鐵皮石斛多糖對冠心病緩慢性心律失常大鼠NO、 cGMP及Na+-K+-ATP 酶活性的影響

唐漢慶,王 兵,廉春容,王露瑤,黃俊杰,趙善民,莫小強,王金花

(右江民族醫(yī)學院，廣西百色 533000)

鐵皮石斛多糖對冠心病緩慢性心律失常大鼠NO、 cGMP及Na+-K+-ATP 酶活性的影響

唐漢慶,王 兵,廉春容,王露瑤,黃俊杰,趙善民,莫小強,王金花

(右江民族醫(yī)學院，廣西百色 533000)

為觀察鐵皮石斛多糖對NO、 cGMP、Na+-K+-ATP酶活性及心肌細胞動作電位的影響并探討其效應機制，將清潔級Wistar大鼠分為7組，每組10只。模型組高脂飼料及寒冷刺激6周，對照組基礎飼料常態(tài)飼養(yǎng)。模型組第35天～第42天皮下多點注射垂體后葉素(10 μg/kg),對照組給等體積的生理鹽水，每天1次。低、中、高劑量組，阿托品組和小檗堿組第35天～第42天分別灌胃鐵皮石斛多糖(100、200、400 mg/kg)、靜脈注射阿托品(5 mg/kg)、靜脈注射小檗堿(8 mg/kg)，每天1次。第43天取材，檢測血清NO、 cGMP、Na+-K+-ATP酶活性及心肌細胞動作電位。結果顯示，與對照組比較，模型組、小檗堿組血清NO、 cGMP含量均顯著升高(P<0.01)；Na+-K+-ATP酶活性顯著降低(P<0.01)，APD、APD90、ERP均延長(P<0.05或P<0.01)，模型組造模后、小檗堿組給藥后心率均顯著降低(P<0.01)。與模型組比較，高劑量組及阿托品組NO、 cGMP含量均降低(P<0.05或P<0.01)；Na+-K+-ATP酶活性升高(P<0.05或P<0.01)，高劑量組及阿托品組APD、APD90、ERP均縮短(P<0.05或P<0.01)，高劑量組及阿托品組心率顯著增高(P<0.01)。表明鐵皮石斛多糖對NO、 cGMP、Na+-K+-ATP酶活性均有影響，與劑量有關，通過NO- GC- cGMP通路提高心率，同時也可能通過NO間接調(diào)節(jié)Na+-K+-ATP酶活性或直接調(diào)節(jié)Na+-K+-ATP酶活性而發(fā)揮作用。

鐵皮石斛多糖；冠心病；緩慢性心律失常

冠心病緩慢性心律失常屬于中醫(yī)“驚悸”、“怔忡”范疇，辨證多屬于心陽虛，重者為心腎陽虛，以滋陰增液、通經(jīng)復脈的方藥能取得一定的功效[1]，鐵皮石斛是常用的一味名貴藥材，有滋陰生津、補虛通絡之功效，鐵皮石斛多糖(Dendrobiumcandidumpolysaccharides，DCP)是鐵皮石斛的主要成分，對冠心病緩慢性心律失常有一定改善作用[2]，關于其起效機制，有研究認為NO作為第二信使起關鍵作用，DCP可能是通過鳥苷酸環(huán)化酶(guanylate cyclase，GC)調(diào)節(jié)環(huán)磷酸鳥苷 (cGMP) 濃度以及Na+-K+-ATP酶活性而影響心肌的傳導性和自律性[3-4]，DCP對冠心病緩慢性心律失常的治療作用及其對NO、 cGMP、Na+-K+-ATP酶的影響有待探索。本試驗建立冠心病緩慢性心律失常大鼠模型，通過DCP的干預，觀察其對NO、cGMP、Na+-K+-ATP酶活性的影響，從NO-cGMP通路及Na+-K+-ATP酶關系角度討論其發(fā)揮作用的可能機制并提供科學資料。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 清潔級Wistar大鼠70只，雌雄各半，體重175 g～210 g，北京維通利華實驗動物技術有限公司，動物許可證號：SCXK (京)2013-0004。

1.1.2 主要試劑和儀器 阿托品注射液(批號:080321)，杭州民升制藥公司產(chǎn)品；鹽酸小檗堿(批號:040362)，北京化學試劑有限公司產(chǎn)品；水合氯醛(批號：20110612)，北京化學試劑公司產(chǎn)品；NO試劑盒(批號:200020112)，國藥集團化學試劑有限公司產(chǎn)品；cGMP試劑盒(批號:120632)，南京建成生物科技公司產(chǎn)品；Na+-K+-ATP酶試劑盒(批號:Z100304)，美國Sigma公司產(chǎn)品。

電子天平(AE160型)，瑞士Mettler公司產(chǎn)品；高速低溫離心機(PK121R型)，ALC 公司產(chǎn)品；心電圖儀(M3046A型)，Philip公司產(chǎn)品；生物機能實驗系統(tǒng)(BL-420 E+型)，成都泰盟公司產(chǎn)品；生物信號采集系統(tǒng)，上海欣曼公司產(chǎn)品；倒置相差顯微鏡(CKX31型)，Japan Olympus產(chǎn)品；三維微操縱器，Japan Narishige公司產(chǎn)品；拉制儀(P-97型)，USA Sutter公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 動物造模和分組處理 將清潔級Wistar大鼠70只，分為對照組、模型組、鐵皮石斛多糖低劑量組、中劑量組、高劑量組、阿托品組、小檗堿組7組，每組10只，雌雄各半，單籠飼養(yǎng)。參考張明雪-曹洪欣法[5]建立冠心病心陽虛證緩慢性心律失常大鼠模型。對照組基礎飼料喂食，自由飲用自來水，模型制備組制作冠心病緩慢性心律失常模型：①喂食高脂飼料6周(高脂飼料配方: 20 g/kg膽固醇,100 g/kg豬油,1.2 g/kg甲基硫氧嘧啶,余為基礎飼料)；②各大鼠每日2 h 冷藏于- 2 ℃～ - 4 ℃冰柜中,持續(xù)6周。③在35 d～42 d模型制備組大鼠皮下多點注射垂體后葉素(10 μg/kg),正常對照組給予等體積的生理鹽水。

①對照組：1 d～42 d喂基礎飼料，42 d心電圖儀檢測心率，43 d取血和心肌做標本。

②模型組：1 d～42 d高脂飲食、寒冷環(huán)境，35 d～42 d皮下注射(ih)垂體后葉素(10 μg/kg),每天1次， 余同①組。

③DCP低劑量組(簡稱低劑量組)：在②組基礎上，DCP以雙蒸水超聲溶解配制， 35 d～42 d(100 mg/kg)灌胃給藥(ig),每天1次。

④中劑量組：35 d～42 d(200 mg/kg)ig,余同③組。

⑤高劑量組：35 d～42 d(400 mg/kg)ig,余同③組。

⑥陽性藥物對照組(簡稱阿托品組)： 35 d～42 d靜脈注射給藥(iv)阿托品(5 mg/kg)，余同③組。

⑦陰性藥物對照組(簡稱小檗堿組)：鹽酸小檗堿溶于生理鹽水，35 d～42 d 靜脈注射鹽酸小檗堿(8 mg/kg)，余同③組。

1.2.2 鐵皮石斛多糖的制備 鐵皮石斛由廣西浙商投資有限公司惠贈，經(jīng)右江民族醫(yī)學院藥理教研室鑒定為蘭科石斛屬鐵皮石斛全草。稱取干燥鐵皮石斛適量，投入中藥粉碎機粉碎后，按1∶10加水煎煮2次，第1次煎煮1 h，第2次煎煮30 min，合并2次濾液，室溫離心(3 000 r/min，8 min)，取出上清液，濃縮后真空干燥，經(jīng)蒽酮-硫酸比色法檢測，DCP含量為20.4%。

1.2.3 心室乳頭肌的分離 大鼠擊顱致昏后，分離、沖洗心臟，置于100% O2飽和、溫度36℃±0.5℃臺氏液(mmol/L)(NaCl 147，KCl 5.4，CaCl21.8，MgCl21.05，HEPES 10，glucose 11，NaOH調(diào)節(jié)至pH7.4)中分離心室乳頭肌，固定于恒溫浴槽中，并持續(xù)流速3 mL/min灌流, 穩(wěn)定2 h 后進行試驗。

1.2.4 電位導引記錄 玻璃微電極(電極液3 mol/L KCl ，直流電阻20 MΩ～30 MΩ) 插入 Ag-AgCl 引導電極,用三維微操縱器固定, 以參比電極接地。電極入水后調(diào)零,緩慢插入電極至出現(xiàn)靜息電位(RP)時, 用電子刺激器發(fā)放刺激脈沖( 2 ms, 1.5倍閾電壓) , 通過隔離器脈沖刺激豚鼠乳頭肌, 誘發(fā)乳頭肌的動作電位。電信號通過微電極放大器，用生物機能實驗系統(tǒng)在計算機上進行實時采集并分析存儲數(shù)據(jù)。有效不應期(ERP)測定采用“8個方波刺激+1個額外刺激”模式，通過改變與前面正常刺激的間隔，測定額外刺激引起動作電位(AP)與前面AP間的最長時間間隔，重復測定6次，取平均值。

1.2.5 指標觀察 心率(HR)；動作電位時程(APD)；動作電位0相幅值(APA)；動作電位50%復極化時程(APD50)；90%復極化時程(APD90)；有效不應期(ERP)。

1.2.6 NO、 cGMP、Na+-K+-ATP酶活性檢測 100 g/L水合氯醛按350 mg/kg腹腔麻醉，取股動脈血，室溫靜置6 h，離心(4℃,3 000 r/min，10 min)，取血清，NO檢測采用硝酸還原法， cGMP檢測采用酶聯(lián)免疫法，Na+-K+-ATP酶活性檢測采用無機磷含量法。按照試劑盒說明書步驟進行。

2 結果

2.1 各組大鼠造?；蚪o藥前后心率比較

與對照組比較，模型組造模后、小檗堿組給藥后心率均顯著降低(P<0.01)；與同組造模前比較，心率也均顯著降低(P<0.01)。與模型組造模后比較，高劑量組給藥后、阿托品組給藥后心率顯著增高(P<0.01)(表1)。

2.2 各組大鼠心室乳頭肌細胞電位比較

與對照組比較，模型組、小檗堿組APD、APD90、ERP均延長(P<0.05或P<0.01)。與模型組比較，中劑量組APD縮短(P<0.05)；高劑量組、阿托品組APD、APD90、ERP均縮短(P<0.05或P<0.01)(表2 )。

表1 各組大鼠心率比較

Table 1 Comparison of HR in rats of each group

組別Groups劑量/(mg·kg-1)Dose造模前HR/(次·min-1)HRbeforemodeling造模(給藥)后HR/(次·min-1)HRaftermodeling對照組Control-408.16±21.11396.88±25.44模型組Model-412.18±18.65292.16±30.12△#低劑量Low100396.48±22.15301.22±32.04中劑量Medium200413.24±20.11318.44±30.25高劑量High400405.33±22.56378.42±27.35*阿托品Atropine5395.62±23.88401.52±21.25*小檗堿Berberine8389.74±25.66284.38±28.64△,#

注：與對照組比較，△P<0.01；與模型組造模后比較，*P<0.01；與同組造模前比較，#P<0.01。

Note: vs control group, △P<0.01；vs model group(after modeling),*P<0.01；vs the same group(before modeling),#P<0.01.

2.3 各組血清NO、 cGMP含量、Na+-K+-ATP酶活性比較

與對照組比較，模型組、小檗堿組血清NO、 cGMP含量均顯著升高(P<0.01)；Na+-K+-ATP酶活性顯著降低(P<0.01)。與模型組比較，中劑量組NO降低(P<0.05)；高劑量組、阿托品組NO、 cGMP含量均降低(P<0.05或P<0.01)；高劑量組、阿托品組Na+-K+-ATP 酶活性升高(P<0.05或P<0.01)(表3 )。

3 討論

冠心病緩慢性心律失常主要是指竇性心率低于60次/min的心電泵(竇房結)功能不全的一類癥候群,主要表現(xiàn)為病態(tài)竇房結綜合征(sick sinus syndrome,SSS)。大多數(shù)為冠心病引起竇房結和傳導組織病變，缺血使其發(fā)生退行性變，進而使竇房結和傳導組織的起搏或傳導功能漸進性衰減所致，臨床表現(xiàn)和中醫(yī)心陽虛證相似，本試驗參考相關文獻[5]，建立病證結合的冠心病心陽虛證大鼠模型，以具有滋陰生津、通經(jīng)復脈[6]的鐵皮石斛為干預藥物，探討其效應機制。

表2 各組大鼠心室乳頭肌細胞電位比較

Table 2 Comparison of AP of myocardial cells in rats of each group

組別Groups劑量/(mg·kg-1)DoseAPD/msAPD50/msAPD90/msAPA/mVERP/ms對照組Control-316.11±18.42188.41±14.11224.43±16.11118.88±10.32251.23±42.41模型組Model-486.04±30.45△△264.22±24.45318.56±27.68△178.66±17.22328.22±70.55△低劑量Low100468.11±31.22250.12±26.33298.66±28.22171.55±19.33312.56±72.68中劑量Medium200287.35±31.25**238.98±28.36261.11±32.12165.32±21.01302.25±66.32高劑量High400296.12±28.45**198.66±17.24248.51±25.33*141.23±13.12256.28±56.11*阿托品Atropine5287.18±26.36**182.22±18.66256.66±26.53*139.45±13.04262.14±61.52小檗堿Berberine8492.15±37.02△△274.86±25.89331.12±28.63△188.06±19.66342.45±73.22△△

注：與對照組比較，△P<0.05，△△P<0.01；與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01。

Note: vs control group,△P<0.05，△△P<0.01；vs model group,*P<0.05，**P<0.01.

表3 各組血清NO、 cGMP含量、Na+-K+-ATP 酶活性比較

Table 3 Comparison of contents of serum NO, cGMP and activity of Na+-K+-ATP in each group

組別Groups劑量/(mg·kg-1)DoseNO/(mL·kg-1)cGMP/(μmol·L-1)Na+-K+-ATP酶活性/(pmol·L-1)ActivityofNa+-K+-ATP對照組Control-38.78±6.357.82±1.080.426±0.15模型組Model-52.24±15.21△△13.88±2.54△△0.203±0.09△△低劑量Low10049.32±14.8811.98±2.630.218±0.11中劑量Medium20044.88±14.36**11.02±2.330.288±0.14高劑量High40042.62±12.45**8.86±2.15*0.371±0.15*阿托品Atropine543.56±12.85**9.05±2.36*0.412±0.17**小檗堿Berberine858.63±18.35△△16.02±3.51△△0.194±0.12△△

注：與對照組比較，△△P<0.01；與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01。

Note: vs control group,△△P<0.01；vs model group,*P<0.05，**P<0.01.

在試驗中采用阿托品和小檗堿分別作為陽性對照藥物和陰性對照藥物，考慮到阿托品具有加快竇性頻率作用，常用于SSS的鑒別。小檗堿別名黃連素，是黃連的主要成分，對心肌電生理有影響[7]，黃連苦寒傷陽，能較為直觀地反證鐵皮石斛的干預效果。

NO在心血管系統(tǒng)的功能調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用，作為第二信使，可激活鳥苷酸環(huán)化酶(GC),使胞內(nèi)cGMP含量增加[8]， cGMP含量增加對心臟直接起抑制作用，表現(xiàn)為負性頻率、負性肌力、負性傳導作用[9-11]，在本試驗中觀察到，與對照組比較，模型組、小檗堿組血清NO、 cGMP含量均顯著升高(P<0.01)，心率均顯著降低(P<0.01)，經(jīng)過DCP干預后，與模型組比較，中劑量組NO降低，而高劑量組及阿托品組NO、 cGMP含量均降低(P<0.05或P<0.01)，心率顯著增高(P<0.01)，提示DCP可能是通過NO介導的細胞信號轉導通路，使cGMP 濃度降低從而達到提高心率的作用，推測這一作用與劑量的高低有關，且以高劑量起效較明顯。

Na+-K+-ATP酶活性與心肌細胞自律性有關， Na+-K+-ATP 酶活性正常是心肌細胞膜內(nèi)外離子不均勻分布從而形成靜息電位的基礎，其活性降低有可能導致復極化時程延長，NO 對Na+-K+-ATP酶活性有調(diào)節(jié)作用[12],在本試驗中觀察到，與對照組比較，模型組Na+-K+-ATP酶活性顯著降低(P<0.01)，給予DCP后，與模型組比較，高劑量組Na+-K+-ATP酶活性升高(P<0.05)，提示NO含量升高可能抑制Na+-K+-ATP酶活性，DCP可能通過調(diào)節(jié)NO含量、影響Na+-K+-ATP酶活性而間接發(fā)揮效應。根據(jù)本試驗心肌細胞的電位變化，與對照組比較，模型組APD、APD90、ERP均延長(P<0.05或P<0.01)，至少說明與Na+-K+-ATP酶活性降低有關；與模型組比較，高劑量組APD、APD90、ERP均縮短(P<0.05或P<0.01)，提示DCP也有可能通過直接提高Na+-K+-ATP酶活性而發(fā)揮作用。

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Effects ofDendrobiumcandidumPolysaccharides on NO,cGMP and Activity of Na+-K+-ATP Enzymes in Rats with Chronic Cardiac Arrhythmias of Coronary Heart Disease

TANG Han-qing, WANG Bing,LIAN Chun-rong, WANG Lu-yao ,HUANG Jun-jie,ZHAO Shan-min,MO Xiao-qiang,WANG Jin-hua

(YoujiangMedicalUniversityforNationalities,Baise,Guangxi,533000,China)

To observe the effects ofDendrobiumcandidumpolysaccharides (DCP) on NO- GC- cGMP channel in rats with chronic cardiac arrhythmias of coronary heart disease and discuss its mechanisms,70 clean grade Wistar rats were randomly divided into control group,model group,DCP low-dose group,medium-dose group,high-dose group,atropine group and berberine group 7 groups with 10 in each group.The rats in model group given were with high fatty diet and cold circumstance for 6 weeks while control group with ordinary diet and circumstance.From the 35th day to the 42nd day,the rats in model group was given were ih with pitutrin (10 μg/kg) while control group with equal normal saline.Based on model group,from the 35th day to the 42nd day, the rats in low-dose group,medium-dose group, high-dose group, atropine group and berberine group given were respectively ig with DCP(100 mg/kg,200 mg/kg,400 mg/kg),iv with atropine (5 mg/kg)and or iv with berberine(8 mg/kg),once a day.On the 43rd day to the contents of serum NO,cGMP and activity of Na+-K+-ATP enzymes,AP of myocardial cells were examined.The results showed that compared with control group, the rats in model group and berberine group,contents of serum NO and cGMP increased significantly (P<0.01),activity of Na+-K+-ATP enzymes reduced significantly (P<0.01).APD,APD90,ERP all increased (P<0.05 orP<0.01),heart rate reduced significantly (P<0.01).Compared with model group,the rats in high-dose group and atropine group,contents of serum NO and cGMP reduced (P<0.05 orP<0.01),activity of Na+-K+-ATP enzymes increased (P<0.05 orP<0.01),APD,APD90,ERP all reduced (P<0.05 or P<0.01),heart rate increased significantly (P<0.01).It was supposed that DCP took an effect on content of serum NO,cGMP and activity of Na+-K+-ATP enzymes to increase heart rate by NO- GC- cGMP channel,which is relevant to its dose.On the other hand,perhaps to take effects by regulating activity of Na+-K+-ATP enzymes via content of serum NO or directly by regulating activity of Na+-K+-ATP enzymes .

Dendrobiumcandidumpolysaccharides (DCP); coronary heart disease; chronic cardiac arrhythmias

2016-04-05

廣西科學研究與技術開發(fā)計劃項目(桂科攻1347003-4)

唐漢慶(1976-)，男，廣西合浦人，副教授，博士，主要從事民族醫(yī)藥與中西醫(yī)結合基礎研究。

S853.74

A

1007-5038(2016)12-0077-05