頑拗性三七種子后熟過程超微結(jié)構(gòu)和抗氧化酶變化

楊 凱， 李 磊， 龍光強(qiáng)， 孟珍貴， 李龍根， 陳軍文*

( 1. 云南農(nóng)業(yè)大學(xué) 云南省優(yōu)勢(shì)中藥材規(guī)范化種植工程研究中心， 昆明 650201；2. 云南農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)與生物技術(shù)學(xué)院， 昆明 650201 )

頑拗性三七種子后熟過程超微結(jié)構(gòu)和抗氧化酶變化

楊 凱1,2， 李 磊1,2， 龍光強(qiáng)1， 孟珍貴1， 李龍根1， 陳軍文1,2*

( 1. 云南農(nóng)業(yè)大學(xué) 云南省優(yōu)勢(shì)中藥材規(guī)范化種植工程研究中心， 昆明 650201；2. 云南農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)與生物技術(shù)學(xué)院， 昆明 650201 )

該研究以3年生三七成熟種子為材料，通過對(duì)三七種子種胚切片觀察、抗氧化酶活性測(cè)定及相關(guān)基因表達(dá)量的變化分析，從生理、形態(tài)及轉(zhuǎn)錄組3個(gè)層面了解頑拗性三七種子的內(nèi)在機(jī)理。結(jié)果表明：三七種子后熟0～40 d，超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)、抗壞血酸過氧化物酶(APX)和谷胱甘肽還原酶(GR)的活性先升高后降低，過氧化物酶(POD)的活性升高。后熟40 d時(shí)SOD、POD、CAT、APX相關(guān)差異表達(dá)基因的FPKM值分別為28、13、356、105，皆處于較高水平，此時(shí)觀察到完整的細(xì)胞結(jié)構(gòu)，種胚完成形態(tài)成熟，丙二醛(MDA)含量達(dá)到了最高值，說明三七種子內(nèi)部抗氧化系統(tǒng)抵御氧化傷害最激烈，對(duì)水分脅迫造成的氧化傷害最為敏感。伴隨后熟時(shí)間的延長(zhǎng)，膜脂過氧化作用加劇造成細(xì)胞膜的降解，導(dǎo)致細(xì)胞功能喪失和畸形死亡，抗氧化系統(tǒng)酶活性降低不能有效抵御氧化傷害可能是導(dǎo)致頑拗性三七種子脫水敏感的重要原因之一。

三七， 后熟作用， 脫水敏感性， 超微結(jié)構(gòu)， 抗氧化系統(tǒng)

三七(Panax notoginseng)為五加科(Araliaceae)人參屬多年生草本植物，是我國(guó)特有的名貴中藥材，有“南國(guó)神草”的美譽(yù)。三七主產(chǎn)地和地道產(chǎn)區(qū)為云南省文山州，種植面積和產(chǎn)量均占全國(guó)的比例在90%以上。三七含有多種皂苷、氨基酸、多糖和黃酮等生理活性物質(zhì)(張銘，2003)，其根、莖、花均可入藥，具有散瘀止血、消腫止痛、降脂、降血糖、提高機(jī)體免疫力和抗心肌缺血等功效(付建華等，2006)。三七作為具有確切的預(yù)防、醫(yī)療和保健功能的天然藥物，在藥品、保健品、功能食品領(lǐng)域具有巨大的開發(fā)潛力和市場(chǎng)前景。

頑拗性種子是指在成熟過程中不發(fā)生脫水行為，種子在成熟脫落時(shí)仍然保持著較高的含水量(Smith&Berjak，1995)，在整個(gè)生長(zhǎng)發(fā)育過程對(duì)脫水和低溫敏感(Pammenter&Berjak，1999)。目前國(guó)內(nèi)外對(duì)種子休眠及種子脫水耐性的分子機(jī)理尚不十分明確(李曉琳等，2011)，研究表明種子超微結(jié)構(gòu)及其代謝活性變化與種子在生長(zhǎng)發(fā)育過程中脫水耐性的獲得有著密切的聯(lián)系(Farrantetal，1997)。頑拗性種子在脫水過程中，種子內(nèi)部發(fā)生水介導(dǎo)的氧化傷害，即種子含水量處于中等水平時(shí)，其內(nèi)部將會(huì)發(fā)生一種不受控制的氧化反應(yīng)，可對(duì)種子造成脫水傷害(Leprinceetal，1996)。種子內(nèi)部存在的抗氧化防御系統(tǒng)，可以對(duì)抗種子劣變過程中所產(chǎn)生的超氧陰離子自由基，酶促防御系統(tǒng)和非酶促防御系統(tǒng)共同構(gòu)成抗氧化系統(tǒng)，前者包括SOD(超氧化物歧化酶)、POD(過氧化物酶)及CAT(過氧化氫酶)等(Cakmaketal，1993)。當(dāng)抗氧化系統(tǒng)酶活性下降時(shí)，種子就會(huì)發(fā)生氧化脅迫傷害。因此，在脫水過程中酶促防御系統(tǒng)未能對(duì)膜脂過氧化事件進(jìn)行有效的抵御也可能是頑拗性種子脫水敏感性的重要原因。三七種子在成熟采收后保持著較高的含水量，在后熟過程中伴隨著一定程度水分的喪失。

種子繁殖是三七農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上應(yīng)用最為廣泛的繁殖方式，然而三七種子為典型的頑拗性種子，對(duì)脫水和低溫高度敏感(李磊等，2014)，種子在完成形態(tài)成熟時(shí)含水量約為67.3%，此時(shí)種胚尚未完全分化，需經(jīng)過60～100d的后熟期才能開始萌發(fā)，屬生理休眠類型(安娜，2006)。由于三七種子的典型頑拗性，嚴(yán)重阻礙著三七種子的貯藏保存。本文在前人研究的基礎(chǔ)上，對(duì)后熟不同時(shí)期的三七種子進(jìn)行種胚切片觀察、抗氧化系統(tǒng)酶活性及相關(guān)基因表達(dá)量的變化分析，試圖從解剖學(xué)、生理學(xué)和分子生物學(xué)層面探討三七種子脫水敏感性的原因。

1 材料與方法

1.1 供試材料

三七(Panax notoginseng)種子采自于云南省文山州的文山市苗鄉(xiāng)三七實(shí)業(yè)有限公司苗鄉(xiāng)三七科技公司的試驗(yàn)基地。試驗(yàn)基地位于文山州硯山縣盤龍鄉(xiāng)。

1.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

選擇成熟、飽滿的3年生植株的種子，人工搓去果皮，用5%CuSO4浸泡消毒，將種子沖洗干凈，用濾紙吸干表面水分后與經(jīng)高溫消毒后的濕沙按1∶5層積保存。自2014年11月19日，以每10d的間隔進(jìn)行取樣，分別進(jìn)行種子超微結(jié)構(gòu)觀察及抗氧化系統(tǒng)酶生理指標(biāo)的測(cè)定；部分種子液氮凍存，備用于轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 超微結(jié)構(gòu)觀察 超微結(jié)構(gòu)觀察實(shí)驗(yàn)前期樣品處理方法參照(Wenetal，2009)的方法，并稍作修改。將處于不同后熟階段的種子去掉種皮，切去種胚生長(zhǎng)部位1cm3左右樣品，放入含2.5 % 戊二醛的0.2mol·L-1磷酸緩沖液(pH7.2)中，4 ℃下固定24h后經(jīng)2%的鋨酸固定3h，用50%、70%、80%、90%乙醇梯度脫水各15min，再用100%乙醇脫水3次，每次30min，Epon812環(huán)氧樹脂包埋。用LKB-v型超薄切片機(jī)切片，切片經(jīng)醋酸鈾和檸檬酸鉛染色后，在透射電子顯微鏡下觀察拍照。選取不同后熟期最清晰的電鏡圖，使用標(biāo)尺計(jì)算細(xì)胞器的大小。

1.3.3 與抗氧化系統(tǒng)相關(guān)差異表達(dá)基因篩選 通過IlluminaHiseqTM2500測(cè)序技術(shù)獲得三七種子4個(gè)后熟時(shí)期(0、20、40、60d)的轉(zhuǎn)錄本信息，并篩選出與抗氧化系統(tǒng)酶相關(guān)的基因，用FPKM(每百萬fragments中來自某一基因每千堿基長(zhǎng)度的fragments數(shù)目)來估算不同后熟期的基因表達(dá)水平(Trapnelletal，2010)。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

不同后熟時(shí)期抗氧化酶活性及氧化產(chǎn)物含量和抗氧化酶相關(guān)基因的FPKM值使用SPSS17.0單因素方差分析和Duncan多重比較方法進(jìn)行顯著性差異分析，P值≤0.05時(shí)視為差異顯著。試驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次(n=3)。

2 結(jié)果與分析

2.1 超微結(jié)構(gòu)觀察

三七種子后熟過程中，經(jīng)透射電子顯微鏡觀察后所得到的超微結(jié)構(gòu)的變化情況如圖1所示。剛成熟的三七種子細(xì)胞整齊飽滿，中央大液泡發(fā)達(dá)，細(xì)胞壁內(nèi)側(cè)緊密排列著大量形狀大小相對(duì)統(tǒng)一的橢圓形黑色脂質(zhì)體，脂質(zhì)體長(zhǎng)軸的長(zhǎng)度一般約為0.1nm(圖1：a)。層積保存20d時(shí)，細(xì)胞壁明顯增厚，厚度約為初始時(shí)期的2倍，脂質(zhì)體排列間隔變大，顏色變?yōu)榘胪该?圖1：b)。層積保存30d時(shí)觀察到了明顯的液泡，脂質(zhì)體大小不一分散在細(xì)胞內(nèi)，并且首次觀察到了淀粉體，淀粉體長(zhǎng)約2.3μm，寬約1.36μm(圖1：c)。層積保存40d，可以觀察到典型的橢圓形細(xì)胞核結(jié)構(gòu)，核內(nèi)有核仁直徑約0.15nm，細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)了大量的液泡，脂質(zhì)體顏色逐漸變深，在細(xì)胞壁內(nèi)側(cè)不斷積累(圖1：d-e)。層積保存50d時(shí)，細(xì)胞核較之前變小，核仁直徑約為0.09nm，細(xì)胞內(nèi)的脂質(zhì)體又重新聚集在細(xì)胞壁的內(nèi)側(cè)(圖1：f-g)；層積保存60d時(shí)，可觀察到細(xì)胞壁逐漸向內(nèi)凹陷，細(xì)胞形狀畸形，細(xì)胞間隙變大，液泡消失，出現(xiàn)了大量的形狀大小規(guī)則的淀粉粒，長(zhǎng)約0.89μm，寬約0.64μm，脂質(zhì)體分散排列在細(xì)胞壁內(nèi)側(cè)(圖1：h)。

2.2 抗氧化系統(tǒng)酶活性及氧化產(chǎn)物生成量測(cè)定

三七種子后熟過程中SOD、POD、CAT、APX、GR酶活性及GSH含量的變化趨勢(shì)各不相同。SOD和POD酶活性變化見圖2：a,b，SOD酶活性呈現(xiàn)升降交替的變化趨勢(shì)，20d時(shí)達(dá)到整個(gè)過程最大值29.8U·g-1·min-1，到40d時(shí)下降到最低值3.63U·g-1·min-1；POD酶活性在后熟期40d時(shí)達(dá)到整個(gè)后熟過程的最高值(5.40U·g-1·min-1)，顯著高于其他后熟時(shí)期(P<0.05)，隨后呈現(xiàn)逐漸降低的趨勢(shì)?？寡趸窩AT、APX酶活性變化如圖2：c,d所示，CAT酶活性整體呈現(xiàn)出逐漸上升的變化趨勢(shì)，在后熟期60d時(shí)達(dá)到最大值(4.29U·g-1·min-1)，隨后逐漸下降。APX酶活性整體呈現(xiàn)出上下交替的變化趨勢(shì)，在后熟期60d時(shí)，酶活達(dá)到最小值(2.55U·g-1·min-1)，而70d時(shí)上升至最大值(4.16U·g-1·min-1)。GR酶活性和GSH含量變化見圖2：e,f，GR酶活性在后熟期初期呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，30d時(shí)達(dá)到整個(gè)后熟過程最大值(0.58U·g-1·min-1)，隨后呈現(xiàn)逐漸緩慢下降趨勢(shì)。GSH含量在整個(gè)后熟過程呈現(xiàn)出升降交替的變化趨勢(shì)，其中在20d時(shí)達(dá)到最大值(1.18mmol·g-1)，隨后直線下降至40d時(shí)出現(xiàn)最小值(0.56mmol·g-1)。

2.3 與抗氧化系統(tǒng)相關(guān)差異表達(dá)基因的篩選與分析

為明確三七種子后熟期抗氧化系統(tǒng)功能的分子機(jī)理，在所得的三七種子轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫中，篩選出后熟過程中與抗氧化系統(tǒng)有關(guān)酶的差異表達(dá)基因共87條，其中與SOD、POD、CAT、APX、GR和GSH合成酶相關(guān)差異表達(dá)基因分別有25、32、17、4、7、2條。SOD家族相關(guān)基因表達(dá)量呈現(xiàn)先降后升的趨勢(shì)(圖4：a)，后熟20 d時(shí) FPKM值最小為19.39，隨后開始不斷升高，后熟40 d時(shí)為28.45，到后熟60 d時(shí)達(dá)到最大值為29.59。POD類基因表達(dá)量FPKM值總體呈現(xiàn)升高趨勢(shì)(圖4：b)，后熟0 d為最小值6.28，后熟40 d為12.96，后熟60 d時(shí)達(dá)到最大值18.55。

圖 1 三七種子后熟過程各時(shí)期的超微結(jié)構(gòu) CW. 細(xì)胞壁； L. 脂質(zhì)體； V. 液泡； Am. 淀粉體；Nu. 核仁； N. 細(xì)胞核；Is. 細(xì)胞間隙。標(biāo)尺a, b, d, f=0.2 nm； 標(biāo)尺c, h=2 μm； 標(biāo)尺e=1 μm；標(biāo)尺g= 5 μm。Fig. 1 Electron micrographs of sections from the seed of Panax notoginseng during after-ripening process of embryo growth CW. Cell wall; L. Lipid; V. Vacuole; Am. Amyloplast; Nu. Nucleolus; N. Nucleus; Is. Ntercellular space. Scale bars: a, b, d, f=0.2 nm; c, h = 2 μm; e = 1 μm; g = 5 μm.

圖 2 三七種子后熟過程中超氧化物歧化酶 (SOD, a)、過氧化物酶 (POD, b)、過氧化氫酶 (CAT, c)、抗壞血酸過氧化物酶 (APX, d)和谷胱甘肽還原酶 (GR, e)活性及還原型谷胱甘肽 (GSH, f)含量的變化 數(shù)據(jù)是平均值 ± 標(biāo)準(zhǔn)誤(n=3)。下同。Fig. 2 Changes in activities of SOD (a), POD (b), CAT (c),APX (d), GR(e) in the process of embryo growth after-ripening of Panax notoginseng seed and content of GSH(f) Values for each point were (n=3). The same below.

圖 3 三七種子后熟過程中脂質(zhì)過氧化物丙二醛(MDA, a)、超氧陰離子·, b)含量的變化Fig. 3 Changes in content of MDA (a) and ·(b) in the process of embryo growth after-ripening of Panax notoginseng seed

圖 4 三七種子后熟過程中超氧化物歧化酶(SOD, a)和過氧化物酶(POD, b)過氧化氫酶(CAT, c)、抗壞血酸過氧化物酶(APX, d)和谷胱甘肽還原酶(GR, e)及還原型谷胱甘肽(GSH, f)相關(guān)基因的FPKM值Fig. 4 FRKM related to SOD (a), POD (b), CAT (c), APX (d), GR (e) and GSH (f) of Panax notoginseng seed at different after-ripening stages

CAT類是所有抗氧化系統(tǒng)相關(guān)酶基因中差異表達(dá)量最高的，F(xiàn)PKM值的變化規(guī)律為先升后降(圖4：c)，后熟0 d的FPKM值最低為189.54，后熟20 d達(dá)到最大值335.16，隨后出現(xiàn)緩慢下降趨勢(shì)，后熟40 d時(shí)為356.44。APX類基因表達(dá)量在整個(gè)后熟過程中持續(xù)升高(圖4：d)，后熟0 d FPKM值為61.32，后熟20 d和40 d增幅較平緩，40 d時(shí)為104.77，到后熟60 d升至最大值120.66。GR類基因表達(dá)量表現(xiàn)出先降后升(圖4：e)，F(xiàn)PKM值在后熟0 d為最大值(23.87)，隨后出現(xiàn)緩慢下降趨勢(shì)，在后熟40 d出現(xiàn)最低值(19.81)。GSH相關(guān)基因表達(dá)量FPKM值在整個(gè)后熟過程中表現(xiàn)為升降交替變化(圖4：f)，于20 d達(dá)到最大值(12.83)，隨后開始下降至后熟40 d為最低值(7.61)。

3 討論

在組織中，當(dāng)編碼酶促抗氧化劑的基因增量表達(dá)時(shí)，由氧化事件引起的細(xì)胞毒素產(chǎn)物的清除對(duì)于提高脫水脅迫耐性具有重要意義(Ingram & Bartels，1996)。三七種子后熟過程中，SOD相關(guān)基因在種子種胚形態(tài)生長(zhǎng)期少量表達(dá)，說明此時(shí)種子內(nèi)部受到的氧化脅迫較小，而在種子后熟40 d時(shí)表達(dá)量明顯增加，這也驗(yàn)證了此時(shí)種子內(nèi)部所受氧化傷害程度嚴(yán)重的結(jié)果。POD相關(guān)基因在后熟期差異表達(dá)總體上呈現(xiàn)持續(xù)升高，說明在整個(gè)后熟過程中POD起到了抵御氧化傷害的作用。CAT相關(guān)基因差異表達(dá)量最高，可見該基因?qū)θ叻N子所受氧化傷害較為敏感。APX相關(guān)基因表達(dá)量在整個(gè)后熟期持續(xù)升高，而酶活性在后熟40 d和60 d時(shí)較低，推測(cè)后熟60 d時(shí)種子內(nèi)所受到由H2O2引起的氧化傷害程度最為嚴(yán)重。GSH受谷胱甘肽合成酶基因調(diào)控，其差異表達(dá)量在各時(shí)期相對(duì)較小，后熟期20 d時(shí)表達(dá)量最高，推測(cè)種子在后熟20 d時(shí)GR和GSH發(fā)揮著重要的ROS清除功能?？梢姡叻N子后熟過程中每種抗氧化酶基因的表達(dá)模式都是獨(dú)特而又復(fù)雜的。

總的來看，三七種子后熟過程中，SOD、POD、CAT、APX相關(guān)差異表達(dá)基因的FPKM值總體呈現(xiàn)升高趨勢(shì)。后熟前20 d，SOD、APX、GR活性升高，對(duì)氧化傷害起到抵御作用；后熟40 d時(shí)，細(xì)胞代謝活性最強(qiáng)，種胚完成形態(tài)成熟，SOD、POD、CAT、GR活性下降，MDA大量積累，此時(shí)種子對(duì)氧化傷害最為敏感；后熟60 d時(shí)膜脂過氧化加劇，抗氧化系統(tǒng)酶活性降低，導(dǎo)致細(xì)胞功能的喪失和畸形死亡。由此可見，抗氧化酶系統(tǒng)不能有效抵御氧化傷害可能是導(dǎo)致三七種子脫水敏感性的重要原因之一。

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鄉(xiāng)村地區(qū)有別于城市，資金來源有限，主要是靠公共財(cái)政支出。但鄉(xiāng)村的公共財(cái)政支出有限，所以需要“花小錢辦大事”，提高資金使用效率，平衡進(jìn)度、成本、質(zhì)量，需要抓住機(jī)會(huì)建設(shè)出實(shí)打?qū)嵉男Ч?，快速地出效果并不意味著急于求成，這樣可以充分提高各參建單位以及當(dāng)?shù)孛癖姷姆e極性。EPC建造模式合同清晰明確，有效避免責(zé)權(quán)不清，可以充分發(fā)揮總承包商的管理能力，全面協(xié)調(diào)各方面，確保項(xiàng)目的質(zhì)量和進(jìn)度，有效實(shí)現(xiàn)預(yù)期目標(biāo)。

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Changes of antioxidant enzyme and ultrastructure in recalcitrant seeds ofPanaxnotoginsengduring after-ripening process

YANG Kai1,2, LI Lei1,2, LONG Guang-Qiang1, MENG Zhen-Gui1,LI Long-Gen1, CHEN Jun-Wen1,2*

( 1. Yunnan Provincial Research Center on Good Agricultural Practice for Dominant Chinese Medicinal Materials, Yunnan Agricultural University,Kunming 650201, China; 2.CollegeofAgronomyandBiotechnology,YunnanAgriculturalUniversity, Kunming 650201, China )

The changes in ultrastructure, activity of antioxidant enzyme and expression of antioxidant enzyme were examined in 3-year-oldPanaxnotoginsengseeds during the after-ripening process. The objective of the present study was to analyze the desiccation sensitivity in recalcitrant seeds ofP.notoginsengat the physiological, ultrastructural and transcriptomic levels. The results showed that during after-ripening process of 40 d, the activity of SOD, CAT, APX and GR in seeds increased at first and then reduced, and POD activity gradually increased. At the end of after-ripening period of 40 d, FPKM values of gene related to antioxidant enzymes (SOD, POD, CAT and APX) were 28, 13, 356 and 105, respectively, and all at a high. At the same time, intact cell structure was observed, and mature embryo was morphologically completed. However, the amount of MDA reached a peak value. Summarily, the peroxidations of membrane lipid caused cell membrane degradation and led to cell function loss and even cell death; meanwhile, antioxidant enzymes could not effectively resist the oxidative injury with the prolonged time of after-ripening, which may be the vital reasons for desiccation sensitivity in recalcitrant seeds ofP.notoginseng.

Panax notoginseng,after-ripening,desiccationsensitivity,ultrastructure,antioxidantsystem

10.11931/guihaia.gxzw201510018

2015-10-15

2016-01-18

國(guó)家自然科學(xué)基金(81360609)；云南省中青年學(xué)術(shù)技術(shù)帶頭人后備人才培養(yǎng)項(xiàng)目(2014HB011) [Supported by the National Natural Science Foundation of China (81360609); the Project of Young and Middle-aged Talent of Yunnan Province (2014HB011)]。

楊凱(1993-)，女(彝族)，云南普洱人，碩士研究生，主要研究方向?yàn)榉N子生理學(xué)，(E-mail)flove102@163.com。

*通訊作者： 陳軍文，博士，教授，主要研究方向?yàn)樗幱弥参锷砩鷳B(tài)，(E-mail) cjw31412@163.com。

Q946

A

1000-3142(2016)12-1519-07

楊凱，李磊，龍光強(qiáng)，等. 頑拗性三七種子后熟過程超微結(jié)構(gòu)和抗氧化酶變化 [J]. 廣西植物， 2016， 36(12):1519-1525

YANG K, LI L, LONG GQ，et al. Changes of antioxidant enzyme and ultrastructure in recalcitrant seeds ofPanaxnotoginsengduring after-ripening process [J]. Guihaia， 2016， 36(12):1519-1525