔn)確高效進(jìn)行,減低非特異性反應(yīng),提高整個(gè)試驗(yàn)的準(zhǔn)確性和敏感性。

    圖3 PCR敏感性試驗(yàn)結(jié)果Fig.3 The sensitivity test results of PCR

    圖4 臨床樣品的檢測結(jié)果Fig.4 Detection results of Clinical samples

    本研究通過優(yōu)化建立的PCR檢測方法,僅對于PCV2可以擴(kuò)增700 bp的目的片段,而其他中的病毒無法擴(kuò)增出目的片段,因此可以說明選取的病料、DNA的提取、設(shè)計(jì)的引物、PCR擴(kuò)增反應(yīng)的條件、瓊脂糖凝膠電泳優(yōu)化參數(shù)均合理;本方法對PPV、CSFV、PRV的檢測結(jié)果均為陰性,只對PCV2能擴(kuò)增出700 bp的特異性片段,故可以說明其具有良好的特異性;同時(shí)建立的PCR檢測方法的穩(wěn)定性和重復(fù)性好。該研究操作時(shí)間短,試驗(yàn)程序較為簡便、容易操作而且價(jià)格低廉,為PCV2的診斷和流行病學(xué)的研究提供了一種簡便而且有效的實(shí)驗(yàn)室檢測方法。

    [1]蔣成硯,謝昆,田婷.豬圓環(huán)病毒2型PCR檢測方法的建立與應(yīng)用[J].黑龍江畜牧獸醫(yī),2012,12:83-85.

    [2]Hamel AL,Lin LL,Nayar GP.Nucleotide sequence of porcine circovirus associated with postweaning multisystemic wasting syndrome in pigs[J].Virol,1998,72:5262-5267.

    [3]Clark EG.Post-weaning multisystemic wasting syndrome[J]. Gen virol, 1998, 79(9): 2171-2179.

    [4]Jacobsen B,Kruegar L,Seeliger F,et al.Retrospectivestudyontheoccurrenceofporcine circovirus 2 infection and associated entities in Northern Germany[J].Veterinary Microbiogy,2009,138:27-33.

    [5]劉健,曹火仁,周錦萍,等.豬圓環(huán)病毒2型PCR檢測方法的建立及其在臨床檢測中應(yīng)用[J].中國畜牧獸醫(yī),2010,37(7):64-66.

    [6]Mankertz A,Domingo M,Folch JM,et al.Characterisation of PCV-2 isolates from Spian, Germany and France[J].virus Research,2000, 66:65-77.

    [7] Segales J, Olvera A, Grau-Roma L, et al. PCV-2 genotype definition and nomenclature [J].Vet Record,2008,162(26):867-868.

    [8]Guo LJ,Lu Yu,Wei YW,et al.Porcine circocvirus type2(PCV2):Genetic variation and newly emerging genotypes in China[J]. Virol, 2010,7:56-64.

    [9]Novosel D,Tuboly,Csagola A,et al.Origin of porcine circovirus type 2(PCV2)from swine affected by PCV2-associated diseases in Croatia[J].Vet Record,2014,174(17):431.

    [10]郭曉秋,曲哲會(huì),劉濤.豬偽狂犬病病毒和豬圓環(huán)病毒2型多重PCR檢測方法的建立與初步應(yīng)用[J].中國獸醫(yī)雜志,2015,51(10):34-37.

    [11]鄭玉姝,趙樸,劉俊偉,等.豬圓環(huán)病毒2型PCR檢測方法的建立及應(yīng)用[J].中國畜牧獸醫(yī),2010,37(8):66-68.

    [12]李天芝,于新友,沈志強(qiáng).豬圓環(huán)病毒2型分子生物學(xué)檢測方法的研究進(jìn)程[J].養(yǎng)豬,2015,3:117-120.

    [13]Allan G M,Phenix K V,Todd D.Some biological and physicochemical properties of porcine circovirus[J].Israel Journal of Veterinary Medicine,1994,41:17-26.

    [14]Allan G M,Mc Neilly F,Meehan B M.Isolation and characterisation of circoviruses from pigs with wasting syndromes in Spain, Denmark and Noryhern Ireland[J].Veterinary Microbiology,1999,66(2):115-123.

    [15]Rodríguez-Arrioja GM,Segalés J,Calsamiglia M, et al. Dynamics of porcine circovirus type 2 infection in herd of pigs with postweaning multisystemic wasting syndrome [J]. American Journal of Veterinary Research, 2002,63:354-357.

    [16]Larochelle R,Magar R,D,Allaire S.Comparative serologic and virologic study of commercial swine herds with and without postweaning multisystemic wasting syndrome[J].Canadian Journal of Veterinary, 2003, 67: 114-120.

    [17]Sibila M,Calsamiglia M,Segalés J,et al. Use of a polymerase chain reaction assay and ELISA to monitor porcine circovirus type 2 infection in pigs from farms with and without postweaning multisystemic wasting syndrome[J].American Journal of Veterinary Research,2004,65:88-92.

    [18]McIntosh Ka,Harding JCS,Ellis Ja,et al. Detection of Porcine circovirus type 2 viremia and seroconversion in naturally infected pigs in a farrow-to-finish barn[J].Canadian Journal of Veterinary,2006,70(1):58-61.

    Development of PCR to Detect Porcine circovirus Type2 and its clinical Application

    Shi Ligang
    (Animal disease prevention and control center of Luoyang,Henan Luoyang 471002)

    Porcine circovirus type 2(PCV2)is one of the most important pathogens in swine,a PCR method was established by using a set of primers derived from the published nucleotide sequence of the PCV2genes(Rep)in GenBank.In order to confirm its specificity,the PCR was implemented by using the template DNA,and the expected products of 700 bp were only detected in PCV2, however no specific band was detected in other virus such as PPV,CSFV,PRV.The lowest DNA consistence which could be detected by the PCR method was 1.80 ng/μL.In order to further investigate the prevalence of PCV2,14 clinic samples were detected.The data indicated that PCV2in 6 samples were positive.The experiments indicate the PCR method could be used in diagnosis and epidemiology investigating.

    Porcine circovirus type 2;PCR;Detection

    S858.28 < class="emphasis_bold"> 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:B

    B

    1672-9692(2016)08-0001-05

    2016-06-19

    師麗剛(1980-),男,山西省長治人,獸醫(yī)師,畢業(yè)于南京農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)專業(yè),主要從事獸醫(yī)臨床及實(shí)驗(yàn)室診斷工作。

    猜你喜歡
    圓環(huán)特異性引物
    DNA引物合成起始的分子基礎(chǔ)
    高中生物學(xué)PCR技術(shù)中“引物”相關(guān)問題歸類分析
    加權(quán)全能量最小的圓環(huán)形變
    SSR-based hybrid identification, genetic analyses and fingerprint development of hybridization progenies from sympodial bamboo (Bambusoideae, Poaceae)
    豬圓環(huán)病毒病的發(fā)生、診斷和防治
    一例鴨圓環(huán)病毒病的診斷
    圓環(huán)上的覆蓋曲面不等式及其應(yīng)用
    精確制導(dǎo) 特異性溶栓
    BOPIM-dma作為BSA Site Ⅰ特異性探針的研究及其應(yīng)用
    火炬松SSR-PCR反應(yīng)體系的建立及引物篩選
    国产精品一及| 国语自产精品视频在线第100页| aaaaa片日本免费| 69人妻影院| 久久99热这里只有精品18| 亚洲 欧美 日韩 在线 免费| 日韩欧美在线乱码| 欧美极品一区二区三区四区| 好男人在线观看高清免费视频| 俄罗斯特黄特色一大片| 日韩 欧美 亚洲 中文字幕| 91久久精品电影网| 韩国av一区二区三区四区| 亚洲精品乱码久久久v下载方式 | 色av中文字幕| 狂野欧美激情性xxxx| 99久久无色码亚洲精品果冻| 欧美日韩乱码在线| 麻豆国产97在线/欧美| 国产精品一及| 美女高潮喷水抽搐中文字幕| 国产精品,欧美在线| 男女午夜视频在线观看| 他把我摸到了高潮在线观看| 一个人看的www免费观看视频| 精品一区二区三区av网在线观看| 日本黄色片子视频| 男人的好看免费观看在线视频| 久久久国产精品麻豆| 国产一区在线观看成人免费| 午夜福利在线观看免费完整高清在 | 法律面前人人平等表现在哪些方面| 国产亚洲av嫩草精品影院| 亚洲无线在线观看| 国产免费av片在线观看野外av| 久久久久亚洲av毛片大全| 亚洲av二区三区四区| 丁香六月欧美| 99热这里只有精品一区| 国产欧美日韩一区二区精品| 少妇裸体淫交视频免费看高清| 美女高潮喷水抽搐中文字幕| 黄片小视频在线播放| 人人妻,人人澡人人爽秒播| 激情在线观看视频在线高清| 日日摸夜夜添夜夜添小说| svipshipincom国产片| 一进一出抽搐动态| 亚洲aⅴ乱码一区二区在线播放| 免费人成视频x8x8入口观看| 我要搜黄色片| 亚洲精华国产精华精| 久久性视频一级片| 精品久久久久久久毛片微露脸| 高清日韩中文字幕在线| 国产真实伦视频高清在线观看 | 18禁美女被吸乳视频| 琪琪午夜伦伦电影理论片6080| 国产精品久久久久久精品电影| 人人妻,人人澡人人爽秒播| 亚洲精品在线美女| 黄色日韩在线| 99久久99久久久精品蜜桃| 欧美大码av| 99热精品在线国产| 国产综合懂色| 欧美另类亚洲清纯唯美| 亚洲精品乱码久久久v下载方式 | 91av网一区二区| 亚洲自拍偷在线| 亚洲精品成人久久久久久| 色在线成人网| 亚洲欧美日韩无卡精品| 午夜福利18| 男人舔奶头视频| 男人舔奶头视频| 不卡一级毛片| 一区二区三区高清视频在线| 大型黄色视频在线免费观看| 欧美日韩黄片免| 亚洲 欧美 日韩 在线 免费| 每晚都被弄得嗷嗷叫到高潮| 久久欧美精品欧美久久欧美| 哪里可以看免费的av片| 久久精品国产清高在天天线| 午夜免费观看网址| 久久99热这里只有精品18| 精品乱码久久久久久99久播| 一区福利在线观看| 人人妻人人澡欧美一区二区| 女人高潮潮喷娇喘18禁视频| 国产av在哪里看| 无遮挡黄片免费观看| 亚洲国产精品999在线| eeuss影院久久| 日韩欧美三级三区| 国产欧美日韩一区二区三| 亚洲国产欧美人成| 欧美zozozo另类| 99国产综合亚洲精品| 亚洲内射少妇av| 90打野战视频偷拍视频| 国产精品日韩av在线免费观看| 亚洲av美国av| 国产私拍福利视频在线观看| 久久这里只有精品中国| 草草在线视频免费看| 久久久成人免费电影| 色噜噜av男人的天堂激情| 日韩 欧美 亚洲 中文字幕| 亚洲美女黄片视频| 国产高潮美女av| 色哟哟哟哟哟哟| av天堂中文字幕网| 女人高潮潮喷娇喘18禁视频| 哪里可以看免费的av片| 欧美成人a在线观看| 精品一区二区三区视频在线 | 午夜视频国产福利| 高潮久久久久久久久久久不卡| 国产精品一区二区免费欧美| 久久伊人香网站| 国内久久婷婷六月综合欲色啪| 婷婷丁香在线五月| 中文字幕人妻熟人妻熟丝袜美 | 人人妻人人澡欧美一区二区| av国产免费在线观看| 国内揄拍国产精品人妻在线| 亚洲激情在线av| 国产精品女同一区二区软件 | 国产伦一二天堂av在线观看| 麻豆成人av在线观看| 波多野结衣高清无吗| 久久中文看片网| 淫秽高清视频在线观看| 色精品久久人妻99蜜桃| 国产97色在线日韩免费| 怎么达到女性高潮| 一区二区三区国产精品乱码| 欧美高清成人免费视频www| 小蜜桃在线观看免费完整版高清| 国产激情偷乱视频一区二区| 精品国内亚洲2022精品成人| 国产高清三级在线| 淫妇啪啪啪对白视频| 国产高清三级在线| 日本熟妇午夜| 亚洲av二区三区四区| 欧美日韩黄片免| 亚洲 欧美 日韩 在线 免费| 国产高潮美女av| 嫩草影视91久久| 亚洲欧美日韩无卡精品| 最新中文字幕久久久久| 久久亚洲精品不卡| 精品国产三级普通话版| 久久久成人免费电影| 男女做爰动态图高潮gif福利片| 国产主播在线观看一区二区| 国产精品香港三级国产av潘金莲| 国产真人三级小视频在线观看| 亚洲精品成人久久久久久| 久久精品国产自在天天线| 九九久久精品国产亚洲av麻豆| 亚洲精品美女久久久久99蜜臀| 国产黄a三级三级三级人| 成年女人永久免费观看视频| 90打野战视频偷拍视频| 舔av片在线| 午夜福利在线观看吧| 欧美成人a在线观看| 日韩欧美精品免费久久 | 俄罗斯特黄特色一大片| 国产伦人伦偷精品视频| 国产精品久久久久久人妻精品电影| 国产高清有码在线观看视频| 一个人观看的视频www高清免费观看| 国模一区二区三区四区视频| 禁无遮挡网站| 亚洲成人久久爱视频| 日本撒尿小便嘘嘘汇集6| 欧美3d第一页| 亚洲av电影不卡..在线观看| 亚洲人成网站在线播| 亚洲第一电影网av| 九色国产91popny在线| 日韩大尺度精品在线看网址| 国产伦精品一区二区三区四那| 在线播放无遮挡| 日本熟妇午夜| 免费av不卡在线播放| 小说图片视频综合网站| 大型黄色视频在线免费观看| 神马国产精品三级电影在线观看| av中文乱码字幕在线| 97人妻精品一区二区三区麻豆| 中文字幕人成人乱码亚洲影| 久久久成人免费电影| 日本精品一区二区三区蜜桃| 国产欧美日韩精品亚洲av| 欧美一区二区国产精品久久精品| 最近最新中文字幕大全免费视频| 午夜福利在线观看吧| 男人和女人高潮做爰伦理| 国产精品亚洲av一区麻豆| 又爽又黄无遮挡网站| 国内久久婷婷六月综合欲色啪| 国产高清三级在线| 老司机在亚洲福利影院| 九九在线视频观看精品| 好男人电影高清在线观看| www日本黄色视频网| 日本精品一区二区三区蜜桃| a级毛片a级免费在线| 成人国产综合亚洲| 一级黄色大片毛片| 久久久久久人人人人人| 美女免费视频网站| 免费电影在线观看免费观看| 日韩欧美免费精品| 久久天躁狠狠躁夜夜2o2o| 18禁黄网站禁片午夜丰满| 性欧美人与动物交配| 制服人妻中文乱码| 亚洲国产欧美网| 不卡一级毛片| 美女大奶头视频| 国产精品一区二区三区四区久久| 亚洲性夜色夜夜综合| 亚洲最大成人手机在线| e午夜精品久久久久久久| 日本在线视频免费播放| 99久久精品一区二区三区| 又黄又粗又硬又大视频| 熟女电影av网| 成人国产一区最新在线观看| 一a级毛片在线观看| 亚洲熟妇中文字幕五十中出| 午夜福利免费观看在线| 一级作爱视频免费观看| 国产v大片淫在线免费观看| 久久久久久久久中文| 精品一区二区三区人妻视频| 亚洲av成人av| 久久久久九九精品影院| 免费在线观看亚洲国产| 亚洲男人的天堂狠狠| 天堂av国产一区二区熟女人妻| 成人永久免费在线观看视频| 又紧又爽又黄一区二区| 国内少妇人妻偷人精品xxx网站| www日本黄色视频网| 久久久国产精品麻豆| 很黄的视频免费| 少妇的逼水好多| 国产精品99久久99久久久不卡| 日韩欧美 国产精品| www.色视频.com| 国产伦人伦偷精品视频| 日本一二三区视频观看| 色吧在线观看| 久久久久久久久大av| 嫩草影院精品99| 久久天躁狠狠躁夜夜2o2o| aaaaa片日本免费| xxx96com| 激情在线观看视频在线高清| 国产爱豆传媒在线观看| 午夜a级毛片| 久久久久久大精品| 欧美乱妇无乱码| 亚洲第一电影网av| 久久精品国产综合久久久| 国产精品久久久久久久电影 | 最近最新中文字幕大全免费视频| 美女cb高潮喷水在线观看| 久久精品国产99精品国产亚洲性色| 中文字幕av在线有码专区| 亚洲电影在线观看av| 在线视频色国产色| 亚洲国产欧洲综合997久久,| 天天躁日日操中文字幕| 97超级碰碰碰精品色视频在线观看| 国产精品乱码一区二三区的特点| 国产男靠女视频免费网站| 免费高清视频大片| 99国产精品一区二区蜜桃av| 国产麻豆成人av免费视频| 中文字幕人妻熟人妻熟丝袜美 | 床上黄色一级片| 99久久无色码亚洲精品果冻| 亚洲欧美激情综合另类| 久久久精品大字幕| 亚洲va日本ⅴa欧美va伊人久久| 国内少妇人妻偷人精品xxx网站| 男女做爰动态图高潮gif福利片| 成人午夜高清在线视频| 国产成人av教育| 久久人妻av系列| 婷婷亚洲欧美| 男女午夜视频在线观看| 亚洲精品美女久久久久99蜜臀| 亚洲精华国产精华精| 精品99又大又爽又粗少妇毛片 | 免费电影在线观看免费观看| 日本a在线网址| 女人被狂操c到高潮| 亚洲中文日韩欧美视频| 国产午夜福利久久久久久| 男人舔女人下体高潮全视频| 乱人视频在线观看| av片东京热男人的天堂| 国内精品久久久久精免费| av福利片在线观看| 亚洲成人中文字幕在线播放| 欧美性猛交黑人性爽| 亚洲av免费高清在线观看| 国产av一区在线观看免费| 在线观看66精品国产| 欧美bdsm另类| 91久久精品国产一区二区成人 | 18+在线观看网站| 每晚都被弄得嗷嗷叫到高潮| 宅男免费午夜| 日本 欧美在线| 亚洲第一欧美日韩一区二区三区| 99久久99久久久精品蜜桃| 一区二区三区高清视频在线| 亚洲片人在线观看| 欧美在线一区亚洲| 亚洲第一欧美日韩一区二区三区| 在线国产一区二区在线| 免费在线观看影片大全网站| 免费av毛片视频| 嫁个100分男人电影在线观看| 欧美成人免费av一区二区三区| 欧美乱码精品一区二区三区| 中文字幕av成人在线电影| 老汉色av国产亚洲站长工具| 国产淫片久久久久久久久 | 国产精品精品国产色婷婷| 成人性生交大片免费视频hd| 亚洲午夜理论影院| 国产精品综合久久久久久久免费| 岛国视频午夜一区免费看| 性色avwww在线观看| 国产精品永久免费网站| 国产精品98久久久久久宅男小说| 亚洲国产精品999在线| 国产精品女同一区二区软件 | 亚洲电影在线观看av| 91麻豆精品激情在线观看国产| 久久亚洲真实| 蜜桃久久精品国产亚洲av| 国产老妇女一区| 精品国产三级普通话版| 99国产精品一区二区蜜桃av| 色av中文字幕| 色老头精品视频在线观看| 午夜福利欧美成人| 狠狠狠狠99中文字幕| 少妇的丰满在线观看| 国产成+人综合+亚洲专区| 国产男靠女视频免费网站| 中国美女看黄片| 小蜜桃在线观看免费完整版高清| 日韩免费av在线播放| 亚洲精品美女久久久久99蜜臀| 美女 人体艺术 gogo| 一本综合久久免费| 亚洲激情在线av| 一本久久中文字幕| 窝窝影院91人妻| 国产一区二区三区视频了| 中文字幕人妻丝袜一区二区| 男人和女人高潮做爰伦理| 国产精品一区二区免费欧美| 国产午夜福利久久久久久| 亚洲熟妇中文字幕五十中出| 亚洲人与动物交配视频| 中文字幕高清在线视频| 午夜福利在线在线| 香蕉丝袜av| 日本在线视频免费播放| 日本黄大片高清| 亚洲精品美女久久久久99蜜臀| 1024手机看黄色片| 丁香六月欧美| 久久久久亚洲av毛片大全| 久久亚洲真实| 国产av一区在线观看免费| 精品不卡国产一区二区三区| 欧美午夜高清在线| 美女cb高潮喷水在线观看| 国产色婷婷99| 日韩人妻高清精品专区| or卡值多少钱| 狂野欧美激情性xxxx| 女同久久另类99精品国产91| 在线免费观看的www视频| 好男人在线观看高清免费视频| 怎么达到女性高潮| 大型黄色视频在线免费观看| 天天添夜夜摸| www国产在线视频色| 精品福利观看| 免费电影在线观看免费观看| 久久久色成人| 99久久精品一区二区三区| 亚洲乱码一区二区免费版| 亚洲av第一区精品v没综合| 精品午夜福利视频在线观看一区| 成年版毛片免费区| 久久中文看片网| 一本一本综合久久| av专区在线播放| 色在线成人网| 母亲3免费完整高清在线观看| 夜夜躁狠狠躁天天躁| 男人舔奶头视频| 18禁美女被吸乳视频| 亚洲第一电影网av| 精品国产亚洲在线| 欧美成人性av电影在线观看| 国产av一区在线观看免费| 国产99白浆流出| a级毛片a级免费在线| 国产单亲对白刺激| 亚洲av二区三区四区| 国产精品,欧美在线| 国产淫片久久久久久久久 | 国产精品久久视频播放| 久久久久久久亚洲中文字幕 | 亚洲专区国产一区二区| 国产成年人精品一区二区| 国产日本99.免费观看| 在线十欧美十亚洲十日本专区| 国产91精品成人一区二区三区| 成人av在线播放网站| 一本综合久久免费| 国产蜜桃级精品一区二区三区| 国产精华一区二区三区| 少妇的逼水好多| 国产一区在线观看成人免费| 日韩欧美精品免费久久 | 国产av一区在线观看免费| 老汉色∧v一级毛片| 亚洲狠狠婷婷综合久久图片| 亚洲av不卡在线观看| 久久久久久人人人人人| 国产精品女同一区二区软件 | 日韩欧美三级三区| 午夜福利视频1000在线观看| 国产成+人综合+亚洲专区| 亚洲18禁久久av| 亚洲精品456在线播放app | 午夜精品久久久久久毛片777| 成人国产综合亚洲| 十八禁网站免费在线| 午夜福利成人在线免费观看| 国产精品综合久久久久久久免费| 成人午夜高清在线视频| 高潮久久久久久久久久久不卡| 日韩成人在线观看一区二区三区| 免费观看的影片在线观看| 欧美日韩国产亚洲二区| 国产成年人精品一区二区| 欧美一级毛片孕妇| 国产高潮美女av| 日本 欧美在线| 欧美日本视频| 亚洲精品色激情综合| 午夜激情欧美在线| 身体一侧抽搐| 嫩草影院入口| 成人精品一区二区免费| 久久久成人免费电影| 免费在线观看亚洲国产| 动漫黄色视频在线观看| а√天堂www在线а√下载| 精品国内亚洲2022精品成人| 婷婷六月久久综合丁香| 一进一出抽搐动态| 三级男女做爰猛烈吃奶摸视频| 精品久久久久久久毛片微露脸| 亚洲天堂国产精品一区在线| 97人妻精品一区二区三区麻豆| 麻豆国产av国片精品| 欧美日韩精品网址| 午夜福利免费观看在线| 久久人妻av系列| 在线观看一区二区三区| 99热6这里只有精品| 国产极品精品免费视频能看的| 男女之事视频高清在线观看| 啦啦啦观看免费观看视频高清| 啦啦啦免费观看视频1| 国产亚洲欧美98| 精品人妻1区二区| 可以在线观看的亚洲视频| av天堂中文字幕网| 亚洲av一区综合| 免费一级毛片在线播放高清视频| 九九久久精品国产亚洲av麻豆| av片东京热男人的天堂| 12—13女人毛片做爰片一| 男插女下体视频免费在线播放| 精品福利观看| 亚洲七黄色美女视频| 欧美日本视频| 少妇的逼好多水| 精品一区二区三区av网在线观看| 欧美bdsm另类| 99久久精品国产亚洲精品| 中文字幕av成人在线电影| 成人无遮挡网站| 天天一区二区日本电影三级| 国产精品爽爽va在线观看网站| 国产精品电影一区二区三区| 国产精品久久久人人做人人爽| 狂野欧美激情性xxxx| 亚洲精品在线观看二区| 男人和女人高潮做爰伦理| 欧美日韩精品网址| 18禁美女被吸乳视频| 18+在线观看网站| 老汉色av国产亚洲站长工具| 国产在线精品亚洲第一网站| 男女下面进入的视频免费午夜| 欧美色欧美亚洲另类二区| 三级国产精品欧美在线观看| 美女cb高潮喷水在线观看| 亚洲av五月六月丁香网| 18禁美女被吸乳视频| 亚洲国产欧美网| 国产三级黄色录像| 精品一区二区三区av网在线观看| 亚洲美女视频黄频| 婷婷丁香在线五月| 日本五十路高清| 国产麻豆成人av免费视频| 欧美一区二区精品小视频在线| 中国美女看黄片| 成人高潮视频无遮挡免费网站| 亚洲狠狠婷婷综合久久图片| a级一级毛片免费在线观看| 97超视频在线观看视频| 亚洲人成网站在线播| 少妇人妻一区二区三区视频| 国产97色在线日韩免费| 亚洲美女黄片视频| 免费在线观看亚洲国产| 日韩欧美国产一区二区入口| 国产欧美日韩一区二区精品| 黄色成人免费大全| 欧美成人性av电影在线观看| 亚洲无线观看免费| 丰满乱子伦码专区| 啦啦啦观看免费观看视频高清| 免费av毛片视频| 中文字幕人妻熟人妻熟丝袜美 | 俺也久久电影网| 99久久九九国产精品国产免费| 日本免费a在线| 国产熟女xx| 亚洲狠狠婷婷综合久久图片| 脱女人内裤的视频| 99在线人妻在线中文字幕| 久久久久久久亚洲中文字幕 | eeuss影院久久| 国产单亲对白刺激| 亚洲国产精品sss在线观看| 91麻豆av在线| 欧美bdsm另类| 国产v大片淫在线免费观看| 免费看a级黄色片| 欧美3d第一页| 欧美在线黄色| 欧美一级毛片孕妇| 五月伊人婷婷丁香| 亚洲欧美精品综合久久99| 五月伊人婷婷丁香| 一卡2卡三卡四卡精品乱码亚洲| 亚洲国产精品999在线| 免费看日本二区| 97人妻精品一区二区三区麻豆| 美女高潮的动态| 2021天堂中文幕一二区在线观| 久久久久性生活片| 亚洲精品一区av在线观看| 日本黄色片子视频| 国产一区在线观看成人免费| 精品午夜福利视频在线观看一区| 国产一区在线观看成人免费| 蜜桃久久精品国产亚洲av| 亚洲激情在线av| 亚洲欧美日韩高清在线视频| АⅤ资源中文在线天堂| 免费人成在线观看视频色| 亚洲精品粉嫩美女一区| 一级毛片高清免费大全| 极品教师在线免费播放| 免费看光身美女| 一个人观看的视频www高清免费观看| 精品福利观看| 国模一区二区三区四区视频| 日本黄大片高清| 久久久久性生活片| eeuss影院久久| 99久久成人亚洲精品观看| 亚洲,欧美精品.| 99久久精品一区二区三区| 偷拍熟女少妇极品色| 搞女人的毛片| 欧美日韩乱码在线|