癸壬化石丸對大鼠亞急性毒性實驗研究

黃雨佳 盧興鳳 武 偉 楊樹娟 萬 婕 袁葉飛 唐喻瑩 劉 勇 劉珉甬

1.西南醫(yī)科大學護理學院，四川 瀘州 646000；2.西南醫(yī)科大學附屬醫(yī)院，四川 瀘州 646000；3.西南醫(yī)科大學藥學院，四川 瀘州 646000；4.瀘州欣康生物科技有限公司，四川 瀘州 646000；5.西南醫(yī)科大學附屬醫(yī)院病理科，四川 瀘州 646000；6.西南醫(yī)科大學護理醫(yī)療器械研發(fā)實驗室，四川 瀘州 646000

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癸壬化石丸對大鼠亞急性毒性實驗研究

黃雨佳1盧興鳳1武 偉2楊樹娟2萬 婕1袁葉飛3唐喻瑩4劉 勇5劉珉甬6*

1.西南醫(yī)科大學護理學院，四川 瀘州 646000；2.西南醫(yī)科大學附屬醫(yī)院，四川 瀘州 646000；3.西南醫(yī)科大學藥學院，四川 瀘州 646000；4.瀘州欣康生物科技有限公司，四川 瀘州 646000；5.西南醫(yī)科大學附屬醫(yī)院病理科，四川 瀘州 646000；6.西南醫(yī)科大學護理醫(yī)療器械研發(fā)實驗室，四川 瀘州 646000

目的：通過癸壬化石丸對大鼠亞急性毒性實驗研究評價其安全性，為新藥開發(fā)和臨床安全用藥提供實驗依據(jù)。方法：將20只SD大鼠隨機分為對照組和實驗組，對照組用5.0%吐溫80+生理鹽水灌胃3mL/(次·d)；實驗組將癸壬化石丸浸膏+5.0%吐溫80+生理鹽水配置成濃度0.5g/mL混懸液(相當于生藥濃度2.85g/mL)，灌胃3mL/(次·d)，連續(xù)給藥14d。觀察大鼠一般情況(血尿、大便、活動度、體重、進食量及死亡)；血液生化檢測ALT、AST、AST/ALT、Urea；大體解剖觀察心、肺、肝、腎外觀有無異常；HE染色光鏡下觀察肝、腎組織有無病理改變。結果：實驗組與對照組一般情況比較：均無血尿，活動度、大便性狀無異常，進食量呈同步變化，體重變化差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；血液生化各項指標比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；肉眼觀察兩組大鼠心、肺、肝、腎無異常改變；光鏡觀察實驗組僅見肝細胞輕度水腫；腎小管上皮輕度水腫，局灶可見空泡變性，間質少量淋巴細胞浸潤。結論：在本實驗條件下，癸壬化石丸無明顯的亞急性毒性，安全性較高。

癸壬化石丸；大鼠；腎結石；亞急性毒性

腎結石是泌尿系統(tǒng)常見病，發(fā)病率在15%左右，尤其是中國川南地區(qū)發(fā)病率極高[1]，且采用手術治療術后再發(fā)率高達50%左右[2-3]。西藥枸櫞酸鹽、鎂制劑、磷酸鹽、乙酰半胱氨酸等對結石直徑>0.6cm的患者效果不明顯，且副作用較大。癸壬化石丸治療腎結石在川南地區(qū)經(jīng)較長時間應用，臨床效果顯著，擬開發(fā)為國家新藥。前期試驗研究結果表明[4]，癸壬化石丸對大鼠的急性毒性經(jīng)口LD50>50.0g/kg，按急性毒性分級標準規(guī)定，該受試物為無毒級。本研究進行大鼠的亞急性毒性試驗，旨在進一步探討癸壬化石丸的毒性作用，對其安全性進行評價，為臨床提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 SPF級SD大鼠20只，體重(200±20)g，雌雄各半，西南醫(yī)科大學動物實驗中心提供，實驗動物生產(chǎn)許可證號SCXK(川)2013-17。

1.1.2 藥物 生理鹽水(批號：15042343，美大康佳樂藥業(yè))；5%吐溫80 (批號：080928，成都金山化學試劑)；癸壬化石丸浸膏(西南醫(yī)科大附屬中醫(yī)院制備)；戊巴比妥鈉(批號：F20050405，上海化學)。

1.2 方法 前期采用限量實驗，癸壬化石丸對大鼠的急性毒性經(jīng)口LD50>50.0g/kg，按急性毒性分級標準規(guī)定，該受試物為無毒級。對照組用5.0%吐溫80+生理鹽水灌胃3mL/(次·d)，連續(xù)14d。實驗組用癸壬化石丸最大使用濃度灌胃，即癸壬化石丸浸膏+5.0%吐溫80+生理鹽水配置成0.5g/mL混懸液(相當于生藥濃度2.85g/mL)灌胃3mL/(次·d)，連續(xù)14d。每次癸壬化石丸浸膏灌胃劑量約7.5g/kg，相當于33.75g生藥/kg。

1.3 觀察指標

1.3.1 一般情況 每天觀察記錄大鼠有無血尿，大便情況，活動度，體重變化、進食量及有無死亡。

1.3.2 血液生化 實驗第15d用3%戊巴比妥鈉腹腔麻醉后，經(jīng)眼眶靜脈采血查ALT、AST、AST/ALT、Urea。

1.3.3 組織病理學 大鼠采血后斷頸處死并解剖，肉眼觀察心、肝、腎、肺外形、體積、顏色有無異常；將肝、腎用10%甲醛固定、石蠟包埋切片、HE染色后光鏡下觀察肝組織結構、肝細胞，腎小管結構、腎實質改變。

2 結果

2.1 一般情況 實驗組與對照組均無血尿、大便性狀正常、活動度正常。實驗組2只、對照組1只大鼠在灌胃后立即死亡，解剖觀察各臟器無異常改變，僅見胸腔內約有2mL灌胃液，分析系灌胃溶液誤入氣管導致窒息死亡。對比進食量，實驗組與對照組進食量呈同步變化(見圖1)。隨時間推移，實驗組與對照組體重較前均穩(wěn)定增長，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，兩組平均體重差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，時間與干預因素不存在交互作用(P>0.05)，表明癸壬化石丸對體重無明顯影響。見表1。

表1 實驗組與對照組體重變化

2.2 血液生化 實驗組與對照組比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表2。

檢查項目對照組實驗組ALT(U/L)60.23±10.9253.57±9.55AST(U/L)218.15±37.39 209.26±24.96AST/ALT(U/L)3.70±0.59 4.01±0.62Urea(mmol/L)7.35±0.99 6.95±0.53

2.3 肉眼觀察各臟器 實驗組與對照組心、肝、腎、肺外形、體積、顏色無異常。

2.4 病理組織檢查 對照組肝、腎均正常(見圖2、圖3)；實驗組肝組織結構基本正常，僅見肝細胞輕度水腫；腎小管結構正常，皮髓質分界清，腎小管上皮輕度水腫，局灶可見空泡變性，間質少量淋巴細胞浸潤(見圖4、圖5)。

3 討論

中醫(yī)認為腎結石本虛標實，頑固難愈，非一般草木之品所能宣達，必借蟲類走竄之品搜剔竄透，方能濁開凝去，邪去正復。癸壬化石丸是根據(jù)中醫(yī)藥“清熱利濕，化瘀通絡，補益肝腎等法于一方，攻補兼施，溶排相合”理論，結合現(xiàn)代生物學研究，根據(jù)腎結石的特點研制的內服中藥。前期研究表明癸壬化石丸無明顯毒副作用，為進一步評價其安全性，開展了本次研究。

動物排尿、排便、活動、進食量、體重變化是綜合反映藥物毒性對機體代謝、健康狀況影響的基本指標，本次實驗中對照組和實驗組大鼠均未見血尿，大便性狀、活動度正常，體重穩(wěn)定增長，進食量呈同步變化，表明癸壬化石丸經(jīng)口按劑量33.75g生藥/kg灌胃，連續(xù)給藥14d對大鼠生長代謝無明顯影響(P<0.05)。肝臟是外源化合物在體內進行生物轉化的主要器官，由外源性化合物引起動物肝臟損害時，會引起動物血清中一系列相關酶的變化。腎臟是外源化合物及其代謝產(chǎn)物的主要排泄器官，也是本實驗受試藥物的主要作用靶器官，通過對腎臟功能生化指標的檢測，可了解受試藥物對腎臟功能的影響。本研究結果顯示對照組和實驗組谷丙轉氨酶(ALT)、谷草轉氨酶(AST)、ALT/AST、尿素(Urea)差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，說明癸壬化石丸連續(xù)給藥14d對大鼠肝腎功能無影響。內臟是機體發(fā)揮生理功能的場所，其組織結構的改變將對機體正常生理功能的發(fā)揮產(chǎn)生影響。病理組織檢查顯示實驗組肝臟、腎臟有輕度細胞水腫，腎小管上皮局灶可見空泡變性，間質少量淋巴細胞浸潤，均屬可逆性改變，提示癸壬化石丸浸膏給藥劑量7.5g/kg，連續(xù)給藥14d對大鼠肝、腎臟產(chǎn)生了一定影響，發(fā)生機制有待進一步研究。

在上述實驗條件下，癸壬化石丸浸膏灌胃的安全劑量約為7.5g/kg，相當于33.75g生藥/kg，相當于人臨床用量的202.50倍(人臨床用量為10.0g/60kg)，連續(xù)經(jīng)口給藥14d對大鼠的體重、血液生化指標等均無明顯影響，而在該劑量范圍內對大鼠心、肝、腎、肺等臟器組織也無可見病變損傷，因此癸壬化石丸無明顯的亞急性毒性，安全性較高。

[1]師晶麗.中醫(yī)腎病臨床實踐[M].貴陽:貴州科學技術出版社，2012：53-324.

[2]朱軍，沈玉華，謝安建，等.草酸鈣型尿結石的研究進展[J].化學世界，2007,3:175-178.

[3]周向文，黃冬梅，呂建新.中醫(yī)藥治療泌尿系結石臨床研究進展亞太傳統(tǒng)醫(yī)藥[J].2011,4:151-152.

[4]張廣平,葉祖光.有毒中藥的“毒性”與毒性分級[J].世界中醫(yī)藥, 2014 ,9 (2):175-177.

(編輯：梁志慶)

Experimental Study on rat’s Subacute Toxicity of Guiren Melting-stone Pill

HUANG Yujia1LU Xingfeng1WU Wei2YANG Shujuan2WAN Jie1YUAN Yefei3TANG Yuying4LIU Yong5LIU Minyong6*

1.School of Nursing of Southwest Medical University,Luzhou 646000，China；2.Affiliated Hospital of Southwest Medical University, Luzhou 646000，China；3.School of Pharmacy of Southwest Medical University，Luzhou 646000，China；4.Xinkang Biotechnology Co.,Ltd，Luzhou 646000，China；5.department of pathologyof Southwest Medical University，Luzhou 646000，China；6.Nursing Medical Research Laboratory of Southwest Medical University，Luzhou 646000, China

Objective To investigate the subacute toxicity of Guiren Melting-Stone Pill in rats and to evaluate its safety, providing theoretical basis for the new drug development and clinical application. Methods 20 SD rats were randomly divided into control group(10) and experimental group(10). Rats in control group were given intragastric administration by saline plus 5% Tween 80，3ml/d. Rats in experimental group were given intragastric administration by extractum Guiren melting-stone pill plus saline plus 5% Tween 80, 3mL/d for 14d. Observation Index: rat urine, stool, activity, body weight, food intake and death; blood biochemical parameters: ALT, AST, AST/ALT, Urea; the internal organs were observed by gross anatomy; the liver and kidney tissues were stained for HE expression. Results During the experiment, rats didn't have hematuria in experimental group and control group, stool, activity, weight, food intake were normal. Two sets of blood biochemical results showed no significant difference between the indicators (P>0.05); gross anatomy by naked eye, the internal organs don't have change; there were mild hydropic degeneration of liver cells, mild edema of PCT epithelial cells, very limited vacuolization and inflammatory cell infiltration in the interstitium.Conclusion There was no obviously subacute toxicity of the Guiren Melting-Stone Pill under the condition of this experiment.

Guiren Melting-stone Pill；Rats；Renal Calculus；Subacute Toxicity

2016-09-26

四川省科技廳支撐計劃(NO：2015FZ0054)。

黃雨佳(1988-)，女，漢族，研究生在讀，研究方向為外科護理應用技術與應用基礎研究。E-mail:289416092@qq.com.

劉珉甬(1952-)，女，漢族，本科，教授，研究方向為外科護理應用技與應用基礎研究。E-mail:1047986020@qq.com.

R

A

1007-8517(2016)23-0046-03