抗金黃色葡萄球菌的響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計

李素瓊

(武夷學(xué)院 生態(tài)與資源工程學(xué)院，福建 武夷山 354300)

抗金黃色葡萄球菌的響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計

李素瓊

(武夷學(xué)院 生態(tài)與資源工程學(xué)院，福建 武夷山 354300)

采用載銅活性炭對金黃色葡萄球菌進(jìn)行抗菌測試。試驗以抗菌率為響應(yīng)目標(biāo)，通過單因素實驗、Plackett-Burman(PB)設(shè)計和Box-Behnken Design(BBD)中心組合設(shè)計對載銅活性炭抗菌率的5個因素進(jìn)行篩選優(yōu)化；以抗菌率為響應(yīng)目標(biāo)，對振蕩時間、振蕩溫度、載銅活性炭質(zhì)量和轉(zhuǎn)數(shù)四因素進(jìn)行BBD設(shè)計，確定抗菌測試的最佳工藝條件為振蕩時間2.5h、振蕩溫度60℃、載銅活性炭質(zhì)量2.25g、轉(zhuǎn)數(shù)250r/min，抗菌率達(dá)100 %。

載銅活性炭；金黃色葡萄球菌；抗菌率；響應(yīng)面

隨工農(nóng)業(yè)的快速發(fā)展，環(huán)境問題日益嚴(yán)重，水質(zhì)惡化和空氣污染威脅著人類健康。活性炭由于其優(yōu)越的吸附和催化性能，以及良好的耐酸堿性，在環(huán)境治理中發(fā)揮著越來越重要的作用，是一種高效而安全的凈化水的材料[1-2]。在飲用水處理中，由于活性炭表面的疏水性，且比表面積巨大，因而可有效去除水體中的有機(jī)物和部分無機(jī)雜質(zhì)。然而，在凈化水的過程中，細(xì)菌很容易在活性炭表面繁殖，使活性炭本身也成了污染物，從而影響凈水效果[3-4]。研究表明，活性炭載銅后不僅可吸附自來水中的有機(jī)物和部分無機(jī)雜質(zhì)，還可抑制細(xì)菌的生長繁殖。

單因素測試時，考慮氯化銅濃度、振蕩時間、振蕩溫度、載銅活性炭的質(zhì)量等操作參數(shù)對抗菌率的影響；根據(jù)Plackett-Burman和單因素實驗結(jié)果所確定的實驗因素，采用Box-Behnken組合設(shè)計進(jìn)一步將振蕩時間、振蕩溫度、載銅活性炭質(zhì)量、轉(zhuǎn)數(shù)四個因素進(jìn)行優(yōu)化，設(shè)置高、中、低三個水平，并進(jìn)行試驗驗證分析，最終確定各因素的最佳工藝條件[5]。

1 材料與方法

1.1 主要材料

金黃色葡萄球菌

1.2 實驗方法

通過單因素、Plackett-Burman設(shè)計和中心組合設(shè)計(BBD)，考察氯化銅濃度、振蕩時間、振蕩溫度、轉(zhuǎn)數(shù)以及載銅活性炭的質(zhì)量等操作參數(shù)對抗菌率的影響，并根據(jù)響應(yīng)面法原理，對相關(guān)影響因素進(jìn)行試驗優(yōu)化設(shè)計，并進(jìn)行試驗驗證分析，確定制備抗菌的最佳工藝條件。

1.3 單因數(shù)實驗

以金黃色葡萄球菌為原料，采用載銅氯化銅為抗菌載體，考慮振蕩時間、振蕩溫度、轉(zhuǎn)數(shù)以及載銅活性炭的質(zhì)量等操作參數(shù)對抗菌率的影響。

1.4 試驗優(yōu)化

試驗先利用Plackett-Burman實驗設(shè)計篩選出關(guān)鍵影響因子，然后在單因數(shù)試驗和Plackett-Burman實驗設(shè)計的基礎(chǔ)上，利用Box-Behnken設(shè)計來對影響活性炭的抗菌率進(jìn)行優(yōu)化[5]。

1.5 抗菌實驗

圖1 抗菌測試流程圖

具體步驟為：取30ml菌懸液，加一定質(zhì)量的負(fù)載銅活性炭；將其置于恒溫振蕩器，設(shè)置一定轉(zhuǎn)數(shù)及溫度；振蕩一定時間后，取樣0.5ml，加入到4.5mlPBS緩沖液中分散均勻。再進(jìn)行稀釋，稀釋6次；設(shè)置三個平行樣，各取懸液0.1ml，滴加在固體培養(yǎng)基上，用刮鏟涂均勻，放置1h；放入培養(yǎng)箱，30℃倒置培養(yǎng)24h，觀察菌落生長情況。選取空白活性炭作為負(fù)載銅活性炭的參比樣。

2 實驗結(jié)果

2.1 單因素實驗

2.1.1 震蕩時間的選擇

完成振蕩溫度30℃，轉(zhuǎn)數(shù)200r/min，載銅活性炭為2g，震蕩時間不同的抗菌測試。表1為進(jìn)行試驗的條件及結(jié)果。

表1 不同震蕩時間完成的抗菌測試結(jié)果

圖1 不同震蕩時間完成的抗菌測試結(jié)果

圖2 不同震蕩溫度完成的抗菌測試結(jié)果

2.1.2 不同震蕩溫度的選擇

完成振蕩時間為1h，轉(zhuǎn)數(shù)200r/min，載銅活性炭為2g，震蕩溫度不同的抗菌測試。表2為進(jìn)行試驗的條件及結(jié)果。

表2 不同震蕩溫度完成的抗菌測試結(jié)果

2.1.3 不同轉(zhuǎn)數(shù)的選擇

完成振蕩時間為1h，振蕩溫度為30℃，載銅活性炭為2g，轉(zhuǎn)數(shù)不同的抗菌測試。表3為進(jìn)行試驗的條件及結(jié)果。

表3 不同轉(zhuǎn)數(shù)完成的抗菌測試結(jié)果

圖3 不同轉(zhuǎn)數(shù)完成的抗菌測試結(jié)果 圖4 不同載銅活性炭質(zhì)量完成的抗菌測試結(jié)果

2.1.4 不同載銅活性炭質(zhì)量的選擇

完成振蕩時間為1h，振蕩溫度為30℃，轉(zhuǎn)數(shù)200r/min，載銅活性炭質(zhì)量不同的抗菌測試。表4為進(jìn)行試驗的條件及結(jié)果。

表4 不同載銅活性炭質(zhì)量完成的抗菌測試結(jié)果

2.2 篩選實驗設(shè)計——Plackett-Burman設(shè)計[6]

在實驗中，對實驗過程五個主要因素氯化銅濃度、振蕩時間、振蕩溫度、轉(zhuǎn)數(shù)和載銅活性炭質(zhì)量，外加六個虛擬因素，共進(jìn)行12次實驗，以確定每個因素的影響因子。PB實驗設(shè)計和實驗結(jié)果如表5所示。

表5 Plackett-Burman設(shè)計結(jié)果

表6 抗菌率偏回歸系數(shù)及影響因素的顯著性分析

注：P<005顯著；P>0.1不顯著；P<0.0001極顯著。

2.3 中心組合設(shè)計(BBD)結(jié)果與響應(yīng)面結(jié)果[7-10]

根據(jù)Box-Behnken中心組合設(shè)計原理，在單因素的基礎(chǔ)上，以振蕩時間(A)、振蕩溫度(B)、轉(zhuǎn)數(shù)(C)、載銅活性炭濃度(D)四個因素為自變量，以抗菌率(Y)為響應(yīng)值，做四因素三水平的響應(yīng)面分析試驗，共29個實驗點(diǎn)。設(shè)計結(jié)果見表7、表8。

表7 試驗自變量因素編碼及水平

表8 BBD優(yōu)化設(shè)計結(jié)果

2.4 優(yōu)化結(jié)果

RSM預(yù)測出來的最佳結(jié)果為：振蕩時間2.5h、振蕩溫度60℃、載銅活性炭質(zhì)量2.25g、轉(zhuǎn)數(shù)250r/min，抗菌率高達(dá)100.313%，考慮實際情況，抗菌率在以上參數(shù)條件下，抗菌率高達(dá)100%。在最優(yōu)條件下，抗菌率達(dá)到100%，與預(yù)測值相符。

3 實驗討論

3.1 單因素試驗

從表1和圖1可知，隨著振蕩時間的增加，抗菌率也越來越大。當(dāng)振蕩時間大于1.5h后，抗菌率增長比較緩慢。所以選取振蕩時間為2.5h時，抗菌率最大。另外由表2和圖2知，隨著振蕩溫度的增加，抗菌率也顯著增加。所以選取振蕩溫度為60℃，抗菌率達(dá)到最大。表3和圖3表明隨著轉(zhuǎn)數(shù)的增加，抗菌率也增大；當(dāng)轉(zhuǎn)數(shù)達(dá)到200轉(zhuǎn)時，抗菌率達(dá)到最大，之后抗菌率下降。所以選取轉(zhuǎn)數(shù)為200轉(zhuǎn)時，抗菌率最好。而表4和圖4表明隨著活性炭質(zhì)量的增加，抗菌率也增加，接近于線性關(guān)系，當(dāng)質(zhì)量達(dá)到2.5g時，抗菌率最大。所以選取載銅活性炭的質(zhì)量為2.5g，抗菌率最好。根據(jù)單因素試驗結(jié)果，得到單因素最佳工藝條件為：振蕩時間為2.5h、振蕩溫度60℃、轉(zhuǎn)數(shù)200r/min、載銅活性炭質(zhì)量為2.5g。

3.2 篩選實驗設(shè)計——Plackett-Burman設(shè)計

由表6可知，振蕩時間(A)、振蕩溫度(B)、轉(zhuǎn)數(shù)(C)、載銅活性炭濃度(D)為主要的影響因子。

3.3 抗菌率的響應(yīng)面分析

(1)抗菌率方差分析

表9 抗菌率方差分析

注：P<005顯著；P>0.1不顯著；P<0.0001極顯著。

由表9抗菌率方差分析可知：模型的F=13.95，P<0.0001，表明實驗所采用的二次模型是極顯著的，在統(tǒng)計學(xué)上是有意義的。失擬項用來表示所采用模型與實驗擬合的程度。本例P=0.3272>0.05，不存在失擬因素。因素A振蕩時間、B振蕩溫度、C轉(zhuǎn)數(shù)的P值均<0.05，而D載銅活性炭濃度的P值<0.0001。說明因素D影響極顯著，因素A、因素B和因素C影響顯著。交互項AB、AC、AD、BC、BD、CD的P值均大于0.05，所以交換項對抗菌率沒有影響。因素A、B、C、D的二次項P值均大于0.05，說明A2對抗菌率影響顯著，B2、C2、D2對抗菌率影響不顯著。

(2) 抗菌率回歸模型R2分析

表10 抗菌率回歸模型R2分析表

注：P<005顯著；P>0.1不顯著；P<0.0001極顯著。

由表10可知，決定系數(shù)R2=0.9331，表明因變量與自變量之間的非線性關(guān)系顯著，證明這種試驗方法是可靠的，在試驗范圍內(nèi)，該數(shù)學(xué)回歸模型具有良好的預(yù)測。此外，R2校正值為0.8663，表明該模型可以解釋86.63%響應(yīng)值的變化，因此該模型擬合程度良好。

影響抗菌率的四個因素的等高線圖及三維曲線圖

① 振蕩時間與振蕩溫度對抗菌率交互影響

圖5 振蕩時間與振蕩溫度對抗菌率交互影響的等高線圖和三維曲線圖

從圖5可知，振蕩時間與振蕩溫度對抗菌率的等高線圖較為平行，說明兩者交互影響較顯著；另外，振蕩溫度比振蕩時間的響應(yīng)面曲線較陡，說明振蕩溫度對抗菌率的影響比振蕩時間對抗菌率的影響較大。

② 振蕩時間與轉(zhuǎn)數(shù)對抗菌率交互影響

圖6 振蕩時間與轉(zhuǎn)數(shù)對抗菌率交互影響的等高線圖和三維曲線圖

從圖6可知，振蕩時間與轉(zhuǎn)數(shù)對抗菌率的等高線圖較圓，說明兩者交互影響較不顯著；轉(zhuǎn)數(shù)比振蕩時間的響應(yīng)面曲線較陡，說明轉(zhuǎn)數(shù)對抗菌率的影響比振蕩時間對抗菌率的影響較大。

③ 振蕩時間與載銅活性炭濃度對抗菌率交互影響

圖7 振蕩時間與載銅活性炭濃度對抗菌率交互影響的等高線圖和三維曲線圖

從圖7可知，振蕩時間與載銅活性炭濃度對抗菌率的等高線圖幾乎成平行，說明兩者交互影響很顯著；氯化銅濃度比振蕩時間的響應(yīng)面曲線較陡，說明氯化銅濃度對抗菌率的影響比振蕩時間對抗菌率的影響大。

④ 振蕩溫度與轉(zhuǎn)數(shù)對抗菌率交互影響

圖8 振蕩溫度與轉(zhuǎn)數(shù)對抗菌率交互影響的等高線圖和三維曲線圖

從圖8可知，振蕩溫度與轉(zhuǎn)數(shù)對抗菌率的等高線圖較圓，說明兩者交互影響較不顯著；振蕩溫度比轉(zhuǎn)數(shù)的響應(yīng)面曲線較陡，說明振蕩溫度對抗菌率的影響比轉(zhuǎn)數(shù)對抗菌率的影響較大。

⑤ 振蕩溫度與載銅活性炭濃度對抗菌率交互影響

圖9 振蕩溫度與載銅活性炭濃度對抗菌率交互影響的等高線圖和三維曲線圖

從圖9可知，振蕩溫度與載銅活性炭濃度對抗菌率的等高線圖較平行，說明兩者交互影響較顯著；載銅活性炭濃度比振蕩溫度的響應(yīng)面曲線較陡，說明載銅活性炭濃度對抗菌率的影響比振蕩溫度對抗菌率的影響較大。

⑥ 轉(zhuǎn)數(shù)與載銅活性炭濃度對抗菌率交互影響

圖10 轉(zhuǎn)數(shù)與載銅活性炭濃度對抗菌率交互影響的等高線圖和三維曲線圖

從圖10可知，轉(zhuǎn)數(shù)與載銅活性炭濃度對抗菌率的等高線圖較平行，說明兩者交互影響較顯著；載銅活性炭濃度比轉(zhuǎn)數(shù)的響應(yīng)面曲線較陡，說明載銅活性炭對抗菌率的影響比轉(zhuǎn)數(shù)對抗菌率的影響較大。

綜上可知，載銅活性炭濃度對抗菌率影響最為顯著，響應(yīng)面較陡，振蕩溫度次之，轉(zhuǎn)數(shù)再次之，震蕩時間影響最弱，曲線較平滑。

4 結(jié) 論

該研究以抗菌率為響應(yīng)目標(biāo)，通過單因素實驗、Plackett-Burman(PB)設(shè)計和Box-Behnken Design(BBD)中心組合設(shè)計對載銅活性炭抗菌率的各個因素進(jìn)行篩選優(yōu)化，確定抗菌測試的最佳工藝條件為振蕩時間2.5h、振蕩溫度60℃、載銅活性炭質(zhì)量2.25g、轉(zhuǎn)數(shù)250r/min，抗菌率達(dá)100 %。

[1] 李素瓊．機(jī)械力化學(xué)法制備活性炭的研究[D]．福建農(nóng)林大學(xué)，2011．

[2] 崔靜，趙乃勤，李家?。钚蕴恐苽浼安煌贩N活性炭的研究進(jìn)展[J]．炭技術(shù)，2005，1：26-31．

[3] 王曉玭，管曉琴，李毅卉，等．活性炭負(fù)載金屬改性對廢水和廢氣處理的研究進(jìn)展[J]．江西化工，2012，(3)：42-47.

[4] 葉瑛，周玉航，夏枚生，等．新型無機(jī)抗菌材料：載銅蒙脫石及其抗菌機(jī)理討論[J]．無機(jī)材料學(xué)報，2003，18(3)：569-574.

[5] 茍亞峰．響應(yīng)曲面法優(yōu)化產(chǎn)外切菊粉酶菌株G-60的發(fā)酵條件研究[J]．中國釀造，2013，43(4)：44-53．

[6] 鄒東恢，梁敏，楊勇，等．香菇多糖復(fù)合酶法提取及其脫色工藝優(yōu)化[J]．農(nóng)業(yè)機(jī)械學(xué)報，2009，40(3)：135-138．

[7] 楊德．實驗設(shè)計與分析[M]．北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2002.

[8] 倪孟祥，畢啟瑞，郭潤妮，等．南極放線菌N-1產(chǎn)抑菌成分的響應(yīng)面優(yōu)化[J]．中國海洋藥物，2013，32(03)：11-20．

[9] 縱偉，霍智文，顏新培．響應(yīng)面優(yōu)化微波法提取桑枝多糖的最佳工藝研究[J]．北方園藝，2013，(12)：136-139．

[10] 張守媛，李太襯，欒波，等．響應(yīng)面優(yōu)化茄子皮色素的提取及抗氧化性研究[J]．中國釀造，2013，32(4)：118-112．

[責(zé)任編輯：崔海瑛]

李素瓊(1986-)，女，福建安溪人，講師，碩士，從事炭材料與植物纖維化學(xué)研究。

福建省教育廳科技產(chǎn)學(xué)研項目(JAI5508)國家大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計劃項目(2012107002)；武夷學(xué)院青年基金資助項目(xq1208)。

TQ351

A

2095-0063(2016)06-0074-07

2016-05-21

DOI 10.13356/j.cnki.jdnu.2095-0063.2016.06.016