呼氣檢測(cè)技術(shù)與設(shè)備的研究進(jìn)展

林麗泉，董浩，王福園，陳星

浙江大學(xué) 生物醫(yī)學(xué)工程與儀器科學(xué)學(xué)院，浙江 杭州 310027

呼氣檢測(cè)技術(shù)與設(shè)備的研究進(jìn)展

林麗泉，董浩，王福園，陳星

浙江大學(xué) 生物醫(yī)學(xué)工程與儀器科學(xué)學(xué)院，浙江 杭州 310027

編者按：早在18世紀(jì)初，研究人員就發(fā)現(xiàn)人呼出氣味的不同預(yù)示著某些疾病的發(fā)生。隨著現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的發(fā)展，呼出氣體中有越來(lái)越多的疾病相關(guān)標(biāo)志物被發(fā)現(xiàn)，最近十幾年的研究表明呼出氣體中存在可以用于診斷糖尿病、代謝性肥胖、癌癥、結(jié)核病以及膿毒癥等疾病的標(biāo)志物。在臨床應(yīng)用方面，呼出氣檢測(cè)更是已經(jīng)成為幽門螺桿菌快速診斷的標(biāo)準(zhǔn)之一。呼出氣檢測(cè)由于其無(wú)創(chuàng)檢測(cè)的優(yōu)勢(shì)，可用于疾病的早期發(fā)現(xiàn)，病程監(jiān)測(cè)以及預(yù)后管理，在臨床應(yīng)用中有著非常巨大的潛力。目前呼出氣檢測(cè)由于疾病標(biāo)志物產(chǎn)生機(jī)理不明，氣體采集、分析方法多變，質(zhì)量控制環(huán)節(jié)缺失等原因，使得呼出氣檢測(cè)真正用于臨床的案例還不多。近年來(lái)，呼出氣研究呈現(xiàn)出快速增長(zhǎng)的趨勢(shì)，我們相信在可以預(yù)見的未來(lái)，隨著呼出氣研究的不斷深入，呼出氣檢測(cè)將在臨床中占有越來(lái)越重要的地位。因此《中國(guó)醫(yī)療設(shè)備》雜志社組織了本專欄介紹呼出氣體檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展現(xiàn)狀和臨床應(yīng)用趨勢(shì)。

欄目主編：陳星

陳星，博士，浙江大學(xué)生物醫(yī)學(xué)工程與儀器科學(xué)學(xué)院副教授，博士生導(dǎo)師。長(zhǎng)期從事呼出氣體疾病相關(guān)標(biāo)志物的研究和呼出氣體檢測(cè)技術(shù)的研發(fā)。研究了肺癌呼氣標(biāo)識(shí)物的產(chǎn)生機(jī)理，發(fā)現(xiàn)并報(bào)導(dǎo)了肺癌細(xì)胞在代謝過程中釋放的特定化學(xué)物質(zhì)會(huì)通過肺部氣體交換存在于肺癌病人的呼出氣中，可作為潛在的診斷標(biāo)識(shí)物應(yīng)用于呼氣檢測(cè)早期肺癌。建立了體檢人群中高危人群的呼出氣體肺癌篩查平臺(tái)，為高危因素（如吸煙）對(duì)人體的危害及肺癌的發(fā)病找到相應(yīng)的呼出氣體標(biāo)識(shí)物，用于肺癌一期預(yù)防。研制了呼氣采集裝置，用于呼出氣體的標(biāo)準(zhǔn)化收集。研制了肺癌呼氣檢測(cè)儀成功地從肺癌病人的呼出氣中檢測(cè)出了低于本底濃度的該類標(biāo)識(shí)物。開發(fā)了靜脈麻醉藥異丙酚血藥濃度實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)儀，利用呼出氣和血藥濃度之間的相關(guān)性，實(shí)現(xiàn)呼出氣在線無(wú)創(chuàng)監(jiān)測(cè)異丙酚血藥濃度。

呼吸作為人體重要的生理過程，是人體內(nèi)環(huán)境與外界交換物質(zhì)的途徑之一。呼出氣體中包含著大量人體新陳代謝的產(chǎn)物，各項(xiàng)研究表明呼出物的種類和濃度在一定程度上能反映人體健康狀態(tài)。通過檢測(cè)呼出氣中的標(biāo)志物能及時(shí)診斷人體的健康狀態(tài)，對(duì)疾病的發(fā)生、發(fā)展過程進(jìn)行監(jiān)測(cè)，從而達(dá)到疾病預(yù)防的目的。由于呼氣檢測(cè)的無(wú)損性，國(guó)內(nèi)外涌現(xiàn)出了許多呼吸檢測(cè)技術(shù)和設(shè)備，本文主要介紹了氣體采樣、進(jìn)樣及預(yù)處理技術(shù)與設(shè)備，復(fù)雜混合氣體、特定標(biāo)識(shí)物、呼出氣中冷凝物的檢測(cè)技術(shù)和設(shè)備的研究進(jìn)展。

呼氣檢測(cè)；氣體傳感器；電子鼻；氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用；免疫分析

1 概述

呼吸作為人體重要的生理過程，是人體內(nèi)環(huán)境與外界交換物質(zhì)的途徑之一。呼出氣體中包含著大量人體新陳代謝的產(chǎn)物，各項(xiàng)研究表明呼出物的種類和濃度在一定程度上能反映人體的健康狀態(tài)[1]。比如呼出氣中的一氧化氮是國(guó)際公認(rèn)的氣道炎癥分子標(biāo)志物。通過檢測(cè)呼出氣中的標(biāo)志物我們能及時(shí)診斷人體的健康狀態(tài)，對(duì)疾病的發(fā)生、發(fā)展過程進(jìn)行監(jiān)測(cè)，從而達(dá)到疾病預(yù)防的目的。目前已有的呼氣檢測(cè)設(shè)備有酒精檢測(cè)儀、幽門螺旋桿菌檢測(cè)儀等[2]。由于呼氣檢測(cè)的無(wú)損性，國(guó)內(nèi)外興起一股研究和開發(fā)呼吸檢測(cè)技術(shù)和設(shè)備的熱潮。本文就國(guó)內(nèi)外的呼吸檢測(cè)技術(shù)與設(shè)備的研究情況展開簡(jiǎn)要討論，同時(shí)對(duì)未來(lái)新技術(shù)的發(fā)展和新設(shè)備的開發(fā)進(jìn)行展望。

2 氣體采樣、進(jìn)樣及預(yù)處理技術(shù)與設(shè)備

呼出氣是由未進(jìn)行氣體交換的口鼻腔氣道內(nèi)氣體和進(jìn)行了氣體交換的肺泡內(nèi)氣體及部分死腔氣體組成。而可作為呼氣標(biāo)識(shí)物的有效氣體分子應(yīng)指肺泡內(nèi)氣體，如何最大限度地去除未交換的死腔氣體的影響是呼出氣采樣的關(guān)鍵所在。大多數(shù)呼出氣標(biāo)識(shí)物的濃度在體積分?jǐn)?shù)ppb至ppt之間。這個(gè)濃度等級(jí)的氣體檢測(cè)往往已經(jīng)超出了檢測(cè)設(shè)備的檢測(cè)下限，因此需要對(duì)樣本進(jìn)行必要的濃縮和提純。而這個(gè)過程的控制直接關(guān)系到檢測(cè)的精確性和一致性。

2.1 呼末氣體的收集裝置

呼出氣體的收集主要有兩種，一種是用氣袋直接采集呼出氣，二是利用采氣儀將呼出氣富集到裝填有Tenax的吸附管中。受試者（前者）通過吹嘴裝置將呼出氣吹入氣袋中。后者采用一個(gè)抽氣氣泵和一個(gè)流量計(jì)數(shù)器組成的采氣裝置將呼出氣體中的有機(jī)化合物吸附到吸附管中，待后續(xù)解吸和分析。比較這兩種收集方式，前者更加方便易操作，成本低，但無(wú)法排除死腔氣體的干擾；后者能有效排除死腔氣體的影響，但是成本高且操作較繁瑣。

2.2 SPME及TD

與上述氣體收集的兩種方法相對(duì)應(yīng)，用于濃縮提純呼出氣體以進(jìn)行后續(xù)分析的方法分別有固相微萃取（Solid-Phase Micro-Extraction，SPME）和熱脫附儀器（Thermal Desorption，TD）。

固相微萃取技術(shù)的原理是采用涂附不同化合物的微型熔融石英萃取纖維吸附氣體中的微量有機(jī)化合物，然后在高溫下將被吸附物質(zhì)脫附。SPME法不是將待測(cè)物全部分離出來(lái)，而是通過樣品與固相涂層之間的平衡來(lái)達(dá)到分離目的。分析時(shí)，將SPME針插入采完氣的氣袋中，在一定的溫度和一定的時(shí)間下萃取氣袋中的有機(jī)化合物，達(dá)到濃縮和提純目標(biāo)有機(jī)物的目的，萃取完畢后可從GC進(jìn)樣口直接進(jìn)樣。

熱脫附儀是對(duì)吸附在Tenax管中的物質(zhì)通過高溫加熱進(jìn)行脫附處理，然后吹掃進(jìn)后續(xù)的分析系統(tǒng)中。在熱脫附儀的脫附中，一般要采用二級(jí)吸附，達(dá)到更好的濃縮和提純的目的。加熱時(shí)，揮發(fā)物從吸附管中釋放出來(lái)，并被惰性氣流帶到低溫的捕集阱中進(jìn)行二次吸附。最后，捕集阱被快速加熱，同時(shí)用載氣吹掃，將脫附的揮發(fā)物帶入氣相色譜儀進(jìn)行分離和分析。這種二級(jí)吸附能減少峰擴(kuò)展，從而改善色譜的分離效率。

3 復(fù)雜混合氣體檢測(cè)技術(shù)與設(shè)備

復(fù)雜混合氣體的檢測(cè)能為呼出氣疾病標(biāo)識(shí)物的發(fā)現(xiàn)和臨床診斷效果的驗(yàn)證提供有效的手段，是呼出氣代謝組學(xué)研究的重要技術(shù)支撐。目前檢測(cè)呼出氣中成分的方法主要是基于氣相色譜的分離技術(shù)和質(zhì)譜檢測(cè)技術(shù)等。主要的檢測(cè)設(shè)備有：氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（GC-MS）[3]、氣相色譜-氫火焰離子化檢測(cè)器（GC-FID）[4]、氣相色譜-離子遷移譜儀（GC-IMS）[5]、選擇性離子流管質(zhì)譜檢測(cè)儀（SIFTMS）[6]、離子分子質(zhì)譜檢測(cè)儀（IMR-MS）[7]、質(zhì)子轉(zhuǎn)移反應(yīng)質(zhì)譜檢測(cè)儀（PTR-MS）[8]等。

3.1 氣相色譜

氣相色譜（Gas Chromatography，GC）檢測(cè)方法已達(dá)到皮克以下的檢測(cè)下限，且具有無(wú)可比擬的分離速度和極少的樣品量等優(yōu)點(diǎn)，因而成為分析化學(xué)領(lǐng)域中應(yīng)用最為廣泛的方法。氣相色譜以惰性氣體作為流動(dòng)相攜帶樣品混合物流過色譜柱，色譜柱中涂覆固定相物質(zhì)。樣品與固定相發(fā)生作用，在同一推動(dòng)力下，不同組分在固定相中滯留的時(shí)間不同，依次從固定相中流出。如果色譜柱中涂覆非極性材料（比如硅氧烷），則樣品中的混合物是根據(jù)其組分的沸點(diǎn)進(jìn)行分離；若涂覆極性材料則是根據(jù)組分的極性進(jìn)行分離[9]。

色譜作為一種分離技術(shù)必須聯(lián)合其他的檢測(cè)系統(tǒng)才能對(duì)各組分進(jìn)行定量檢測(cè)。氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（GC-MS）設(shè)備是檢測(cè)呼出氣中揮發(fā)性有機(jī)化合物（Volatile Organic Compounds，VOCs）最常用的儀器。GC-MS不僅是一種定性檢測(cè)的重要方法，更可以用于定量檢測(cè)，一般使用電子電離源（Electron Ionization，EI）作為電離手段。在70 eV條件下轟擊檢測(cè)分子，產(chǎn)生有規(guī)律的斷裂碎片，用于解析化合物結(jié)構(gòu)，同時(shí)對(duì)檢測(cè)未知物質(zhì)情況，可以檢索譜庫(kù)。氫火焰離子化檢測(cè)器（Flame Ionization Detector，F(xiàn)ID）是毛細(xì)管色譜儀中最常用的檢測(cè)器。其原理是將有機(jī)物在氫氣和氧氣燃燒的火焰下高溫電離，然后在高壓電場(chǎng)的定向作用下，形成離子流產(chǎn)生電信號(hào)用于定量檢測(cè)。因GC-FID對(duì)有機(jī)化合物有高靈敏度、寬線性響應(yīng)范圍、低噪聲等特點(diǎn)而成為烴類化合物的專用檢測(cè)儀器。離子遷移譜技術(shù)（IMS）工作原理是根據(jù)離子在標(biāo)準(zhǔn)大氣壓下的電場(chǎng)中遷移率的不同進(jìn)行分離。GC-IMS的聯(lián)用使混合物經(jīng)過GC分離后，以單個(gè)組分的形式進(jìn)入到IMS反應(yīng)區(qū)和電離區(qū)被電離成離子的狀態(tài)，離子在遷移區(qū)進(jìn)行二次分離后到達(dá)法拉第盤被檢測(cè)。這種聯(lián)用手段能夠提高檢測(cè)的準(zhǔn)確度。

3.2 質(zhì)譜檢測(cè)

質(zhì)譜檢測(cè)技術(shù)（MS）是依據(jù)離子質(zhì)荷比（質(zhì)量-電荷比，m/z）來(lái)檢測(cè)。其檢測(cè)過程是使樣品在離子源被電離成不同荷質(zhì)比的離子，離子經(jīng)加速電場(chǎng)形成離子束后進(jìn)入質(zhì)量分析器，因電場(chǎng)和磁場(chǎng)的作用發(fā)生相反的速度色散，被聚焦而得到質(zhì)譜圖，從而確定其質(zhì)量[10]。由檢測(cè)過程可知，質(zhì)譜檢測(cè)技術(shù)包涵電離技術(shù)、分析器技術(shù)、檢測(cè)器技術(shù)等。目前主要有4種軟電離技術(shù)：等離子體解吸（PD-MS）[11]、快原子轟擊（FAB）[12]、電噴霧（ESI）[13-15]和基質(zhì)輔助激光解吸/電離（MALDI）[16-17]。隨著科技的進(jìn)步，這4種電離技術(shù)都有一定程度的發(fā)展。在商品儀器中使用最廣泛的質(zhì)量分析器有扇形磁場(chǎng)、飛行時(shí)間質(zhì)量分析器、四極桿質(zhì)量分析器、四極桿離子阱和離子回旋共振質(zhì)量分析器。對(duì)于檢測(cè)器技術(shù)而言，質(zhì)譜有很多種檢測(cè)器，其中電子倍增管及其陣列、離子計(jì)數(shù)器、感應(yīng)電荷檢測(cè)器、法拉第收集器等是比較常見的檢測(cè)器。

選擇性離子流管質(zhì)譜檢測(cè)（SIFT-MS）是一種將初始離子（比如H3O+、NO+、O2+等）和由載氣導(dǎo)入的痕量氣體在一定時(shí)間內(nèi)進(jìn)行化學(xué)電離的技術(shù)。由于所使用的初始離子和大多數(shù)痕量氣體的分子可進(jìn)行快速反應(yīng)，因此，該檢測(cè)儀器可以用于呼吸的實(shí)時(shí)在線檢測(cè)，而且即使是虛弱的病人也可以進(jìn)行該儀器的呼吸檢測(cè)。質(zhì)子轉(zhuǎn)移反應(yīng)質(zhì)譜檢測(cè)（PTR-MS）是在SIFT-MS技術(shù)上發(fā)展起來(lái)的技術(shù)，該技術(shù)也可以用于在線檢測(cè)。它通常采用H3O+作為初始離子，通過與有機(jī)物分子的質(zhì)子轉(zhuǎn)移反應(yīng)生成準(zhǔn)分子離子，然后利用質(zhì)譜檢測(cè)技術(shù)來(lái)確定有機(jī)物的絕對(duì)濃度。除此之外，質(zhì)譜檢測(cè)技術(shù)還發(fā)展了離子分子質(zhì)譜檢測(cè)儀（IMR-MS）、多質(zhì)子吸收激光誘導(dǎo)解離質(zhì)譜（REMPI-MS）[18]、單光子電離質(zhì)譜（SPI-MS）[19]等。

4 特定標(biāo)識(shí)物的檢測(cè)技術(shù)與設(shè)備

上述對(duì)于復(fù)雜氣體檢測(cè)的技術(shù)與設(shè)備由于體積龐大，單樣品分析時(shí)間長(zhǎng)，分析成本高等缺點(diǎn)，不利于對(duì)某些特定疾病標(biāo)識(shí)物進(jìn)行快速檢測(cè)，因此根據(jù)臨床快速檢測(cè)的需求，往往需要開發(fā)成本低、分析快、疾病指標(biāo)明確的呼出氣檢測(cè)技術(shù)和設(shè)備?；趥鞲衅骷夹g(shù)的檢測(cè)設(shè)備能對(duì)單一或者特定幾種呼氣標(biāo)識(shí)物進(jìn)行快速有效、低成本檢測(cè)，以符合臨床應(yīng)用需求。

4.1 電子鼻檢測(cè)技術(shù)

電子鼻檢測(cè)技術(shù)是基于傳感器的檢測(cè)技術(shù)，目前用于檢測(cè)呼出氣的傳感器有半導(dǎo)體金屬氧化物（MOS）氣體傳感器、聲表面波（SAW）傳感器、石英晶體微天平（QCM）傳感器、納米金顆粒電阻式傳感器、色度傳感器等。利用傳感器進(jìn)行檢測(cè)具有快速、簡(jiǎn)便、低成本等特點(diǎn)。

4.1.1 MOS氣體傳感器

MOS傳感器在檢測(cè)小分子質(zhì)量的揮發(fā)性有機(jī)物時(shí)結(jié)果顯著，比如檢測(cè)氨氣、丙酮、乙醇、甲醇、異戊二烯等[20]。MOS有多種不同的器件類型，如表面電阻控制型氣敏器件、燒結(jié)型氣敏器件和體電阻控制型氣敏器件等。在某些電子鼻的設(shè)計(jì)中采用的TGS或者M(jìn)Q系列金屬氧化物半導(dǎo)體氣體傳感器都是以SnO2（Tin Dioxide）作為敏感材料，并以厚膜工藝加工制造而成的。

4.1.2 基于壓電材料的氣體傳感器

SAW傳感器[21]和QCM傳感器[22]都屬于質(zhì)量敏感型壓電傳感器，可用于檢測(cè)大分子質(zhì)量的揮發(fā)性有機(jī)物。但由于SAW的基頻可以達(dá)到GHZ的水平，遠(yuǎn)大于QCM的幾十MHz，所以SAW傳感器比QCM傳感器的檢測(cè)下限更低，更為靈敏。其次不管是SAW還是QCM，其本身對(duì)氣體不具有選擇性，需要依賴于表面涂覆物質(zhì)的性質(zhì)來(lái)表示選擇性。

4.1.3 納米金顆粒電阻式傳感器

納米金顆粒電阻式傳感器的工作原理是在不同氣體環(huán)境中傳感器的電阻特性會(huì)發(fā)生改變[23]。由于其在叉指之間沉積的納米金顆粒中的金屬物質(zhì)提供電導(dǎo)，而金屬表面的不導(dǎo)電有機(jī)配體則提供與有機(jī)氣體分子結(jié)合的位點(diǎn)，故其選擇性可以通過調(diào)整有機(jī)配體或者官能團(tuán)來(lái)實(shí)現(xiàn)與待檢測(cè)特異性氣體的結(jié)合。

4.1.4 色度傳感器

與傳統(tǒng)的檢測(cè)電信號(hào)的傳感器不同的是，色度傳感器通過檢測(cè)光的特性來(lái)確定物質(zhì)[24]。其原理是當(dāng)基底上的敏感材料與化學(xué)物質(zhì)結(jié)合時(shí)發(fā)生顏色的變化，通過進(jìn)行前后對(duì)比其顏色種類、深淺度等來(lái)確定物質(zhì)類別。這樣不僅可以省略傳統(tǒng)傳感器后續(xù)的復(fù)雜電路，更使測(cè)量結(jié)果直觀易懂。

同時(shí)為了提高傳感器的靈敏度，以上所列的傳感器基本都是以傳感器陣列的形式集成在同一芯片上對(duì)呼出氣進(jìn)行檢測(cè)，通過對(duì)傳感器陣列測(cè)得的混合氣體物質(zhì)信號(hào)進(jìn)行解碼分析得到物質(zhì)成分及其濃度。這種采用模式識(shí)別進(jìn)行信號(hào)處理的方法被形象地稱為“電子鼻”[25-26]。基于傳感器檢測(cè)技術(shù)研發(fā)的電子鼻是一種快速檢測(cè)的新型設(shè)備。與傳統(tǒng)的GC-MS檢測(cè)相比雖然檢測(cè)物的范圍受限于傳感器類型的選擇，但是檢測(cè)時(shí)間和檢測(cè)速度方面均有較大提升。

4.2 基于光學(xué)原理的呼吸檢測(cè)技術(shù)與設(shè)備

激光光譜技術(shù)是一種可以檢測(cè)超低濃度的高分辨率檢測(cè)技術(shù)。其檢測(cè)過程是以激光作為光源，將待檢測(cè)物注入光腔中，當(dāng)激光通過光腔會(huì)被特定物質(zhì)所吸收，于是在檢測(cè)器端通過檢測(cè)激光被吸收的量來(lái)確定物質(zhì)的濃度[27-28]。相比于傳統(tǒng)的檢測(cè)方法，其優(yōu)勢(shì)不僅在于可以進(jìn)行實(shí)時(shí)檢測(cè)，而且可以省去檢測(cè)樣品進(jìn)行類似離子化的處理過程。

基于激光光譜技術(shù)發(fā)展起來(lái)的技術(shù)包括腔衰蕩光譜（Cavity Ring-Down Spectroscopy，CRDS）技術(shù)[29]、腔增強(qiáng)光譜（Cavity-Enhanced Spectroscopy，CES）技術(shù)[30]、腔漏光譜（Cavity Leak-out Spectrometer，CLS）技術(shù)[31]，法拉第調(diào)制光譜（Faraday Modulation Spectroscopy，F(xiàn)MS）技術(shù)[32]等。由于目前的激光光譜檢測(cè)系統(tǒng)的多樣性和復(fù)雜性，目前還難以廣泛應(yīng)用于臨床研究。但仍有不少研究使用激光光譜技術(shù)檢測(cè)呼出物中的氨氣、乙烷、甲醛、乙醛、氮氧化合物等[33-34]。由于其具有高光譜分辨率、高時(shí)間分辨率、高空間分辨率、高激發(fā)選擇性、高分析靈敏度以及測(cè)試效率等優(yōu)點(diǎn)，激光光譜學(xué)技術(shù)擁有巨大的潛力。在未來(lái)的發(fā)展中，該技術(shù)一定會(huì)是呼氣檢測(cè)的重要手段之一。

5 呼出氣中冷凝物的檢測(cè)技術(shù)和設(shè)備

呼出物的檢測(cè)除了直接對(duì)氣體進(jìn)行檢測(cè)，還有針對(duì)呼出氣體冷凝物（Exhaled Breath Condensate，EBC）的檢測(cè)[35]。研究發(fā)現(xiàn)，氣道黏膜液、相對(duì)分子質(zhì)量較小的蛋白質(zhì)和揮發(fā)性物質(zhì)會(huì)在安靜的呼吸中一起被呼出，所以EBC中含有微量蛋白質(zhì)[36-37]、DNA[38-39]、MicroRNA[40]等物質(zhì)，而這些物質(zhì)也能一定程度的反映人體的健康狀態(tài)。所以近些年國(guó)內(nèi)外也掀起一股EBCs檢測(cè)研究的熱潮。

5.1 EBC的收集技術(shù)和設(shè)備

EBC指的是在通過冷凝呼出氣得到的低揮發(fā)或者不揮發(fā)的物質(zhì)，所以EBC的收集原理就是冷凝技術(shù)。正常的呼出氣溫度大約是37 ℃，且充滿了水蒸氣，當(dāng)外界溫度降到-10 ℃，93.7%的水蒸氣會(huì)變成冷凝物，且非揮發(fā)性物質(zhì)會(huì)被冷凝在其中。

市場(chǎng)上現(xiàn)有的EBC收集器有4種，分別是德國(guó)Eric Jaeger公司生產(chǎn)的EcoScreen?收集器[41]、美國(guó)Respiratory Research生產(chǎn)的RTube?[42]、意大利MediVac公司生產(chǎn)的TurboDeccs[43]以及西班牙Biostec公司生產(chǎn)的Anacon[44]收集器。其中前兩種被使用的比較多，第一種具有較為精確的收集效果但體積較大，第二種則是面向于家庭和社區(qū)，輕巧便攜。研究表明不同的收集器的收集效果差距很大[45]，由不同收集器收集的EBCs之間沒有可比性。

5.2 EBCs的檢測(cè)技術(shù)和設(shè)備

對(duì)于檢測(cè)EBC中的蛋白質(zhì)，采用多是基于標(biāo)記免疫分析技術(shù)，包括放射性免疫分析（RIA）法[46-47]、酶免疫分析（EIA）法[48-49]、化學(xué)發(fā)光免疫分析（CLIA）法[50-51]以及時(shí)間分辨熒光免疫分析（TRFIA）法[52-53]。

RIA的原理是使放射性標(biāo)記抗原和未標(biāo)記抗原（待測(cè)物）與不足量的特異性抗體競(jìng)爭(zhēng)性地結(jié)合，反應(yīng)后分離并測(cè)量放射性，從而求得未標(biāo)記抗原的量。雖然RIA操作簡(jiǎn)便、成本低，但其具有放射性污染問題。為了解決放射性的問題，EIA、CLIA等技術(shù)發(fā)展起來(lái)并得到廣泛的應(yīng)用。EIA是一種非放射性標(biāo)記免疫分析技術(shù)，以酶標(biāo)記抗原或抗體作為示蹤物，由高活性的酶催化底物顯色或發(fā)光，達(dá)到定量分析的目的。EIA不僅操作簡(jiǎn)便，不污染環(huán)境，而且酶標(biāo)記物十分穩(wěn)定，有效期長(zhǎng)，所以應(yīng)用范圍廣泛。其中，酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法（ELISA）[54]是EIA的主要方法之一。同樣的，CLIA也是一種非放射性標(biāo)記免疫分析技術(shù)，包涵免疫反應(yīng)系統(tǒng)和化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)。其原理是用化學(xué)發(fā)光劑直接標(biāo)記抗原或抗體，標(biāo)記后的抗原與抗體經(jīng)免疫反應(yīng)后加入起動(dòng)發(fā)光的試劑，通過檢測(cè)光強(qiáng)度來(lái)檢測(cè)待測(cè)物的含量?；瘜W(xué)發(fā)光酶免疫（CLEIA）分析、增強(qiáng)發(fā)光酶免疫（ELEIA）分析等都是對(duì)CLIA技術(shù)的發(fā)展。此外，CLIA的自動(dòng)化檢測(cè)的實(shí)現(xiàn)也極大地提高了檢測(cè)效率，降低了人為誤差。雖然EIA和CLIA不具有放射性問題，但其靈敏度不能夠同RIA匹敵。為解決這個(gè)問題，TRFIA應(yīng)運(yùn)而生，它也是一種非放射性免疫技術(shù)且其靈敏度可以與RIA媲美。TRFIA用鑭系金屬離子（比如Eu3+、Tb3+和Sm3+）作為示蹤物標(biāo)記抗原或抗體，然后與其螯合劑、增強(qiáng)液一起經(jīng)過免疫反應(yīng)后，用時(shí)間分辨熒光儀測(cè)定最后產(chǎn)物中的熒光強(qiáng)度，根據(jù)熒光強(qiáng)度和相對(duì)熒光強(qiáng)度比值，確定待測(cè)物的濃度。與CLIA一樣，TRFIA也實(shí)現(xiàn)了自動(dòng)化的檢測(cè)。除了這4種基本的標(biāo)記免疫方法，還有報(bào)道采用液相色譜質(zhì)譜（LCMS）[55]、基于場(chǎng)效應(yīng)晶體管（FET）的生物傳感器[56]、雙色熒光的量子點(diǎn)[57]、基于樂輔波聲表面波的免疫傳感器[58]等方法進(jìn)行蛋白質(zhì)的檢測(cè)。

此外，對(duì)于檢測(cè)EBC中的DNA采用的多為PCR擴(kuò)增聯(lián)合基因檢測(cè)技術(shù)。而MicroRNA的擴(kuò)增技術(shù)有逆轉(zhuǎn)錄PCR技術(shù)[59]、RNA印跡法[60]、RNA原位雜交[61]等，其檢測(cè)技術(shù)有單分子測(cè)序[62]、表面增強(qiáng)拉曼光譜[63]、表面等離子體共振光譜[64]、納米機(jī)械傳感[65]以及單銀納米顆粒計(jì)數(shù)[66]等。

6 總結(jié)與展望

隨著人們生活水平的提高，對(duì)健康監(jiān)測(cè)的需求也越來(lái)越大，呼氣檢測(cè)作為快速無(wú)損的檢測(cè)手段在市場(chǎng)上得到很大的青睞。對(duì)于呼氣的氣體檢測(cè)，一些傳統(tǒng)的檢測(cè)方法不僅效率低、速度慢，而且費(fèi)用高，但分析精度高，適合用于分析一些復(fù)雜混合物的成分。一旦各項(xiàng)研究確定某些和機(jī)體的疾病或者紊亂相關(guān)的標(biāo)志物，采用傳感器為基礎(chǔ)的呼氣檢測(cè)設(shè)備來(lái)檢測(cè)具體的標(biāo)志物是一種選擇趨勢(shì)，不僅速度快，而且費(fèi)用低，同時(shí)也能保證一定的準(zhǔn)確率。當(dāng)呼氣檢測(cè)應(yīng)用于家庭社區(qū)等場(chǎng)合，呼氣檢測(cè)設(shè)備需要更加便攜易操作；而當(dāng)其應(yīng)用于臨床監(jiān)測(cè)，則需要實(shí)現(xiàn)在線實(shí)時(shí)檢測(cè)。

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Progress in Technology and Equipment of Exhaled Breath Detection

LIN Li-quan, DONG Hao, WANG Fu-yuan, CHEN Xing
College of Biomedical Engineering and Instrument Science, Zhejiang University, Hangzhou Zhejiang 310027, China

As an important physiological process for human beings, breathing is one of the most important ways to exchange substances between the human body environment and the outside world. Various studies suggested that the type and concentration of the exhaled breath that contains a large number of metabolic products, have close relationships with human health. Nitric oxide, one kind of exhaled gas, is an internationally recognized molecular markers of airway inflammation. Through detecting the exhaled markers, we can promptly detect the body's health condition, and monitor the occurrence and development of diseases, so as to achieve the purpose of disease prevention. Due to the non-invasive, exhaled breath detection technology and equipment emerged in large numbers both at home and abroad.

R318.6

A

10.3969/j.issn.1674-1633.2016.02.003

1674-1633(2016)02-0011-07

2015-11-10

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（No.81201166，No.81571769）；教育部博士點(diǎn)基金項(xiàng)目（No.20120101120165）。

陳星，副教授，博士生導(dǎo)師。

通訊作者郵箱：cnxingchen@zju.edu.cn

Abstract:: exhaled breath detection; gas sensors; electronic nose; gas chromatography mass spectrography; immunoassay