高效液相色譜法測(cè)定貉子肉中褪黑素殘留量的研究

楊衛(wèi)軍，李 曼，曹秀梅，林艷青，杜順豐

（河北省秦皇島市農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全監(jiān)督檢驗(yàn)中心，河北 秦皇島 066000）

高效液相色譜法測(cè)定貉子肉中褪黑素殘留量的研究

楊衛(wèi)軍，李 曼，曹秀梅，林艷青，杜順豐*

（河北省秦皇島市農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全監(jiān)督檢驗(yàn)中心，河北 秦皇島 066000）

本研究建立一種檢測(cè)貉子肉中褪黑素藥物殘留的高效液相色譜——熒光檢測(cè)法。貉子肉經(jīng)乙酸乙酯提取，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干，溶解殘留物，加入水飽和的正己烷去脂肪，Waters Oasis HLB柱凈化。以20 mmol/L NaAc-HAc溶液和甲醇溶液為流動(dòng)相，等度洗脫，檢測(cè)波長(zhǎng)：Ex=285nm，Em=345 nm。結(jié)果表明，褪黑素在0.1～100 μg/L呈良好的線性關(guān)系，r均大于0.9999。方法的最低檢出限為0.25 μg/kg，定量限為1 μg/kg。在1、5和10 μg/kg的添加水平上，其回收率范圍在72.0%～90.4%之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為1.2%～2.4%。

高效液相色譜法；貉子肉；褪黑素；殘留量

褪黑素（Melatonin，簡(jiǎn)稱(chēng)MT）是哺乳動(dòng)物和人類(lèi)的松果體分泌的一種激素，具有抗腫瘤、抗氧化、改善睡眠、調(diào)控生殖活動(dòng)、改善免疫功能等作用。隨著毛皮動(dòng)物養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展，埋植褪黑素技術(shù)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于毛皮動(dòng)物生產(chǎn)中，使用外源MT可以促使毛皮動(dòng)物冬皮提早成熟，從而調(diào)節(jié)毛皮動(dòng)物季節(jié)性換毛，改進(jìn)皮毛質(zhì)量，以達(dá)到提前取皮，節(jié)省飼料，降低飼養(yǎng)成本，提高經(jīng)濟(jì)效益[1-2]。

目前，高效液相色譜法多用于檢測(cè)抗生素[3]，采用液相色譜法檢測(cè)血液、腦組織和唾液中褪黑素含量的報(bào)道較多，而對(duì)于貉子肉中褪黑素殘留量的檢測(cè)尚未見(jiàn)報(bào)道。本文建立了貉子肉中褪黑素殘留量的高效液相色譜-熒光檢測(cè)法，以期對(duì)埋植褪黑素以后，貉子肉中的褪黑素的殘留量進(jìn)行檢測(cè)，能夠?yàn)楹炎尤獾男l(wèi)生指標(biāo)作以評(píng)價(jià)，為今后貉子肉的合理開(kāi)發(fā)利用提供參考。

1 材料與方法

1.1試劑褪黑素標(biāo)準(zhǔn)品（純度≥99.5%，中國(guó)計(jì)量科學(xué)研究院）；甲醇（HPLC級(jí)，美國(guó)Fisher公司）；乙酸（HPLC級(jí)，美國(guó)Fisher公司）；乙酸乙酯（HPLC級(jí)，美國(guó)Tedia公司）；結(jié)晶乙酸鈉（分析純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司）；試驗(yàn)用水為去離子水。

1.2儀器與耗材高效液相色譜儀U3000（賽默飛世爾科技有限公司）；超純水器（Millipore公司）；臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)（湖南赫西儀器裝備有限公司）；漩渦混合器（上海青浦扈西儀器廠）；多用調(diào)速振蕩器（江蘇省金壇市醫(yī)療儀器廠）；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（瑞士BUCHI）；氮吹儀（北京斯珀特科技有限公司）；固相萃取柱Waters Oasis HLB（3 cc/60 mg，沃特世科技有限公司）。

1.3方法

1.3.1 色譜條件 色譜柱：C18色譜柱（250 mm× 4.6 mm，5 μm）；柱溫：30℃；檢測(cè)器：熒光檢測(cè)器，Ex=285 nm，Em=345 nm；流動(dòng)相：20 mmol/L NaAc-HA（cpH 4.0）:甲醇（v:v）=66:34；流速：1 mL/min；進(jìn)樣體積：20 μL。

1.3.2 樣品提取與凈化 稱(chēng)取試樣2.00 g，于50 mL離心管中，加乙酸乙酯10 mL，渦動(dòng)2 min，在振蕩器上中速振蕩5 min后，10 000 r/min離心5 min，取上清液于50 mL雞心瓶中，重復(fù)提取一次，合并兩次提取液，于40℃下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)干。用5%的甲醇水5 mL洗雞心瓶，再加入正己烷2 mL，將甲醇水和正己烷同時(shí)轉(zhuǎn)入離心管中，渦旋混合30 s，10 000 r/min離心3 min，棄正己烷，取下層液備用。

HLB柱依次用甲醇3 mL和水3 mL活化，取備用液過(guò)柱，控制流速1 mL/min。用水2 mL淋洗，甲醇2 mL洗脫，收集洗脫液，于40℃氮?dú)獯蹈桑? mL流動(dòng)相溶解殘余物，0.22 μm濾膜過(guò)濾，供高效液相色譜測(cè)定。

1.3.3 標(biāo)準(zhǔn)貯備液與標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 精密稱(chēng)取MT標(biāo)準(zhǔn)品10 mg，置于100 mL容量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，混勻，即得100 μg/mL MT貯備液。置4℃冰箱中避光，密閉保存。

精密量取MT貯備液適量，置于容量瓶中，用流動(dòng)相稀釋至刻度，分別配制成濃度為0.1、0.5、1、5、10、50、100 μg/L的系列標(biāo)準(zhǔn)工作液。以各濃度的色譜峰面積對(duì)濃度做線性回歸方程并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.4 靈敏度 通過(guò)向空白樣品中添加不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行檢測(cè)，觀察褪黑素色譜峰信噪比和對(duì)應(yīng)的添加藥物濃度，確定其檢測(cè)限和定量限。

1.3.5 準(zhǔn)確度和精密度 采用標(biāo)準(zhǔn)添加法，向空白樣品中添加不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，做添加回收試驗(yàn)，使其樣品添加濃度為1、5和10 μg/kg，每個(gè)濃度設(shè)定5個(gè)平行樣品，同時(shí)進(jìn)行空白試驗(yàn)，求每個(gè)樣品的回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）。

2 結(jié)果與分析

2.1標(biāo)準(zhǔn)曲線及線性范圍將系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，依次從低濃度到高濃度進(jìn)行分析，按峰面積與對(duì)應(yīng)的對(duì)照溶液的質(zhì)量濃度做標(biāo)準(zhǔn)曲線。其質(zhì)量濃度在0.1～100 μg/L范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，線性回歸方程為：Y=5567.6521X-484.2025，相關(guān)系數(shù)為0.9999。

2.2檢測(cè)限和定量限按照上述方法進(jìn)行處理，標(biāo)準(zhǔn)品和樣品在19 min出峰，空白試料對(duì)所測(cè)分析物無(wú)干擾，在該色譜條件下褪黑素得到很好的分離。根據(jù)3倍信噪比得到方法的檢出限為0.25 μg/kg；當(dāng)添加濃度為1 μg/kg時(shí)，信噪比值約為10，得到該方法的定量限為1 μg/kg。褪黑素標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖見(jiàn)圖1，空白組織中添加5 μg/kg褪黑素及相應(yīng)的空白組織的高效液相色譜圖，見(jiàn)圖2～3。

2.3準(zhǔn)確度和精密度空白組織中褪黑素在1、5和10 μg/kg 3個(gè)添加水平，平均回收率為72.0%～90.4%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為1.2%～2.4%。結(jié)果見(jiàn)表1。準(zhǔn)確吸取標(biāo)準(zhǔn)品溶液20μL，重復(fù)進(jìn)樣11次，在相同色譜條件下對(duì)峰面積進(jìn)行分析，結(jié)果表明，峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為0.31%，表明儀器精密度良好。

3 討論

圖1 褪黑素標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖（5 μg/L）Fig.1 Chromatogram of standard for melatonin

圖2 貉子肉空白樣品色譜圖Fig.2 Chromatogram of blank sample

圖3 貉子肉加標(biāo)樣品色譜圖（5 μg/kg）Fig.3 Chromatogram of positive sample

表1 貉子肉中添加回收率試驗(yàn)結(jié)果Table1 Result of recovery test in nyctereutes procyonoides tissues

3.1提取條件的優(yōu)化查閱資料比較了磷酸鹽緩沖溶液、生理鹽水與乙酸乙酯作為提取劑[4-6]，結(jié)果發(fā)現(xiàn)磷酸鹽緩沖溶液和生理鹽水作為提取液不理想，最終確定乙酸乙酯作為提取劑，能夠從肌肉組織中提取到褪黑素。

3.2凈化條件的優(yōu)化為了去除組織樣品中的雜質(zhì)，減少對(duì)色譜柱的污染，延長(zhǎng)色譜柱的使用壽命，比較分析了Agilent Bond Elut C18（50 mg/3 mL）和Waters Oasis HLB SPE（60 mg/3 mL）兩種萃取柱在樣品凈化方面的效果，結(jié)果表明均能達(dá)到凈化目的，目標(biāo)物的回收率均大于95%[7-9]。

3.3色譜條件的優(yōu)化文獻(xiàn)中報(bào)道常使用甲醇-水、甲醇-0.5%NaH2PO4、乙腈-醋酸緩沖鹽等作為褪黑素的流動(dòng)相[10-12]。經(jīng)試驗(yàn)采用甲醇-水作為流動(dòng)相，樣品有明顯的拖尾，而采用20 mmol/L NaAc-HAc（pH 4.0）:甲醇（v:v）=66:34作為流動(dòng)相，減少了樣品拖尾，能夠使樣品各組分達(dá)到很好分離（分離度大于2）。

4 小結(jié)

由于肌肉組織成分復(fù)雜，只有得當(dāng)?shù)那疤幚矸椒ú拍塬@得良好的檢測(cè)結(jié)果，本試驗(yàn)建立了測(cè)定貉子肉中褪黑素殘留量的高效液相色譜法。通過(guò)對(duì)貉子肉樣品的提取條件、凈化條件和色譜條件的優(yōu)化，最后確定褪黑素在肌肉組織中的檢測(cè)限為0.25 μg/kg，定量限為1 μg/kg。在1～10 μg/kg添加濃度范圍內(nèi)，褪黑素回收率為72.0%～90.4%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為1.2%～2.4%。該方法簡(jiǎn)單快速，靈敏度高，重現(xiàn)性好，適合貉子肉中褪黑素殘留量的測(cè)定。

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Study on determination of the residual quantity of melatonin in nyctereutes procyonoides tissues using high performance liquid chromatography

Yang Weijun,Li Man,Cao Xiumei,Lin Yanqing,Du Shunfeng*
(Qinhuangdao Agricultural Product Quality Safety Supervision and Inspection Center,Hebei Qinhuangdao 066000)

A high performance liquid chromatography method has been developed for the simultaneous determination melatonin in nyctereutes procyonoides tissues muscle by fluorescence detector. Sample was extracted by ethyl acetate,the solution was purified with Waters Oasis HLB.Mobile phase of 20 mmol/L balanced solution(sodium acetate trihydrate-glacial acetic acid)-methanol was used with isocratic elution.The detection wavelength was Ex=285 nm,Em=345 nm.The results showed that the calibration curves of melatonin had good linearity relationship in the range from 0.1 to 100 μg/L,and the correlation coefficient was greater than 0.9999.The average recovery rates of melatonin in muscle tissue were from 72.0%to 90.4%at three adding levels of 1,5 and 10 μg/kg for melatonin,and the values of relative standard deviation(RSD)for the average recovery rates of melatonin were from 1.2%to 2.4%,the limit of detection and limit of quantification were 0.25 μg/kg and 1 μg/kg,respectively.

High performance liquid chromatography;Nyctereutes procyonoides tissues;Melatonin;Residual quantity

O657.72 < class="emphasis_bold"> 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：B

B

1672-9692(2016)05-0001-04

2016-04-01

楊衛(wèi)軍（1981-），男,獸醫(yī)師，碩士研究生，主要從事農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全檢驗(yàn)工作。

杜順豐（1965-）,男，研究員，碩士研究生，主要從事農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全檢驗(yàn)工作。

秦皇島市科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目（201502A049）。