蠶絲蛋白對磷酸鈣顆粒釋藥的影響

王欣宇，劉洪卓，宋立娜，李三鳴

（沈陽藥科大學(xué) 藥學(xué)院，遼寧 沈陽 110016）

蠶絲蛋白對磷酸鈣顆粒釋藥的影響

王欣宇，劉洪卓，宋立娜，李三鳴*

（沈陽藥科大學(xué) 藥學(xué)院，遼寧 沈陽 110016）

目的研究蠶絲蛋白對磷酸鈣顆粒中吸附的牛血清白蛋白釋放的影響。方法CaCl2法提取蠶絲蛋白；用反向微乳化法制備磷酸鈣顆粒；以牛血清白蛋白（BSA）為模型藥物，以蠶絲蛋白為控釋材料，探索溫度、BSA加入量、pH值、蠶絲蛋白質(zhì)量濃度對顆粒吸附的影響，同時(shí)測定磷酸鈣顆粒中BSA的釋放度。結(jié)果溫度對BSA的吸附量無明顯影響，但隨加入BSA的量增加，其吸附量先增大后減小；介質(zhì)pH值增大時(shí)BSA的吸附量降低。蠶絲蛋白與BSA在顆粒表面相互作用后，吸附量明顯降低，隨著蠶絲蛋白質(zhì)量濃度增加，BSA在磷酸鈣顆粒上的吸附量也略有下降，同時(shí)釋放速度減慢。結(jié)論蠶絲蛋白在特定質(zhì)量濃度下可以有效控制磷酸鈣顆粒中BSA的釋放。

藥劑學(xué)；控制釋放；CaCl2法；反向微乳化法；蠶絲蛋白；磷酸鈣(CaP)顆粒；牛血清白蛋白

骨缺損主要是由于先天性骨疾病及后天感染、創(chuàng)傷、腫瘤切除等原因?qū)е碌?，?yán)重影響人們的生活和健康，骨移植是目前臨床上最常用的治療骨缺損的方法。磷酸鈣顆粒的主要成分是羥基磷灰石，與人體骨組織中最主要的無機(jī)成分相同，因此與骨組織具有良好的生物相容性，可用作骨缺損的治療。但是作為藥物載體，存在釋放初期突釋的問題，限制其應(yīng)用。蠶絲蛋白作為一種生物可降解的天然蛋白，其獨(dú)特的線團(tuán)結(jié)構(gòu)可以在粒子表面形成擴(kuò)散的阻滯層，從而延緩藥物的快速釋放，故而具有優(yōu)良的緩釋功能[1-3]；另外，蠶絲蛋白含有大量氨基酸殘基，具有化學(xué)反應(yīng)的潛在反應(yīng)位點(diǎn)[4-6]，因此可與許多物質(zhì)發(fā)生相互作用。

本文作者使用反向微乳化法制備磷酸鈣空白顆粒[7]，作為模型蛋白藥物的載體，以蠶絲蛋白為控釋材料，以牛血清白蛋白為模型藥物，考察磷酸鈣顆粒吸附牛血清白蛋白的影響因素，同時(shí)研究不同質(zhì)量濃度蠶絲蛋白對載牛血清白蛋白磷酸鈣顆粒的體外釋放的影響，從而為其作為蛋白藥物緩釋載體提供理論基礎(chǔ)。

1 儀器與材料

JA2003A電子天平（上海精密電子儀器有限公司），CPA225D電子天平（德國Sartorius公司），DZF-150恒溫真空干燥箱（河南省太康縣教材儀器廠），SHB-III循環(huán)水式多用真空泵（鄭州長城科工貿(mào)有限公司），DF-101S集熱式恒溫磁力攪拌器（鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司），PSH-3D pH計(jì)（上海雷磁公司），LS32激光衍射粒度分析儀（美國Beckman Coulter公司），Nano ZS激光粒度儀（英國馬爾文儀器公司），LDZ4-0.8離心機(jī)（北京醫(yī)用離心機(jī)廠），IX71S8F-3熒光顯微鏡(沈陽禾光科技有限公司Olympus遼寧總代理)，Mx3000P酶標(biāo)儀(美國Thermo SCIENTIFIC公司)。

Tween 85（分析純，北京百靈威科技有限公司），環(huán)己烷、碳酸鈉（分析純，天津博迪化工股份有限公司），磷酸氫二鈉、氫氧化鈉（分析純，天津瑞金特化學(xué)品有限公司），氯化鈣（分析純，天津北方天醫(yī)化學(xué)試劑廠），磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀（分析純，西隴化工股份有限公司），乙醇（分析純，天津富宇精密化工有限公司），甲醇（分析純，山東禹王實(shí)業(yè)有限公司化工分公司），蠶繭（桑蠶繭，廣西柳城縣蠶繭公司），牛血清白蛋白（bovine serum albumin, BSA）、異硫氰酸熒光素（fluorescein isothiocyanate, FITC）和異硫氰酸羅丹明-B（rhodamine B isothiocyanate, Rh-B）（西格瑪奧德里奇（上海）貿(mào)易有限公司），二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）蛋白濃度測定試劑盒（碧云天生物科技研究所）。

2 方法

2.1 蠶絲蛋白的提取及熒光標(biāo)記

將去除蠶蛹的干蠶繭剪成1 cm2左右的碎片，烘干備用。取備用蠶繭1 g，置于15 mL濃度為20 mmol·L-1Na2CO3溶液中，沸水浴脫膠60 min后，抽濾，洗凈，40 ℃烘干。將脫膠蠶絲置于8 mL CaCl2-水-乙醇 ( n∶n∶n = 1∶8∶2)溶液中，70 ℃下攪拌2 h后，4 000 r·min-1離心5 min，透析除去雜質(zhì)，即得蠶絲蛋白溶液[8]。

用FITC對蠶絲蛋白進(jìn)行熒光標(biāo)記，研究蠶絲蛋白對磷酸鈣的包衣過程。方法如下：避光條件下，稱取FITC 1.0 mg，溶于1 mL碳酸鹽緩沖溶液（pH值9.2）中，同時(shí)用pH值7.4的PBS溶液稀釋蠶絲蛋白溶液至20 g·L-1，取5 mL與上述FITC碳酸鹽緩沖溶液混勻，室溫條件下攪拌3 h。將混合液置于4 ℃冰箱中反應(yīng)12 h。透析法除去游離的FITC，冷凍干燥，即得熒光標(biāo)記的蠶絲蛋白。

2.2 磷酸鈣顆粒的制備與表征

采用反向微乳法制備磷酸鈣顆粒。量取Tween 85 2.2 mL和環(huán)己烷12.7 mL，混勻，得油相；將油相兩等分，50 ℃下、分別滴入25 mmol·L-1Na2HPO4水溶液2.5 mL、0.5 mol·L-1CaCl2水溶液2.5 mL，攪拌，形成W/O乳液。攪拌條件下合并上述乳液，20 min后，室溫靜置待沉淀析出，棄上清，用乙醇和水反復(fù)清洗磷酸鈣顆粒，真空干燥，即得磷酸鈣顆粒。

熒光顯微鏡下觀察RhB-BSA及FITC-蠶絲蛋白在顆粒表面的吸附分布。BSA的標(biāo)記方法同蠶絲蛋白的標(biāo)記方法。于25 ℃下，將顆粒超聲分散后，分別采用LS32激光衍射粒度分析儀和 Nano ZS激光粒度儀測定粒子粒徑及zeta 電位。同法測定顆粒吸附BSA以及經(jīng)蠶絲蛋白包裹后粒徑和電位的變化。

2.3 磷酸鈣顆粒對BSA的吸附作用

2.3.1 吸附溫度及BSA的加入量對吸附的影響

取0.5 g·L-1磷酸鈣顆粒混懸液1.0 mL，加入不同體積的1.0 g·L-1BSA溶液，使磷酸鈣顆粒與BSA的質(zhì)量比分別為1∶0.1、1∶0.2、1∶0.3、1∶0.5、1∶0.6、1∶1.0、1∶1.4和1∶1.8，用去離子水定容至5.0 mL，室溫下攪拌16 h。離心，BCA法[9]測定上清液中BSA的含量，BSA加入總量減去上清液中BSA含量即為BSA的吸附量。依據(jù)下式計(jì)算顆粒中BSA的載藥量和有效吸附率：

其中：wa為BSA載藥量，wd為BSA有效吸附率，mb為顆粒吸附的蛋白質(zhì)量，mc為加入的空白顆粒質(zhì)量，me為加入蛋白總質(zhì)量。

2.3.2 吸附介質(zhì)pH值對吸附的影響

取0.5 g·L-1磷酸鈣顆?；鞈乙?.0 mL，加入1.0 g·L-1BSA溶液0.5 mL，用pH值5.8的PBS溶液、水、pH值7.4的PBS溶液和pH值8.5的PBS溶液定容至5.0 mL，余下操作同“2.3.1”條。

2.3.3 蠶絲蛋白對BSA吸附的影響

取20.0 mg磷酸鈣顆粒，分散于20 mL水中，避光下加入RhB-BSA 10.0 mg，攪拌16 h，離心，水洗、真空干燥，即得載BSA的磷酸鈣顆粒。

精密稱定上述載BSA的磷酸鈣顆粒2.0 mg，置于10 mL具塞玻璃離心管中，加入蠶絲蛋白溶液，使其質(zhì)量濃度分別為0.5、1.0和2.0 g·L-1，緩慢振搖15 min，離心，取上清液作為供試液；以540 nm為激發(fā)波長、625 nm為發(fā)射波長，測定供試液的熒光強(qiáng)度，計(jì)算蠶絲蛋白溶液中的游離BSA質(zhì)量濃度。將沉淀水洗后真空干燥，即得不同質(zhì)量濃度蠶絲蛋白包裹的載BSA的磷酸鈣顆粒。

2.4 磷酸鈣顆粒中BSA的釋放考察

精密稱定經(jīng)質(zhì)量濃度0.5、1.0和2.0 g·L-1蠶絲蛋白包裹的載BSA的磷酸鈣顆粒2.0 mg，置于具塞玻璃試管中，加入釋放介質(zhì)2 mL，在37 ℃、100 r·min-1下震蕩，于不同時(shí)間取釋放介質(zhì)100 μL，測定BSA的質(zhì)量濃度，并計(jì)算蛋白的累積釋放度。

3 結(jié)果與討論

3.1 顆粒的制備與表征

反向微乳法制備的磷酸鈣顆粒平均粒徑為13.39 μm，粒徑主要分布在4～27 μm內(nèi)，顆粒表面帶有負(fù)電荷，zeta電位為-9.19 mV，顆粒吸附BSA后，粒徑無明顯變化，zeta電位降至-11.30 mV；1 g·L-1蠶絲蛋白包裹吸附BSA的顆粒后，粒徑增加1.7 μm，電位無明顯變化，為-11.05 mV。如圖1所示，載RhB-BSA磷酸鈣顆粒經(jīng)FITC-蠶絲蛋白處理后，兩種蛋白均勻分布在顆粒表面（圖1A、B），且蠶絲蛋白起到了一定的包裹功能（圖1C），有利于控制BSA的釋放。

Fig. 1 The distribution of RhB-BSA(A) and FITC-silk fibroin(B) on CaP microparticles圖 1 RhB-牛血清白蛋白(A) 及 FITC-蠶絲蛋白(B)在磷酸鈣顆粒表面的分布

3.2 磷酸鈣顆粒對BSA吸附的影響因素

3.2.1 吸附溫度及BSA的加入量對磷酸鈣顆粒吸附BSA總量的影響

選取20、30和40 ℃條件研究溫度對磷酸鈣顆粒吸附BSA總量的影響。選取磷酸鈣顆粒與BSA的質(zhì)量比分別為1∶0.1、1∶0.2、1∶0.3、1∶0.5、1∶0.6、1∶1.0、1∶1.4和1∶1.8的條件研究BSA加入量對磷酸鈣顆粒吸附BSA總量的影響。結(jié)果表明，BSA在磷酸鈣顆粒表面的吸附行為在不同溫度下相似，無明顯差異，40 ℃下載藥量為34.69%、有效吸附率為88.52%，20 ℃下載藥量為32.56%、有效吸附率為80.49%，30 ℃下載藥量為33.52%、有效吸附率為84.08%（圖2）。結(jié)果提示，BSA在顆粒表面的吸附主要是靜電吸附，溫度對其無影響。吸附量隨BSA的加入量增大先增大后減小，在BSA的量為600 μg時(shí)達(dá)到最大。如圖2B所示，不同溫度下BSA的利用率無顯著差異，但隨BSA的加入（低于600 μg）藥物有效吸附率先緩慢下降，后呈快速下降趨勢。BSA的加入量較大時(shí)，由于分子間相互作用，形成多聚體的趨勢大于吸附于顆粒表面的趨勢，更能降低BSA分子的能量，因此，當(dāng)BSA的加入量太高時(shí)，蛋白載入量反而降低，有效吸附率降低加快。

Fig. 2 The drug loading and absorption efficiency of BSA with different concentration of BSA under given temperatures (±s, n=3)圖 2 BSA的加入量對磷酸鈣顆粒吸附BSA的影響(±s, n=3)

3.2.2 吸附介質(zhì)pH值對吸附的影響

配制一系列不同pH值的磷酸鹽緩沖溶液作為吸附過程的介質(zhì)，研究介質(zhì)pH值對BSA吸附量的影響。從圖3看出，介質(zhì)的pH值影響B(tài)SA的吸附，且在考察的介質(zhì)pH值范圍內(nèi)，pH值越高（5.8, water, 7.4, 8.5）BSA的吸附越少（分別為27.27%, 20.79%, 14.29%, 10.65%）。這是因?yàn)榻橘|(zhì)pH值越高，BSA分子帶負(fù)電增多（pH＞PI, PIBSA=4.6），同時(shí)，顆粒表面所帶負(fù)電進(jìn)一步增強(qiáng)，pH值為5.8、7.4和8.5磷酸鹽緩沖溶液中顆粒的zeta電位分別為-12.30、-19.35和-25.35 mV；結(jié)果是蛋白和顆粒之間的排斥力增大，致使蛋白在磷酸鈣顆粒表面的吸附隨著pH升高而降低。

Fig. 3 The loading of BSA in CaP microparticles in various solutions with different pH (± s, n= 3)圖 3 介質(zhì)PH對磷酸鈣顆粒吸附BSA的影響(± s, n= 3)

3.2.3 蠶絲蛋白對BSA吸附的影響

調(diào)節(jié)包裹顆粒所需蠶絲蛋白的質(zhì)量濃度，研究吸附BSA的磷酸鈣顆粒經(jīng)過不同質(zhì)量濃度蠶絲蛋白包裹的過程中，蠶絲蛋白的加入量對顆粒吸附BSA總量的影響，計(jì)算不同條件下的BSA吸附總量。由如圖4可知，未加入蠶絲蛋白前吸附量為26.64%，加入蠶絲蛋白后BSA的吸附量明顯降低。另外，隨著蠶絲蛋白質(zhì)量濃度升高，顆粒表面BSA吸附量也略有下降（分別為 18.00%、 16.65% 和15.03% ）。這主要是由于兩種蛋白具有同種電荷[10]，吸附介質(zhì)中的蠶絲蛋白以無規(guī)則線團(tuán)的溶脹形式為主，側(cè)基基團(tuán)暴露在外部，部分基團(tuán)吸附在磷酸鈣顆粒表面，與BSA形成競爭，此過程中顆粒表面吸附的BSA發(fā)生解吸附，導(dǎo)致吸附量降低。蠶絲蛋白質(zhì)量濃度越高，顆粒表面競爭作用越大，但是，蠶絲蛋白在顆粒表面會形成一定厚度包裹層，解吸附的BSA 在此過程中被重新帶入包裹層。蠶絲蛋白包裹過程與解吸附過程動態(tài)變化，表觀表現(xiàn)為隨著蠶絲蛋白溶液質(zhì)量濃度的增加，BSA吸附量略有降低。

Fig. 4 The influence of silk fibroin concentration on the loading efficiency of BSA(±s, n=3)圖 4 蠶絲蛋白濃度對磷酸鈣顆粒吸附BSA的影響(±s, n=3)

3.3 蠶絲蛋白質(zhì)量濃度對BSA的釋放影響

在pH＞5的條件下，蠶絲蛋白與BSA帶有同種電荷，競爭吸附磷酸鈣顆粒表面有限的吸附位點(diǎn)，因此，在BSA釋放的過程中也會有所影響。

從30 d的釋放曲線來看（圖5 A），各組在前3天有一個(gè)快速釋放的過程，后發(fā)生一個(gè)短期的遲滯現(xiàn)象；隨后，由于各組蠶絲蛋白質(zhì)量濃度增加，BSA釋放速度逐漸降低。為研究前期突釋過程的差異，從圖5 B可以看出，0.5 g·L-1蠶絲蛋白處理的顆粒，釋放速度高于未經(jīng)蠶絲蛋白處理的磷酸鈣顆粒，2.0 g·L-1蠶絲蛋白處理的磷酸鈣顆粒釋放速度最緩慢。這是因?yàn)榈唾|(zhì)量濃度的蠶絲蛋白不能有效覆蓋磷酸鈣顆粒表面，無法形成完整的包衣層，顆粒表面的部分吸附位點(diǎn)被蠶絲蛋白吸附，產(chǎn)生了敏化作用，導(dǎo)致低質(zhì)量濃度蠶絲蛋白促進(jìn)BSA的釋放。

Fig. 5 The effect of silk fibroin on the release of BSA from CaP microparticle(±s, n=3)圖 5 絲素蛋白質(zhì)量濃度對磷酸鈣顆粒釋放BSA的影響(±s, n=3)

4 結(jié)論

以BSA為模型蛋白，測定了磷酸鈣顆粒在不同BSA質(zhì)量濃度、溫度、pH值條件下的吸附量。蠶絲蛋白的加入會與BSA形成競爭，使BSA吸附量降低。

在實(shí)驗(yàn)范圍內(nèi)，控制釋放的蠶絲蛋白質(zhì)量濃度達(dá)到2.0 g·L-1，磷酸鈣顆粒中BSA的釋放減慢。

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The effect of silk fibroin on drug release properties of calcium phosphate particles

WANG Xinyu, LIU Hongzhuo, SONG Lina, LI San-ming*
(School of Pharmacy, Shenyang Pharmaceutical University, Shenyang 110016, China)

ObjectiveTo study the release kinetics of calcium phosphate (CaP) microparticles, with different concentration of fibroin coatings.MethodsThe silk fibroin was extracted using CaCl2method;The CaP microparticles were prepared using reversed micro-emulsion method. With bovine serum albumin (BSA) as the model drug and silk fibroin as coating material, we studied the influence of factors (such as pH value, ionic strength, silk fibroin concentration) on the process of adsorption to the CaP microparticles and the release properties of BSA from CaP microparticles were evaluated.ResultsTemperature had no obvious effect on the adsorption quantity of BSA on calcium phosphate particles. The quality of added BSA increased, loading quantity initially increased then decreased. Adsorption amount of BSA reduced apparently as CaP microparticles interacted with silk fibroin. The loading amount was slightly lower and release ratewasslower when the silk fibroin concentration was higher.ConclusionIn the range of measurement, the release of BSA from CaP microparticles can be effectively controlled by silk fibroin at certain concentration.

pharmaceutics; controlled release; CaCl2method; reversed micro-emulsion method; silk fibroin; calcium phosphate(CaP) particles; bovine serum albumin (BSA)

（2016）04–0135–08

10.14146/j.cnki.cjp.2016.04.004

(本篇責(zé)任編輯：趙桂芝)

2015–04–30

王欣宇(1991–), 女(漢族), 山東棗莊人, 碩士研究生,E-mailwangxinyusd@163.com; *

李三鳴(1957–), 男(漢族), 遼寧開原人, 教授, 博士, 博士生導(dǎo)師, 主要從事藥物緩控釋制劑的研究,Tel.024-23896258,E–mail li_sanming@sina.com。