春繁期補飼花粉和橡膠蜂蜜對中蜂囊狀幼蟲病的防控探究

張學文，楊 爽，2*，宋文菲，苗春輝，陳順安，黃新球，羅衛(wèi)庭

（1.云南省農(nóng)業(yè)科學院蠶桑蜜蜂研究所，云南蒙自 661101；2.山西農(nóng)業(yè)大學動物科技學院，山西太谷 030801）

春繁期補飼花粉和橡膠蜂蜜對中蜂囊狀幼蟲病的防控探究

張學文1，楊 爽1，2*，宋文菲1，苗春輝1，陳順安1，黃新球1，羅衛(wèi)庭1

（1.云南省農(nóng)業(yè)科學院蠶桑蜜蜂研究所，云南蒙自 661101；2.山西農(nóng)業(yè)大學動物科技學院，山西太谷 030801）

中蜂囊狀幼蟲病（簡稱中囊?。┦俏：χ腥A蜜蜂養(yǎng)殖最為嚴重的病毒病，中蜂一旦感染中蜂囊狀幼蟲病毒（Chinese sacbrood virus，CSBV），很難治愈。為研究營養(yǎng)飼喂對中囊病的防治效果，在春繁期定期對已檢測患中囊病的蜂群補充飼喂花粉和橡膠蜂蜜，利用RT-PCR技術檢測飼喂后蜂群中成年工蜂、工蜂幼蟲和雄蜂幼蟲感染CSBV情況。結果顯示，補飼花粉和橡膠蜂蜜后，感染CSBV蜂群中成年工蜂、工蜂幼蟲和雄蜂幼蟲均攜帶CSBV，染病率分別為91.7%、50.0%和100.0%，但蜂群“爛子”明顯減輕，患病蜂群由顯性感染轉(zhuǎn)為隱性感染。表明春繁期補充飼喂花粉和橡膠蜂蜜對中囊病有一定的防控效果，能提高蜂群的抗病力，但不能根除CSBV。

中華蜜蜂；囊狀幼蟲病；春繁期；花粉；橡膠蜂蜜；補充飼喂

蜜蜂囊狀幼蟲病（sacbrood disease）簡稱囊幼病，又叫尖頭病、囊雛病，是由囊狀幼蟲病毒（sacbrood virus，SBV）感染引起的一種對蜜蜂幼蟲危害巨大的傳染病［1］，感染SBV的蜜蜂幼蟲皮下積累大量蛻皮液不能化蛹［2］，極大地影響蜂群的群勢和生產(chǎn)能力。感染中華蜜蜂的囊幼病被稱為中蜂囊狀幼蟲?。ê喎Q中囊病），病原為中蜂囊狀幼蟲病毒（Chinese sacbrood virus，CSBV）［3］。蜂群一旦患上中囊病，很難治愈。目前，對于中囊病主要采取預防為主的策略，包括降低巢內(nèi)濕度、補充蜂群營養(yǎng)、提高蜂群抵抗力等［4］。

中囊病的發(fā)生與外界氣候、蜜源、蜂種等有密切的關系，具有明顯的季節(jié)性，多發(fā)生在春繁和秋繁季節(jié)［5］，發(fā)病初期，患病死蟲被工蜂消除或封蓋后的幼蟲被工蜂咬破，蜂王重新產(chǎn)卵，封蓋子脾出現(xiàn)嚴重的“花子現(xiàn)象”，即“花子脾”和“穿孔子脾”。CSBV主要危害蜜蜂幼蟲，也能侵染蜂蛹和幼年成蜂，CSBV在成蜂體內(nèi)繁殖，特別是在工蜂的咽下腺和雄蜂的腦內(nèi)積累，感染CSBV的工蜂并不會表現(xiàn)出明顯的臨床癥狀［6］，但CSBV在其體內(nèi)潛伏時間很長，會縮短成蜂壽命，并引起其生理和行為的改變［7-8］。

春繁期蜂群開始擴巢育子，蜂群子脾大，群內(nèi)幼蟲多，一旦蜂群缺蜜或花粉，幼蟲就會營養(yǎng)不良，使得抵抗力也下降，為CSBV的繁殖提供了良好的條件［9］。營養(yǎng)充足是蜂群健康和增強抗病力的重要基礎，胡宗文等［10-11］報道春繁期補充飼喂花粉對中蜂群勢有促進作用，蜂群封蓋子數(shù)量隨飼喂花粉時間的推移逐漸增加；同時，補充飼喂花粉的幼蜂在形態(tài)學特征上更接近于正常發(fā)育的成年蜂，補飼花粉能促進工蜂的健康發(fā)育。CSBV的季節(jié)性變化，從某種程度上反映出蜂群對于病毒具有不同的抵抗力［4］。鑒于此，為研究營養(yǎng)飼喂對中囊病的防治效果，在春繁期定期對已檢測患中囊病的蜂群飼喂花粉和橡膠蜂蜜，利用RT-PCR技術檢測飼喂后蜂群中成年工蜂、工蜂幼蟲和雄蜂幼蟲染CSBV情況，以期為中囊病的傳播機理和防控提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

實驗蜂群（3群）由云南省農(nóng)業(yè)科學院蠶桑蜜蜂研究所提供，2015年10月檢測實驗蜂群內(nèi)成年工蜂和雄蜂精液均攜帶CSBV；蜂蜜為橡膠蜂蜜，花粉為雜花粉和代用花粉，均由云南省普洱蜜海養(yǎng)蜂農(nóng)業(yè)專業(yè)合作社提供。

總RNA提取試劑Trizol、TaKaRa One Step RNA PCR Kit（AMV）購自TaKaRa公司，其余試劑均為國產(chǎn)或進口分析純試劑。

1.2 蜂群飼喂和樣本采集

花粉飼喂。雜花粉、代用粉、白糖按1∶1∶1比例，用水調(diào)成團，蒸15 min成餅，放框梁，間隔5 d飼喂1次，飼喂時間2015年12月26日至2016年3月10日。

糖水飼喂。白糖和水按1∶1比例，每群200mL，于2015年12月30-31日飼喂2次。

蜂蜜飼喂。按每群0.3 kg橡膠蜂蜜，持續(xù)不間斷飼喂蜂群，飼喂時間2016年1月20日至2月21日。

飼喂后樣品采集時間為2016年3月29日，每群采集成年工蜂、工蜂幼蟲和雄蜂幼蟲各10只，-80℃保存。

1.3 總RNA提取

將樣品分裝于1.5 m L離心管內(nèi)，各加入1 m L Trizol，用玻璃研棒充分勻漿，靜置5 min，加入200μL氯仿，震蕩，靜置2 min，4℃12 000 r· min-1離心15 min；取上清液300μL，加等量的異丙醇，混勻，靜置10 min，4℃10 000 r·min-1離心10 min；沉淀以75%DEPC酒精洗，4℃10 000 r· min-1離心5 min；倒去酒精，真空抽干，用40μL RNase Free dH2O溶解，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 引物設計和RT-PCR擴增

根據(jù)GenBank中SBV全序列保守區(qū)段設計擴增CSBV片段基因引物，上游引物：5’-ACCAACCGATTCCTCAGTAG-3’，下游引物：5’-CCTTGGAACTCTGCTGTGTA-3’。RT-PCR擴增體系（20μL）：RNase Free dH2O 8.7μL，MgCl2（25 mmol·L-1）4.0μL，10×One Step RNA PCR Buffer 2.0μL，dNTP Mixture（10 mmol·L-1）2.0μL，RNase Inhibitor（40 U·μL-1）0.3μL，AMV Reverse Transcriptase XL（5 U·μL-1）0.3μL，AMV-Optimized Taq polymerase（5 U·μL-1）0.3μL，上、下游引物各0.8μL，RNA 0.8μL。反應條件：50℃反轉(zhuǎn)錄30 min，94℃預變性2 min，94℃變性30 s，54℃退火30 s，72℃延伸1 m in，共35個循環(huán)。產(chǎn)物于1%的瓊脂糖凝膠上進行電泳檢測。

2 結果與分析

2.1 飼喂前采樣觀察和RT-PCR檢測結果

飼喂前，采樣觀察群1、群2、群3蜂群封蓋子脾“爛子”嚴重；RT-PCR檢測群1、群2、群3雄蜂精液和成年工蜂各5個樣本，結果（圖1—2）顯示，雄蜂精液染病率分別為100%、100%和40%，成年工蜂3群染病率均為100%，蜂群表現(xiàn)為顯性感染。

圖1 雄蜂精液CSBV檢測結果

圖2 雄蜂精液和成年工蜂CSBV檢測結果

2.2 飼喂后采樣觀察和RT-PCR檢測結果

飼喂后，采樣觀察群1封蓋子脾“爛子”嚴重，群2、群3無“爛子”現(xiàn)象，觀察不出患病情況；RT-PCR檢測群1、群2、群3成年工蜂、工蜂幼蟲和雄蜂幼蟲各4個樣本，結果（圖3—5）顯示，成年工蜂、工蜂幼蟲和雄蜂幼蟲均攜帶CSBV，染病率分別為91.7%、50.0%和100.0%，群1表現(xiàn)為顯性感染，群2、群3表現(xiàn)為隱性感染。

圖3 群1成年工蜂和工蜂幼蟲CSBV檢測結果

圖4 群2成年工蜂和雄蜂幼蟲CSBV檢測結果

圖5 成年工蜂、雄蜂和工蜂幼蟲CSBV檢測結果

3 小結與討論

春繁期間，蜂群群勢增長激烈，蛋白質(zhì)的攝入量對蜂群增長起決定性作用。蜂群營養(yǎng)不良是發(fā)生疾病的重要誘因，保證蜂群充足而全面的營養(yǎng)是預防和治療蜂病的重要措施［12］。試驗中對檢測患有中囊病的蜂群定期補飼花粉、糖水和橡膠蜂蜜，發(fā)現(xiàn)蜂群中“花子脾”和“穿孔子脾”明顯減少，其中群2、群3補充飼喂前幼蟲爛子嚴重，飼喂后已觀察不出患病癥狀，說明春繁期補充飼喂對中囊病有一定的防治效果，這與劉俊峰等［13］研究報道相符，即春繁期蜂群內(nèi)蜂花粉短缺，營養(yǎng)供不上，會出現(xiàn)幼蟲被拖等情況。春繁期蜂群中充足的蛋白質(zhì)供給不僅能保障蜜蜂健康發(fā)育，而且強壯的體格在防御外敵入侵和獲得充足的食物中有明顯優(yōu)勢，也為蜜蜂在復雜多變的環(huán)境中生存繁殖提供了基礎。

通過RT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)補充飼喂后蜂群中成年工蜂、工蜂幼蟲和雄蜂幼蟲均攜帶CSBV，染病率分別為91.7%、50.0%和100.0%，與飼喂前雄蜂精液CSBV感染率80%和成年工蜂CSBV感染率100%一致，表明春繁期補充飼喂花粉和橡膠蜂蜜不能根除CSBV。試驗中患病蜂群在補充飼喂花粉和橡膠蜂蜜后無明顯發(fā)病癥狀，可能是補充飼喂后，蜂群內(nèi)蜜粉源充足，蜂群群勢恢復，繁育新蜂，增強了蜂群對病害的抵抗能力，患病蜂群由顯性感染轉(zhuǎn)為隱性感染，這與宋文菲等研究報道的蜂群中CSBV隱形感染大于顯性感染一致［14-15］。CSBV隱性感染雖不出現(xiàn)臨床癥狀，但病毒仍在寄主體內(nèi)增殖并通過寄主散播傳染。春繁季節(jié)，外界氣候多變，蜂群易出現(xiàn)蜜粉源供應不足，此時潛伏在蜜蜂體內(nèi)的病毒可能受蜂群內(nèi)外環(huán)境的變化而突發(fā)癥狀。因此，在春繁期，應適當補充飼喂額外的花粉和蜂蜜，以滿足蜂群的生長繁殖，進而控制中囊病的爆發(fā)。

［1］ 周亮，王振國，宋戰(zhàn)昀，等.蜜蜂囊狀幼蟲病RNA依賴的RNA聚合酶部分基因的克隆和序列分析［J］.中國畜牧獸醫(yī)，2010，37（11）：50-52.

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［3］ 楊冠煌，張弓弨，杜芝蘭.中蜂囊狀幼蟲病病原鑒定［J］.中國蜂業(yè)，1979（5）：17-18.

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［6］ ANDERSON D L，GIBBS A J.Transpuparial transmission of Kashmir bee virus and sacbrood virus in the honey bee（Apis mellifera）［J］.Annals of Applied Biology，1989，114（1）：1-7.

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［8］ BAILEY L.The multiplication and spread of sacbrood virus of bees［J］.Annals of App lied Biology，1969，63（3）：483-491.

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［13］ 劉俊峰，劉光楠，顏偉玉，等.三種人工飼料對中華蜜蜂春繁的影響［J］.江西農(nóng)業(yè)大學學報，2011，33（1）：137-140.

［14］ 宋文菲，沈登榮，楊爽，等.蜜蜂囊狀幼蟲病毒多聚蛋白基因遺傳結構分析［J］.西南師范大學學報（自然科學版），2015（7）：102-107.

［15］ 宋文菲，張學文，張祖蕓，等.中蜂囊狀幼蟲病病毒檢測及地區(qū)間遺傳變異［J］.中國農(nóng)學通報，2013（17）：42-46.

（責任編輯：盧福莊）

S895.1

：A

：0528-9017（2016）12-2114-03

文獻著錄格式：張學文，楊爽，宋文菲，等.春繁期補飼花粉和橡膠蜂蜜對中蜂囊狀幼蟲病的防控探究［J］.浙江農(nóng)業(yè)科學，2016，57（12）：2114-2117.

10.16178/j.issn.0528-9017.20161261

2016-09-20

國家蜂產(chǎn)業(yè)技術體系專項（CARS-45-SYZ 17）；國家自然科學基金（31560676）

張學文（1965-），男，云南永仁人，副研究員，從事蜜蜂資源、飼養(yǎng)及授粉研究工作，E-mail：zxw216226@163.com。通信作者：楊 爽，E-mail：yangshuang19860724@163.com。