鹽酸吡格列酮對糖尿病大鼠腎組織TOLL受體4/MAPKs信號通路的影響

聶 鑫 余益本 文格波

(湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬東風(fēng)醫(yī)院老年病科，十堰442000)

鹽酸吡格列酮對糖尿病大鼠腎組織TOLL受體4/MAPKs信號通路的影響

聶 鑫 余益本①②文格波②

(湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬東風(fēng)醫(yī)院老年病科，十堰442000)

目的：探討吡格列酮對糖尿病腎病大鼠腎組織中TOLL受體4/MAPKs信號通路的影響。方法：將雄性SD隨機分為對照組(n=8)和試驗組(n=32)。試驗組SD鼠造模成功后隨機分為3組進行干預(yù),應(yīng)用Western blot檢測對照組和干預(yù)組大鼠腎組織中絲裂原活化蛋白激酶ERK1/2及p38MAPK磷酸化水平。結(jié)果：與對照組比較，各組大鼠腎組織中TOLL受體4表達增強，其中ERK1/2與JNK磷酸化水平明顯升高(P<0.05)，但p38MAPK水平變化不明顯(P>0.05)；與模型組比較，吡咯列酮干預(yù)組大鼠腎組織中ERK1/2與p38MAPK磷酸化水平降低 (P<0.05)。結(jié)論：吡格列酮通過TOLL受體4/MAPKs/ERK1/2與TOLL受體4/MAPKs/JNK信號通路來完成，延緩糖尿病腎病的發(fā)生與發(fā)展。

鹽酸吡格列酮；糖尿病腎??；TOLL受體4/MAPKs信號通路

糖尿病腎病是導(dǎo)致終末期腎衰竭的重要原因之一，目前認為糖尿病腎病受多方面因素的影響，包括遺傳因素、血流動力學(xué)異常、高糖相關(guān)的生化代謝異常等。近年免疫、炎癥學(xué)說備受關(guān)注，TLR(TOLL-like receptors，TLR)是促使免疫炎癥反應(yīng)加重的重要因素之一,發(fā)現(xiàn)TLR是介導(dǎo)免疫和炎癥反應(yīng)的橋梁[1]。我們在前期研究中，用鹽酸吡格列酮對糖尿病大鼠進行干預(yù)后能減少腎組織微血管TOLL受體4表達[2]，但鹽酸吡格列酮改善糖尿病腎臟疾病通過何種機制的報道尚不多見?，F(xiàn)通過研究鹽酸吡格列酮對糖尿病腎組織TOLL受體4/MAPKs下游信號蛋白磷酸化的表達，了解其治療糖尿病腎病的可能作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料 雄性SD大鼠40只，6周齡，體質(zhì)量100～200 g，購自湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬東風(fēng)醫(yī)院動物實驗部，許可證編號SCXK(鄂)2014-01346 ；鏈脲佐菌素(STZ)購自Sigma公司；鹽酸吡格列酮(15 mg/片)由杭州中美華東制藥有限公司提供；兔抗小鼠TOLL受體4、p-ERK、p-p38MAPK及p-JNK抗體由武漢寶曼公司提供。①40只雄性清潔級SD大鼠，喂養(yǎng)1周，隨機分為正常對照組(n=8)和造模組(n=32)。將32只大鼠按50 mg/kg通過腹腔注射STZ，在72 h后測3次隨機血糖≥16.7 mmol/L為糖尿病大鼠模型，有24只大鼠造模成功，作為實驗組(n=24)[3]。將成模大鼠隨機分為3組，每組8只：模型組，小劑量吡格列酮組6 mg/(kg·d)，大劑量吡格列酮組12 mg/(kg·d)。②在造模成功后開始干預(yù)，實驗組及正常對照組僅給予12 mg/(kg·d)生理鹽水灌胃，低劑量組、高劑量組分別給予吡格列酮6、12 mg/(kg·d)灌胃。上午8點給藥，連續(xù)8周。

1.2 方法

1.2.1 糖尿病大鼠腎臟組織病理學(xué)分析 實驗結(jié)束時，大鼠經(jīng)氯胺酮麻醉后，取腹正中切口暴露雙腎及腹主動脈，經(jīng)腹主動脈插管，用冷PBS將雙腎充分灌洗后，取左腎經(jīng)腎門冠狀面取組織，石蠟切片，厚4 μmol/L，行HE染色。送湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬東風(fēng)醫(yī)院病理教研室進行HE染色分析，了解大鼠腎臟組織病變情況。

1.2.2 Western blot檢測蛋白的表達 檢測大鼠腎組織，立即放入預(yù)冷的裂解緩沖液中，4℃超聲粉碎，離心 30 min，取上清，Bradford 法測定蛋白濃度。用10% 的SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE) 分離蛋白質(zhì)，電泳后將 PAGE凝膠中的蛋白質(zhì)電轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，取出膜放至3% BSA 阻斷緩沖液中，振蕩封閉1 h，TBS洗膜 3 次，每次 10 min。將膜放入一抗中(抗體1∶500 稀釋)，4℃過夜。10 min×3次洗膜后加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗(抗體1∶500 稀釋) 37℃振蕩 1 h，用大量 TBS液 10 min×3 次洗膜后用 ECL試劑暗室內(nèi)膠片曝光,測定TOLL受體4,經(jīng)X膠片曝光顯影，并用GIS1000分析軟件將圖片上每個特異條帶灰度值的數(shù)字化。

2 結(jié)果

2.1 大鼠腎臟組織病理改變 光鏡下觀察：正常對照組大鼠腎臟表面光滑，形狀正常；光鏡下見腎小球結(jié)構(gòu)清晰，球囊壁光滑，未見增大及萎縮；腎小管上皮細胞呈方形，大小整齊一致；基底膜完整，間質(zhì)中無纖維組織增生，炎癥細胞浸潤。模型組多數(shù)大鼠腎臟體積增大，光鏡下腎小球肥大，腎小球明顯充血、腫脹，腎小球內(nèi)細胞數(shù)目明顯增多,基底膜不規(guī)則增厚、皺曲，腎小囊腔變窄，部分腎小管亦明顯擴張，上皮細胞破碎程度加深、明顯水腫。小劑量吡格列酮組大鼠腎組織系膜基質(zhì)增生減輕，少數(shù)腎小管擴張，上皮細胞水腫減輕，糖原空泡減少。大劑量吡格列酮組大鼠腎組織系膜基質(zhì)增生明顯減輕，腎小管無擴張，上皮細胞輕微水腫。見圖1。

2.2 大鼠腎臟組織中TOLL受體4蛋白的表達 正常對照組大鼠腎臟組織TOLL受體4蛋白表達較弱,與正常對照組比較,模型組、小劑量吡格列酮組、大劑量吡格列酮組TOLL受體4表達明顯增強,有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與模型組比較, 小劑量吡格列酮組、大劑量吡格列酮組TOLL受體4蛋白表達明顯減弱,有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見圖2、3。

圖1 大鼠腎組織HE染色(HE，×400)Fig.1 HE staining of rat renal tissues(HE,×400)Note:A.Normal control group;B.Model group;C.Low-dose pioglitazone group;D.Large-dose pioglitazone group.

圖2 Western blot 免疫印跡檢測大鼠腎組織中TOLL受體4蛋白表達Fig.2 Expression of TOLL-like receptor 4 protein in rat renal tissues by Western blotNote:A.Normal control group;B.Model group;C.Low-dose pioglitazone group;D.Large-dose pioglitazone group.

圖3 大鼠組織TOLL受體4蛋白表達的比較Fig.3 Comparison of four groups′ expression of TOLL-like receptor 4 protein in rat renal tissuesNote:Compared with control group,*.P<0.05,compared with model group,#.P<0.05.A.Normal control group;B.Model group;C.Low-dose pioglitazone group;D.Large-dose pioglitazone group.

圖4 Western blot免疫印跡檢測大鼠腎組織ERK1/2表達變化Fig.4 Expression of ERK1/2 protein in rat renal tissues by Western blotNote:A.Normal control group;B.Model group;C.Low-dose pioglitazone group;D.Large-dose pioglitazone group.

圖5 大鼠腎組織ERK1/2表達的比較Fig.5 Comparison of four groups′ expression of ERK1/2 protein in rat renal tissuesNote:Compared with control group,*.P<0.05；compared with model group,#.P<0.05.

2.3 糖尿病大鼠腎臟組織中TOLL樣受體4/MAPKs信號通路被激活 Western blot檢測發(fā)現(xiàn)，與正常組比較，其余3組大鼠腎組織ERK1/2與p38MAPK磷酸化水平明顯升高(P<0.05)，其中模型組大鼠腎組織ERK1/2是正常對照組的5倍，而JNK水平變化不明顯(P>0.05)，見圖4～7。結(jié)果顯示糖尿病大鼠腎組織TOLL受體4/MAPKs信號通路處于激活狀態(tài)。

圖6 Western blot免疫印跡檢測大鼠腎組織p38MAPK表達變化Fig.6 Expression of p38MAPK protein in rat renal tissues by Western blotNote:A.Normal control group;B.Model group;C.Low-dose pioglitazone group;D.Large-dose pioglitazone group.

圖7 大鼠腎組織p38MAPK表達的比較Fig.7 Comparison of four groups′ of expression of p38MAPK protein in rat renal tissuesNote:Compared with control group,*.P<0.05；compared with model group，#.P<0.05.

圖8 Western blot免疫印跡檢測大鼠腎組織JNK表達變化Fig.8 Expression of JNK protein in rat renal tissues by Western blotNote:A.Normal control group;B.Model group;C.Low-dose pioglitazone group;D.Large-dose pioglitazone group.

2.4 鹽酸吡格列酮對糖尿病大鼠腎臟組織中TOLL受體4/MAPKs信號通路的影響 與模型組比較，發(fā)現(xiàn)鹽酸吡咯列酮干預(yù)組大鼠腎組織ERK1/2磷酸化水平降低 (P<0.05)，以10 mg/(kg·d)最明顯(P<0.05) 。此外，Western blot免疫印跡檢測發(fā)現(xiàn)干預(yù)組大鼠腎組織p38MAPK表達也有下降(P<0.05)，而JNK水平無明顯變化(如圖3、4、8、9)。

圖9 大鼠腎組織JNK表達的比較Fig.9 Comparison of four groups′ expression of JNK protein in rat renal tissuesNote:Compared with control group,*.P<0.05；compared with model group,#.P<0.05.

3 討論

研究發(fā)現(xiàn)，大鼠腎組織TOLL受體4 的表達顯著提高，其激活后，主要通過兩條信號路徑：TOLL受體4/NF-κB 和TOLL受體4/MAPKs，調(diào)節(jié)各種免疫和炎癥介質(zhì)的基因表達[4]。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了幾條并行的MAPKs有關(guān)的信號通路,分別為ERK1/2、JNK/SAPK和p38等[5]。研究表明絲裂原活化蛋白激酶(MAPK) 信號通路廣泛存在于哺乳動物細胞中，導(dǎo)致一系列與糖尿病腎病相關(guān)的細胞因子、炎癥因子、趨化因子等的合成與釋放，加速了糖尿病腎病發(fā)生與發(fā)展[6，7]。我們研究發(fā)現(xiàn)，糖尿病大鼠腎組織TOLL受體4/MAPKs信號通路處于激活狀態(tài)，主要由TOLL受體4/MAPKs/ERK1/2與TOLL受體4/MAPKs/p38MAPK兩條下游信號通路參與糖尿病腎病的發(fā)生與發(fā)展。

噻唑烷二酮類藥物(TZDs)鹽酸吡格列酮與胰島素抵抗、糖脂類代謝及肪細胞的分化關(guān)系密切，此外還具有抑制血管平滑肌細胞的增生和遷移，調(diào)節(jié)巨噬細胞中促炎癥因子生成，抗動脈粥樣硬化等生物學(xué)效應(yīng)[8-11]。但鹽酸吡格列酮是否對糖尿病大鼠腎臟組織TOLL受體4及其下游信號產(chǎn)生影響尚未見報道，研究在鹽酸吡格列酮干預(yù)下，糖尿病大鼠腎組織TOLL受體4蛋白表達明顯減弱，表明其能抑制TOLL受體4的活性[2]。為了進一步探究TOLL受體4/MAPKs信號通路在鹽酸吡格列酮抗炎作用中的作用，測定了ERK1/2、JNK和p38MAPK的磷酸化水平。結(jié)果顯示同糖尿病腎病模型組相比，干預(yù)組可以有效地抑制ERK1/2和p38MAPK的磷酸化，綜合以上實驗 ，TOLL受體4/MAPKs信號通路激活后，可能參與了糖尿病腎病病理發(fā)生發(fā)展,我們初步可認為鹽酸吡格列酮能作為TOLL受體4的內(nèi)源性藥物靶點，使TOLL受體4表達減弱，進而減少ERK1/2和p38MAPK磷酸化來完成，延緩糖尿病腎病的進展。綜上所述，初步證實了TOLL受體4/MAPKs/ERK1/2與TOLL受體4/MAPKs/p38MAPK信號通路的激活可能參與了糖尿病腎病病理進程，但TOLL受體4/MAPKs信號通路激活后是如何進一步影響糖尿病腎病的進程有待研究證明。

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[收稿2016-03-03 修回2016-04-29]

(編輯 許四平)

Role of TOLL-like receptor 4/MAPKs pathway of renal tissue in diabetic rats by pioglitazone

NIE Xin,YU Yi-Ben,WEN Ge-Bo.

Department of Gerontology,the Dongfeng Hospital Affiliated to Hubei University of Medicine,Shiyan 442000,China

Objective:To study the role of TOLL-like receptor4/MAPKs pathway of renal tissue in the diabetic rats treated with piogitazone.Methods:The male Sprague Dawlry rats were randomly selected as the control group (n=8) and experimental group(n=32).The experimental rats were randomly divided into three groups.The expression of ERK1/2,JNK and p38MAPK,and levels of their phosphorylation in kidney were measured by Western blot in control group and experimental group.Results:The expression of TOLL-like receptor 4 in all renal tissue in the diabetic rats were significantlyincreased than those in control group (P<0.01).Compared with the control group.The activity of p-ERK1/2 and p38MAPK significantly increased in each experimental group (P<0.05),but the expression level of p-JNK was no statistical significance.TOLL-like receptor 4 could regulatory effect on the phorylation of ERK1/2 and p38MAPK.Compared with the model group,the expression of p-ERK1/2 and p38MAPK significantly decreased(P<0.05),moreover,these changes were more significant in high-dose treated group (P<0.05).Conclusion:Pioglitazone inhibits the expression of TOLL-like receptor 4 of renal tissue in the diabetic rats,and these effects may be related to TOLL-like receptor 4/ERK1/2 and TOLL-like receptor 4/p38MAPK pathways.

Pioglitazone;Diabetic nephropathy;TOLL-like receptor 4/MAPKs signaling pathway

10.3969/j.issn.1000-484X.2016.12.009

聶 鑫(1970年-)，女，碩士，主要從事糖尿病及其并發(fā)癥的研究，E-mail：niexin1970@163.com。

及指導(dǎo)教師：余益本(1986年-)，男，碩士，主要從事糖尿病血管病變分子免疫機理方面的研究，E-mail：yuyiben@126.com。

R392.5

A

1000-484X(2016)12-1769-04

①南華大學(xué)病原生物學(xué)重點實驗室，衡陽421001。

②南華大學(xué)國家臨床醫(yī)學(xué)研究中心，衡陽421001。