上海市番茄潰瘍病的確診及其防控對(duì)策

陳 磊，羅金燕，趙玉強(qiáng)，余 慧，姚紅梅

（上海市農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣服務(wù)中心，上海 201103）

上海市番茄潰瘍病的確診及其防控對(duì)策

陳 磊，羅金燕，趙玉強(qiáng)，余 慧，姚紅梅

（上海市農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣服務(wù)中心，上海 201103）

番茄潰瘍病是由密執(zhí)安棒形桿菌密執(zhí)安亞種（Clavibactermichiganensis subsp.michiganensis）引起的番茄最具毀滅性病害之一，在松江區(qū)3個(gè)大棚內(nèi)發(fā)現(xiàn)可疑番茄病株。大棚內(nèi)采集的發(fā)病植株經(jīng)南京農(nóng)業(yè)大學(xué)病原物分離培養(yǎng)和PCR檢測，檢測出番茄潰瘍病菌。為進(jìn)一步確認(rèn)，筆者對(duì)分離到的菌株進(jìn)行了致病性測定，對(duì)接種病原物進(jìn)行了再分離，經(jīng)?；悦庖咴嚰垪l檢測和PCR檢測，確定為番茄潰瘍病菌。同時(shí)，總結(jié)出一套適用于上海的綜合防控措施。

番茄潰瘍??；致病性測定；免疫試紙條檢測；PCR檢測；防控措施

番茄潰瘍病是由密執(zhí)安棒形桿菌密執(zhí)安亞種（Clavibacter michiganensis subsp.michiganensis，Cmm）引起的番茄最具毀滅性病害之一，既是我國進(jìn)境植物檢疫對(duì)象，又是全國農(nóng)業(yè)植物檢疫對(duì)象。番茄幼苗至結(jié)果期均可發(fā)生潰瘍病，主要表現(xiàn)為葉片凋萎或蜷縮，似缺水狀，莖內(nèi)部變褐，并向上下擴(kuò)展，后至中空，最后下陷或開裂呈潰瘍狀，莖略變粗，生出許多不定根，嚴(yán)重時(shí)全株枯死。在切開病株時(shí)可發(fā)現(xiàn)中間呈褐色腐爛，濕度大時(shí)，莖稈中還會(huì)溢出白色菌膿。此病特有的癥狀為病果表面產(chǎn)生鳥眼狀壞死斑，稱為“鳥眼斑”［1-3］。該病自從1909年首次在美國溫室番茄上發(fā)現(xiàn)以來，現(xiàn)已廣泛分布于美國各番茄產(chǎn)區(qū)，并逐漸成為世界性病害。1943—1946年期間，該病在英國大流行，使番茄罐頭工業(yè)受到嚴(yán)重影響。1991年法國因該病番茄減產(chǎn)20%～30%［4］。

國內(nèi)有關(guān)番茄潰瘍病的記載始于1954年，當(dāng)時(shí)在大連市場上采集到2個(gè)癥狀頗似潰瘍病的番茄果實(shí)［5］。李明遠(yuǎn)等［6］于1980年6月在北京首次發(fā)現(xiàn)此?。ǔ柼枌m公社八隊(duì)病株率13%），因受條件所限，未能確認(rèn)病因，至1986年初才正式報(bào)道北京發(fā)生。隨后，山西、內(nèi)蒙古、遼寧、黑龍江、新疆、安徽、天津、廣西、江蘇、貴州、河南等地區(qū)都相繼報(bào)道發(fā)生［4，5，7-15］。2014年6月上海市農(nóng)業(yè)植物檢疫人員在松江區(qū)3個(gè)大棚內(nèi)發(fā)現(xiàn)可疑番茄病株，發(fā)病面積1 000 m2。大棚內(nèi)采集的發(fā)病植株經(jīng)南京農(nóng)業(yè)大學(xué)病原物分離培養(yǎng)和PCR檢測，檢測出番茄潰瘍病菌，這是上海市首次發(fā)現(xiàn)番茄潰瘍病疫情。為進(jìn)一步確認(rèn)，筆者對(duì)分離到的菌株進(jìn)行了柯赫氏法則驗(yàn)證。疫情發(fā)生后，上海市農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣服務(wù)中心在上海市范圍進(jìn)行普查，未在其他地方新發(fā)現(xiàn)疫情，但松江區(qū)發(fā)生該病的3個(gè)番茄大棚損失率均在50%以上。同時(shí)，由筆者擬定的番茄潰瘍病的處置意見和防控技術(shù)方案指導(dǎo)開展相關(guān)防控處置工作，疫情處置近兩年來，上海市未再發(fā)生番茄潰瘍病，由此總結(jié)出一套適合上海地區(qū)推廣的綜合防控措施。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 主要試劑和試劑盒

番茄潰瘍病菌檢測試紙條購自美國Agdia公司，細(xì)菌DNA提取試劑盒購自TIANGEN公司，PCR試劑購自TaKaRa公司，引物由英濰捷基（上海）貿(mào)易有限公司合成。

1.1.2 供試細(xì)菌菌株

番茄潰瘍病菌標(biāo)準(zhǔn)菌株BX由中國農(nóng)業(yè)大學(xué)提供，菌株SH1406由南京農(nóng)業(yè)大學(xué)從采自松江區(qū)新浜鎮(zhèn)的發(fā)病番茄植株上分離得到。

1.1.3 供試番茄

致病性測定的供試番茄品種為合作908（已報(bào)道為感病品種）［3］，購自上海長種番茄種業(yè)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 常規(guī)細(xì)菌學(xué)鑒定

革蘭氏染色反應(yīng)采用結(jié)晶紫草酸銨染色法，氧化酶試驗(yàn)、過氧化氫酶試驗(yàn)、明膠液化試驗(yàn)參照常規(guī)的植病研究方法［16］。

1.2.2 過敏性反應(yīng)和致病性的測定

將待測菌株BX、SH1406在YDC固體培養(yǎng)基平板上25℃培養(yǎng)72 h后，再用無菌ddH2O配制成108～109CFU·m L-1的菌懸液。采用打頂法［17］接種于播種后培育21～28 d的2～3片真葉期番茄幼苗（播種前種子用0.01%醋酸溶液浸泡消毒處理24 h），每菌接12株幼苗，以無菌ddH2O為空白對(duì)照（CK）。接種后植株置于人工氣候箱生長，氣候箱從7：30—18：30提供光照，且溫度保持在30℃，其余保持在24℃。接種后7～21 d觀察番茄上的發(fā)病情況。同時(shí)用菌懸液注射煙草葉片，接種36～54 h后觀察煙草葉片接種處有無過敏性反應(yīng)（Hypersensitive Reaction，HR）。

1.2.3 發(fā)病植株病原菌的再分離及檢測鑒定

病原菌的再分離與純化。選取顯癥植株，剪取病部1～2 cm莖段，置于滅菌后的培養(yǎng)皿內(nèi)加入無菌水200μL，擠壓出莖部組織液，用接種環(huán)蘸取組織液在LB培養(yǎng)基上畫線分離培養(yǎng)，置于25℃下培養(yǎng)3～4 d，根據(jù)菌落形態(tài)選擇淡黃色的單菌落，在YDC培養(yǎng)基平板上純化。

?；悦庖咴嚰垪l檢測。使用從美國Agdia公司購買的檢測Cmm專用的免疫試紙條，對(duì)發(fā)病植株進(jìn)行檢測，以是否出現(xiàn)陽性反應(yīng)檢測線作為判斷依據(jù)。

PCR檢測。對(duì)病原菌的再分離與純化中分離純化的細(xì)菌在YDC液體培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，提取DNA。按照Dreier等［18］和Cho等［19］報(bào)道的番茄細(xì)菌性潰瘍病菌特異性引物Cmm5/Cmm6（引物序列：Cmm5為5′-GCGAATAAGCCCATATCAA-3′；Cmm6為5′-CGTCAGGAGGTCGCTAATA-3′）和Cmm 141F/Cmm141R（引物序列；Cmm141F為5′-CAG GCGTCCGTCGGTGAGGTGGTC-3′；Cmm141R為5′-GCGGGAGAGCGGTGCGGGAATG-3′）分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系為10×PCR Buffer（Mg2+plus）2.5μL，2.5 mmol·L-1dNTP 2μL，5U·μL Taq DNA聚合酶0.2μL，上、下游引物（20μmol·L-1）各0.5μL，模板DNA 1μL，無菌ddH2O補(bǔ)充至25μL。反應(yīng)條件參照相關(guān)文獻(xiàn)［18-19］。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳和溴化乙啶（EB）染色后用凝膠成像系統(tǒng)分析，觀測是否得到614和141 bp的特異性擴(kuò)增產(chǎn)物。

2 結(jié)果與分析

2.1 生理生化測定

對(duì)菌株SH1406進(jìn)行4項(xiàng)生理生化測定，結(jié)果顯示與標(biāo)準(zhǔn)菌株BX一致，即革蘭氏染色反應(yīng)陽性，氧化酶試驗(yàn)反應(yīng)陰性，氧化酶試驗(yàn)反應(yīng)陽性，明膠液化能力較弱。

2.2 過敏性、致病性測定

通過過敏性反應(yīng)測試，菌株SH1406與菌株BX一樣可激發(fā)煙草的HR（過敏性）反應(yīng)（圖1）。接種7 d后觀察，所接種的番茄幼苗未顯現(xiàn)明顯潰瘍病癥狀；接種后14～21 d觀察，2個(gè)菌株接種的幼苗均不同程度出現(xiàn)子葉萎蔫、莖壞死、植株死亡等典型細(xì)菌性潰瘍病癥狀（圖2），表明菌株SH1406確為番茄潰瘍病菌。

圖1 煙草過敏性反應(yīng)檢測結(jié)果

2.3 病原物再分離和檢測

通過LB和YDC培養(yǎng)基分離純化顯癥植株表明，從接種的病株上能夠再次分離純化獲得培養(yǎng)性狀與BX和SH1406一致的菌落，經(jīng)純化后的分離物在YDC培養(yǎng)基上呈黃色黏稠狀菌落。而從無菌水接種處理的幼苗上未能分離獲得培養(yǎng)性狀與BX和SH1406相似的菌落。免疫試紙條檢測結(jié)果顯示表明，BX和SH1406接種處理的病株能夠使?；栽嚰垪l呈陽性反應(yīng)，CK處理呈陰性反應(yīng)（圖3）。用特異性引物Cmm5/Cmm6和Cmm141F/ Cmm141R分別對(duì)從接種的病株上獲得分離物的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳后觀察結(jié)果，可見到特異性的614和141 bp擴(kuò)增片段（圖4）。

圖2 打頂接種21 d發(fā)病結(jié)果

圖3 免疫試紙條檢測結(jié)果

圖4 PCR電泳檢測結(jié)果

3 綜合防控措施

對(duì)松江新浜新發(fā)生番茄潰瘍病的3個(gè)大棚立即進(jìn)行封鎖，及時(shí)拔除了番茄植株并就地堆放在大棚內(nèi)，待植株曬干后集中進(jìn)行深埋，同時(shí)對(duì)栽培設(shè)施進(jìn)行消毒處理，防止該病害的擴(kuò)散蔓延。根據(jù)該病的發(fā)生規(guī)律和上海市番茄的種植情況，提出以下防控策略。

嚴(yán)格植物檢疫。番茄潰瘍病是典型的種傳病害，在番茄繁（育）種過程中須嚴(yán)格執(zhí)行產(chǎn)地檢疫，嚴(yán)禁從疫情發(fā)生區(qū)向非疫區(qū)調(diào)種。對(duì)調(diào)入的種子、秧苗、果實(shí)等要加強(qiáng)檢疫復(fù)檢，嚴(yán)禁帶菌種子銷售。對(duì)種植區(qū)加強(qiáng)普查和監(jiān)測，一旦發(fā)現(xiàn)疫情，及時(shí)向當(dāng)?shù)刂参餀z疫機(jī)構(gòu)報(bào)告，并采取有效的控制封鎖措施。

建立無病留種田。種子繁育時(shí)，要選擇無病田塊，開展田間檢驗(yàn)，防止生產(chǎn)帶菌種子。

種子消毒處理。溫湯浸種：先將種子在涼水中浸泡10 m in，撈出后將種子放入55℃溫水中浸30 min，不斷攪拌，并隨時(shí)補(bǔ)充熱水。藥劑浸種：選用0.6%醋酸溶液浸種24 h，或用72%農(nóng)用鏈霉素2 000倍液浸種2 h，或用1.5%次氯酸鈉浸種30～40 m in，取出沖凈晾干后催芽。干熱處理：將充分干燥的種子放入70℃恒溫箱中滅菌72 h，此法效果顯著。

加強(qiáng)田間管理。選擇未種過茄科蔬菜的地塊作為苗床，避免大水漫灌，采用滴灌或滲灌，防止病菌傳播。避免露水未干時(shí)進(jìn)行整枝打杈等農(nóng)事操作，栽培管理過程中減少對(duì)番茄的機(jī)械傷害，雨后及時(shí)排水，一旦發(fā)現(xiàn)番茄潰瘍病病株，立即拔除病株及病殘?bào)w，集中帶離棚室進(jìn)行深埋，降低菌源和損失。

高溫悶棚土壤消毒。選擇夏季溫度較高的時(shí)期，密閉溫室大棚，可殺死土壤中殘留的病菌，防止病害傳播。清除大棚內(nèi)病殘?bào)w和田間雜草后，每667 m2均勻撒施1 000 kg豬糞等腐熟或半腐熟有機(jī)肥和50 kg碳酸氫銨，翻耕整地后灌大水至土壤充分濕潤后，覆蓋地膜，封閉大棚，保持棚內(nèi)高溫高濕狀態(tài)3周。

輪作倒茬。種植番茄等茄科作物要與非茄科植物實(shí)行輪作倒茬3年以上。

藥劑防治。在發(fā)病初期，可選用72%農(nóng)用鏈霉素4 000倍液和77%氫氧化銅（可殺得）500倍液，對(duì)番茄地上部植株進(jìn)行噴藥，隔7～10 d噴1次，連續(xù)施藥2～3次，以徹底消滅病菌。

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（責(zé)任編輯：張瑞麟）

S436

：B

：0528-9017（2016）12-2054-04

文獻(xiàn)著錄格式：陳磊，羅金燕，趙玉強(qiáng)，等.上海市番茄潰瘍病的確診及其防控對(duì)策［J］.浙江農(nóng)業(yè)科學(xué)，2016，57（12）：2054-2057.

10.16178/j.issn.0528-9017.20161241

2016-06-22

上海市市級(jí)農(nóng)口系統(tǒng)青年人才成長計(jì)劃（滬農(nóng)青字（2015）第4-7號(hào)）；上海市科技興農(nóng)重點(diǎn)攻關(guān)項(xiàng)目（滬農(nóng)科攻字（2014）第7-3-1號(hào)）

陳 磊（1982—），男，上海人，農(nóng)藝師，碩士，從事植物疫情監(jiān)測與防控工作，E-mail：chenlei200524@126.com。