COPD患者Th17細(xì)胞和Treg細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答變化及免疫失衡與肺功能的關(guān)系研究

門 翔 尚喜雨

(河南省南陽市中心醫(yī)院呼吸內(nèi)科一病區(qū),南陽473000)

COPD患者Th17細(xì)胞和Treg細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答變化及免疫失衡與肺功能的關(guān)系研究

門 翔 尚喜雨①

(河南省南陽市中心醫(yī)院呼吸內(nèi)科一病區(qū),南陽473000)

目的：探討慢性阻塞性肺疾病(COPD)患者外周血Th17細(xì)胞和調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg)及其介導(dǎo)的免疫應(yīng)答變化與患者肺功能的關(guān)系。方法：選取本院呼吸內(nèi)科收治的90例COPD患者(COPD組)和同期年齡、性別基本匹配的45例健康體檢對(duì)象作為對(duì)照組，并根據(jù)COPD病情進(jìn)行亞組分析，分別測(cè)定各組研究對(duì)象肺功能指標(biāo)、Th17細(xì)胞、Treg細(xì)胞及血清炎癥因子水平。結(jié)果：在COPD患者間，隨著病情加重，F(xiàn)EV1%、FVC%、FEV1/FVC比值中度COPD組<重度COPD組<極重度組(P<0.05)；在COPD患者間，隨著病情加重，外周血中Th17細(xì)胞、Th17/Treg比值中度COPD組<重度COPD組<極重度組(P<0.05)，外周血Treg細(xì)胞比值中度COPD組>重度COPD組>極重度組(P<0.05)，且外周血Th17細(xì)胞、Treg細(xì)胞相關(guān)細(xì)胞因子變化具有一致性；COPD患者的肺功能指標(biāo)FEV1%、FVC%、FEV1/FVC與外周血中Th17細(xì)胞、Th17/Treg比值呈顯著的負(fù)相關(guān)關(guān)系(P<0.05)，肺功能指標(biāo)FEV1%、FVC%、FEV1/FVC與外周血Treg比值呈顯著的正相關(guān)關(guān)系(P<0.05)。結(jié)論：COPD外周血Th17/Treg比值與患者肺功能下降具有顯著的相關(guān)性。

慢性阻塞性肺疾病；Th17細(xì)胞；調(diào)節(jié)性T細(xì)胞；免疫應(yīng)答；肺功能

慢性阻塞性肺疾病(Chronic obstructive pulmo-nary disease,COPD)是臨床常見的一種慢性氣道炎癥性疾病，其臨床特征為不可逆的氣流受限，主要表現(xiàn)為反復(fù)咳嗽、咳痰、氣促、進(jìn)行性肺功能下降。有研究發(fā)現(xiàn)，COPD的發(fā)生和進(jìn)展與易感性體重、環(huán)境污染、刺激性煙霧吸入等諸多因素相關(guān)，近年來隨著環(huán)境的惡化，COPD的發(fā)病率逐年遞增[1]。免疫學(xué)研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，COPD患者機(jī)體存在免疫功能紊亂，大量細(xì)胞因子、趨化因子破壞患者的自身免疫耐受，刺激免疫效應(yīng)細(xì)胞，近年來的大量研究表明，T細(xì)胞介導(dǎo)的自身免疫應(yīng)答在COPD的病程進(jìn)展中發(fā)揮著重要的作用[2]。

活化的CD4可分化為多種功能不同的效應(yīng)性T細(xì)胞，包括Th1、Th2、Th7、Treg細(xì)胞等。 其中Th17通過分泌炎性細(xì)胞因子介導(dǎo)自身免疫應(yīng)答，Treg細(xì)胞通過分泌抑炎性細(xì)胞因子抑制自身免疫應(yīng)答，使機(jī)體達(dá)到免疫耐受。Th17與Treg之間的平衡在保持免疫耐受、抑制自身免疫應(yīng)答中具有重要意義[3]。本研究探討了COPD患者外周血Th17細(xì)胞和Treg及其介導(dǎo)的免疫應(yīng)答變化與患者肺功能的關(guān)系，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 納入標(biāo)準(zhǔn) (1)COPD患者的診斷及病情分級(jí)依據(jù)中華醫(yī)學(xué)會(huì)呼吸病學(xué)分會(huì)、慢性阻塞性肺疾病全球防治策略(GOLD)中的標(biāo)準(zhǔn)；(2)所有COPD患者均在本院呼吸內(nèi)科經(jīng)過治療后處于穩(wěn)定期的患者；(3)自愿接受本次研究并簽定知情同意書。

1.1.2 排除標(biāo)準(zhǔn) (1)合并呼吸系統(tǒng)其他疾病(肺結(jié)核、支氣管擴(kuò)張、肺膿腫、肺癌等)；(2)伴有心力衰竭的患者；(3)伴有免疫系統(tǒng)疾病、類風(fēng)濕性疾病、全身感染性疾病的患者；(4)合并精神性疾病、認(rèn)知功能障礙的患者。

1.1.3 研究對(duì)象 選取本院呼吸內(nèi)科收治的90例COPD患者(COPD組)和同期年齡、性別基本匹配的45例健康體檢者(對(duì)照組)為研究對(duì)象。

COPD組90例患者，男54例、女36例，年齡范圍57～78歲，平均年齡(65.5±7.1)歲，體質(zhì)量指數(shù)(BMI)(23.3±2.6) kg/m2，吸煙32例，合并疾?。焊哐獕?1例、糖尿病19例，其他12例；GOLD疾病分級(jí)：中度33例、重度34例、極重度23例。對(duì)照組45例患者，男28例、女17例，年齡范圍54～75歲，平均年齡(66.1±6.9)歲，BMI(23.1±2.4)kg/m2，吸煙15例。兩組研究對(duì)象的年齡、性別及吸煙構(gòu)成無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

1.1.4 實(shí)驗(yàn)儀器與藥品 流式細(xì)胞儀，型號(hào)EPICS，美國貝克曼庫爾特公司。熒光定量PCR儀，型號(hào)ABI 7500，美國Applied Biosystems公司。酶標(biāo)儀，型號(hào)680，美國Bio Rad公司。低溫高速離心機(jī)，型號(hào)D-37520，德國Lengend RT公司。肺功能測(cè)定儀，型號(hào)chest-25F，日本捷斯特公司。本研究中所有試劑盒均購自上海源葉生物技術(shù)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 研究指標(biāo) 檢測(cè)并對(duì)象比各組研究對(duì)象的肺功能指標(biāo)：第一秒用力呼氣容積占預(yù)計(jì)值的百分比(FEV1%)、用力肺活量占預(yù)計(jì)值的百分比(FVC%)、FEV1/FVC；檢測(cè)并比較各組研究對(duì)象外周血中Th17細(xì)胞、Treg細(xì)胞所占比值；檢測(cè)各組研究對(duì)象的外周血細(xì)胞因子：白細(xì)胞介素-17A(IL-17A)、IL-1β、IL-6、IL-10的差異。

1.2.2 指標(biāo)檢測(cè)方法 肺功能測(cè)定時(shí)間安排在上午，使用沙丁胺醇200 μg，等待15 min后開始測(cè)定肺功能參數(shù)。

抽取空腹靜脈血2 ml，分離外周血單個(gè)核細(xì)胞，調(diào)節(jié)濃度為2×106個(gè)/ml，鋪至24孔板。在1640培養(yǎng)液中加入10%胎牛血清。每孔加入PMA 2.5 μl和離子霉素2 μl，混勻后放入37℃二氧化碳孵箱中刺激培養(yǎng)。進(jìn)行刺激培養(yǎng)4 h，每孔加入BFA 2 μl阻斷2 h后收集細(xì)胞，分別加入FITC標(biāo)記的CD3抗體和PE-Cy5標(biāo)記的CD8抗體，避光孵育 30 min，PBS緩沖液洗滌后加入固定破膜試劑盒中的試劑A固定，室溫避光孵育15 min。PBS緩沖液洗滌后加入試劑B，加入PE標(biāo)記的IL-17a單克隆抗體，避光孵育30 min。PBS緩沖液洗滌后以500 μl PBS緩沖液重懸細(xì)胞，上機(jī)分析檢測(cè)Th17細(xì)胞。PBMC加入FITC標(biāo)記的CD4單克隆抗體和PE-Cy5標(biāo)記的CD25單克隆抗體，胞內(nèi)標(biāo)記PE標(biāo)記Foxp3抗體，根據(jù)操作說明書檢測(cè)Treg細(xì)胞。

血清細(xì)胞因子IL-17A、IL-1β、IL-6、IL-10檢測(cè)采用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附法，按照試劑盒操作步驟。

2 結(jié)果

2.1 各組研究對(duì)象的肺功能測(cè)定 中度、重度和極重度COPD組患者的FEV1%、FVC%、FEV1/FVC比值均顯著低于對(duì)照組(P<0.05)，在COPD患者間，隨著病情加重，F(xiàn)EV1%、FVC%、FEV1/FVC比值中度COPD組<重度COPD組<極重度組(P<0.05)；見表1。

2.2 各組研究對(duì)象的外周血Th17、Treg細(xì)胞測(cè)定 中度、重度和極重度COPD組患者的外周血中Th17細(xì)胞、Th17/Treg比值均顯著高于對(duì)照組(P<0.05)、外周血Treg細(xì)胞比值顯著低于對(duì)照組(P<0.05)；在COPD患者間，隨著病情加重，外周血中Th17細(xì)胞、Th17/Treg比值中度COPD組<重度COPD組<極重度組(P<0.05)，外周血Treg細(xì)胞比值中度COPD組>重度COPD組>極重度組(P<0.05)；見表2。

2.3 各組研究對(duì)象的外周血細(xì)胞因子水平比較

GroupsnFEV1%FVC%FEV1/FVC(%)Controlgroup451042±781038±69830±62ModerateCOPDgroup33651±621)820±841)512±701)SevereCOPDgroup34398±561)2)794±811)2)401±591)2)Extremelyseveregroup23260±411)2)3)718±711)2)3)340±661)2)3)F470282219631047P<0001<0001<0001

Note：Compared with control group，1)P<0.05, with moderate COPD group,2)P<0.05, and severe COPD group，3)P<0.05.

GroupsnTh17cells(%)Tregcells(%)Th17/TregControlgroup45123±039337±084037±013ModerateCOPDgroup33252±0741)238±1291)106±0271)SevereCOPDgroup34619±1301)2)182±0551)2)357±0981)2)Extremelyseveregroup23683±1121)2)3)124±0261)2)3)551±1171)2)3)F10198251476171914P<0001<0001<0001

Note：Compared with control group，1)P<0.05, with moderate COPD group，2)P<0.05, and severe COPD group,3)P<0.05.

GroupsnIL?17A(pg/ml)IL?1β(pg/ml)IL?6(pg/ml)IL?10(pg/ml)Controlgroup452074±519339±0851586±21716938±1927ModerateCOPDgroup333609±7141)1391±2431)4981±5281)7980±12351)SevereCOPDgroup344785±9201)2)1685±3071)2)6338±7291)2)4116±9311)2)Extremelyseveregroup236033±13071)2)3)2385±4341)2)3)7945±8161)2)3)2985±6991)2)3)F39876831855128455903P<0001<0001<0001<0001

Note：Compared with control group,1)P<0.05, with moderate COPD group,2)P<0.05, and severe COPD group,3)P<0.05.

表4 COPD患者外周血Th17、Treg細(xì)胞與患者肺功能相關(guān)性

Tab.4 Correlation of peripheral blood Th17, Treg cells and pulmonary function in COPD patients

IndexFEV1%rPFVC%rPFEV1/FVC(%)rPTh17cells-0628<0001-0719<0001?0731<0001Tregcells0567<00010601<00010644<0001Th17/Treg-0694<0001-0793<0001-0821<0001

中度、重度和極重度COPD組患者的外周血IL-17A、IL-1β、IL-6均顯著高于對(duì)照組(P<0.05)、外周血IL-10顯著低于對(duì)照組(P<0.05)；在COPD患者間，隨著病情加重，外周血中IL-17A、IL-1β、IL-6值中度COPD組<重度COPD組<極重度組(P<0.05)，外周血IL-10值中度COPD組>重度COPD組>極重度組(P<0.05)；見表3。

2.4 COPD患者外周血Th17、Treg細(xì)胞與患者肺功能相關(guān)性 COPD患者的肺功能指標(biāo)FEV1%、FVC%、FEV1/FVC與外周血中Th17細(xì)胞、Th17/Treg比值呈顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系(P<0.05)，肺功能指標(biāo)FEV1%、FVC%、FEV1/FVC與外周血Treg比值呈顯著的正相關(guān)關(guān)系(P<0.05)；見表4。

3 討論

COPD是一種由多種炎性細(xì)胞共同參與的氣道高反應(yīng)性慢性炎癥，患者肺功能呈現(xiàn)進(jìn)行性損傷，不僅累及呼吸系統(tǒng)，隨著病程進(jìn)展還可累及全身各重要器官和系統(tǒng)，引起全身炎癥反應(yīng)綜合征、血管內(nèi)皮功能紊亂、凝血機(jī)能異常等問題[4]，有研究證實(shí)，機(jī)體免疫功能紊亂，尤其是T淋巴細(xì)胞的分泌和表達(dá)失衡是導(dǎo)致COPD發(fā)生的重要作用機(jī)制[5]。Treg在COPD的病程進(jìn)展中起著重要的免疫調(diào)節(jié)作用，正常情況下，Th細(xì)胞處于平衡狀態(tài)，機(jī)體生理防御、自身穩(wěn)定、免疫監(jiān)視等免疫功能良好，一旦Th平衡被破壞，引起Th1/Th2失衡、Th17細(xì)胞過度表達(dá)，可引起COPD的發(fā)生[6]。因此研究COPD患者外周血Th17細(xì)胞和Treg及其介導(dǎo)的免疫應(yīng)答變化對(duì)延緩病程進(jìn)展、改善患者預(yù)后具有積極的意義[7]。

免疫學(xué)機(jī)制在COPD的發(fā)病和進(jìn)展中的重要作用已得到臨床公認(rèn)，尤其是COPD患者自身抗原、自身免疫應(yīng)答所介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)的相關(guān)研究較多[8]。當(dāng)外界刺激引起氣道上皮損傷后，損傷的上皮細(xì)胞未完全被巨噬細(xì)胞所吞噬，進(jìn)而出現(xiàn)抗原改變而成為一種自身抗原，引發(fā)機(jī)體自身免疫應(yīng)答，導(dǎo)致或加重氣道炎癥損傷。巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、CD8、CD4等免疫細(xì)胞均參與了這一過程[9]，有研究發(fā)現(xiàn)，初始T細(xì)胞的分化方向與周圍微環(huán)境狀態(tài)有關(guān)[10]。如周圍環(huán)境中IL-6、IL-1β、TGF-β等炎癥性細(xì)胞因子濃度高時(shí)，初始T細(xì)胞向Th17細(xì)胞方向分化；如周圍環(huán)境中僅TGF-β濃度高時(shí)，初始T細(xì)胞向Treg細(xì)胞方向分化[11]。Th17/Treg比值越大，提示機(jī)體炎癥反應(yīng)狀態(tài)越嚴(yán)重[12]。

本研究對(duì)不同病情程度的COPD患者的肺功能、外周血細(xì)胞炎癥因子水平、Th17/Treg比值等情況進(jìn)行對(duì)比分析，發(fā)現(xiàn)隨著COPD病情的加重，患者FEV1%、FVC%、FEV1/FVC比值也發(fā)生變化，對(duì)照組>中度COPD組>重度COPD組>極重度COPD組。這一結(jié)果提示，隨著COPD病情的加重，患者肺功能呈現(xiàn)進(jìn)行性下降的趨勢(shì)，這一點(diǎn)與已有的臨床研究結(jié)論一致。

對(duì)不同病情COPD患者外周血中Th17細(xì)胞、Treg細(xì)胞、Th17/Treg比值進(jìn)行對(duì)比分析發(fā)現(xiàn)，隨著COPD病情的加重，患者外周血中Th17細(xì)胞、Th17/Treg比值對(duì)照組<中度COPD組<重度COPD組<極重度COPD組，而外周血Treg細(xì)胞對(duì)照組>中度COPD組>重度COPD組>極重度COPD組，且外周血Th17細(xì)胞、Treg細(xì)胞相關(guān)細(xì)胞因子變化具有一致性。這一結(jié)果提示，隨著COPD病情的加重，患者外周血中Th17細(xì)胞、Th17/Treg比值進(jìn)行性升高，Treg細(xì)胞進(jìn)行性下降，機(jī)體炎癥反應(yīng)程度不斷加重。

對(duì)不同病情COPD患者外周血中炎性細(xì)胞因子水平進(jìn)行對(duì)比分析發(fā)現(xiàn)，中度、重度和極重度COPD組患者的外周血IL-17A、IL-1β、IL-6均顯著高于對(duì)照組，外周血IL-10顯著低于對(duì)照組。在COPD患者間，隨著病情加重，外周血中IL-17A、IL-1β、IL-6值對(duì)照組<中度COPD組<重度COPD組<極重度COPD組，外周血IL-10值對(duì)照組>中度COPD組>重度COPD組對(duì)于極重度COPD組，這一結(jié)果提示，隨著COPD病情的加重，患者機(jī)體炎癥反應(yīng)程度不斷加重。

相關(guān)性分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，COPD患者的肺功能指標(biāo)FEV1%、FVC%、FEV1/FVC與外周血中Th17細(xì)胞、Th17/Treg比值呈顯著的負(fù)相關(guān)關(guān)系，肺功能指標(biāo)FEV1%、FVC%、FEV1/FVC與外周血Treg比值呈顯著的正相關(guān)關(guān)系。本研究結(jié)果表明，COPD外周血Th17/Treg比值與患者肺功能下降具有顯著的相關(guān)性。

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[收稿2016-01-18 修回2016-02-14]

(編輯 張曉舟)

Relationship of immune response and immune imbalance mediated by Th17 cells and Treg cells with pulmonary function in COPD patients

MEN Xiang，SHANG Xi-Yu.

Department of Respiratory Medicine, Nanyang Central Hospital, Nanyang 473000,China

Objective:To investigate the relationship of the immune response and immune imbalance mediated by Th17 cells and Treg cells with pulmonary function in chronic obstructive pulmonary disease (COPD) patients.Methods:90 COPD patients and 45 healthy volunteers with matched age and sex were selected.The COPD patients were divided into 2 groups according to the patient's condition.45 healthy volunteers were collected as the control group.The lung function, Th17 cells, Treg cells and serum levels of inflammatory cytokines were detected and compared.Results:In COPD patients, the FEV1%, FVC%, FEV1/FVC, Th17,Th17/Treg and inflammatory cytokines had increased in an order of moderate COPD, severe COPD and very severe COPD (P<0.05).Treg had increased in an order of very severe COPD, severe COPD and moderate COPD (P<0.05).FEV1%, FVC% and FEV1/FVC were negatively correlated with Th17 and Th17/Treg (P<0.05).FEV1%, FVC% and FEV1/FVC were positively correlated with Treg (P<0.05).Conclusion:Th17/Treg in peripheral blood of COPD patients is significantly correlated with the decrease of pulmonary function.

Chronic obstructive pulmonary disease;Th17 cells;Regulatory T cells;Immune response;Pulmonary function

10.3969/j.issn.1000-484X.2016.12.022

門 翔(1980年-)，女，碩士，主治醫(yī)師，主要從事呼吸內(nèi)科，E-mail：mmmxxx_11@sina.com。

及指導(dǎo)教師：尚喜雨(1969年-)，女，碩士，副教授，主要從事腫瘤學(xué)方面的研究，E-mail：shangxiyu163@163.com。

R730.3

A

1000-484X(2016)12-1826-04

①河南省南陽醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)?；A(chǔ)部，南陽473000。