RAC1基因多態(tài)性對Rac1-GTP蛋白表達(dá)水平的影響①

劉亞妮 周嘉黎 楊春曉 羅小梅 楊婷玉 張 玉 師少軍 黃怡菲

(華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院藥劑科，武漢430022)

·基礎(chǔ)免疫學(xué)·

RAC1基因多態(tài)性對Rac1-GTP蛋白表達(dá)水平的影響①

劉亞妮 周嘉黎 楊春曉 羅小梅 楊婷玉 張 玉 師少軍 黃怡菲②

(華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院藥劑科，武漢430022)

目的：考察RAC1基因多態(tài)性與Rac1-GTP蛋白表達(dá)水平的相關(guān)性。方法：選擇182例健康漢族志愿者，經(jīng)TaqMan-MGB探針等位基因分型技術(shù)測定RAC1基因中的4個標(biāo)簽單核苷酸多態(tài)性(tag single nucleotide polymorphism,tag-SNPs)位點(diǎn)的基因型，采用酶聯(lián)免疫吸附法測定其血漿中的Rac1-GTP蛋白表達(dá)水平。分析Rac1-GTP蛋白表達(dá)水平的分布特點(diǎn)；對RAC1基因4個tag-SNPs不同基因型間Rac1-GTP蛋白表達(dá)水平進(jìn)行比較。結(jié)果：Rac1-GTP蛋白表達(dá)水平在健康漢族人群中呈現(xiàn)正偏態(tài)分布，女性中的表達(dá)水平高于男性(P<0.05)；隨著年齡的增加有降低的趨勢，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。Rac1-GTP蛋白表達(dá)水平在位點(diǎn)rs702482和rs10951982基因型間存在顯著性差異(P<0.05)，但在位點(diǎn)rs702483和rs6954996基因型間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。結(jié)論：在健康漢族人群中RAC1基因多態(tài)性存在影響Rac1-GTP蛋白表達(dá)水平的SNP位點(diǎn)。

RAC1；基因多態(tài)性；Rac1-GTP；蛋白表達(dá)水平；漢族健康人群

Ras相關(guān)的C3肉毒素底物1(Ras-related C3 botulinum toxin substrate 1，Rac1)蛋白是小G蛋白Rho超家族Rac亞家族中關(guān)鍵成員之一，廣泛分布于各種組織，是細(xì)胞內(nèi)重要的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子。Rac1在調(diào)整細(xì)胞骨架與遷移、細(xì)胞的增殖分化與凋亡、細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控、腫瘤的轉(zhuǎn)移與侵襲、機(jī)體免疫調(diào)節(jié)等方面發(fā)揮重要的生物學(xué)作用[1-4]。Rac1蛋白由位于人第7號染色體上的RAC1基因編碼，RAC1基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物具有Rho-GTPase結(jié)合區(qū)，使Rac1蛋白具有結(jié)合和水解GTP核苷酸的能力，從而使Rac1蛋白在具有活性的GTP結(jié)合形式和無活性的GDP結(jié)合形式之間進(jìn)行轉(zhuǎn)換[4]。Rac1的生物學(xué)功能發(fā)揮依賴于此兩種結(jié)合形式間的轉(zhuǎn)換。RAC1基因序列上堿基的突變可能引起Rac1蛋白活性表達(dá)的改變。已有研究表明，Rac1蛋白活性的表達(dá)與卵巢癌、肺癌、腎功能損害、心臟功能受損、炎癥性腸病等疾病的發(fā)生及發(fā)展相關(guān)[5-8]。此外，RAC1的基因多態(tài)性和Rac1蛋白活性已被證明與嘌呤類免疫抑制藥的療效和不良反應(yīng)有關(guān)[9]。因此，分析RAC1基因多態(tài)性對Rac1蛋白表達(dá)的影響，有利于預(yù)測疾病的風(fēng)險(xiǎn)及藥物的療效和不良反應(yīng)。

本課題組前期建立了人RAC1基因上8個單核苷酸多態(tài)性(Single nucleotide polymorphisms,SNPs)位點(diǎn)基因型的測定方法，經(jīng)過對150例湖北地區(qū)漢族健康志愿者RAC1基因上這8個SNPs的基因型分析，篩選出4個代表性的tag-SNPs(rs702482、rs10951982、rs702483、rs6954996)[10,11]。本研究通過建立Rac1-GTP活性蛋白表達(dá)水平的測定方法，進(jìn)一步篩選健康志愿者并測定其血漿中Rac1-GTP活性蛋白表達(dá)的水平，并對Rac1-GTP活性蛋白水平和RAC1基因上的4個tag-SNPs基因型的相關(guān)性進(jìn)行了分析，旨在探討RAC1基因多態(tài)性對Rac1-GTP蛋白表達(dá)的影響，為進(jìn)一步研究RAC1基因多態(tài)性與藥物效應(yīng)及相關(guān)疾病之間的關(guān)系奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 儀器與試劑 7900HT型熒光定量PCR儀、NanoDrop1000微量紫外分光光度計(jì)(賽默飛世爾科技有限公司)；EnSpire多模式微孔板檢測儀(美國PerkinElmer公司)；TaqMan Genotyping Master Mix試劑盒、TaqMan SNP Genotyping Assay Mix試劑盒(含引物和探針)、熱啟動Taq DNA聚合酶(美國ABI公司)；人Rac1-GTP結(jié)合蛋白酶聯(lián)免疫分析試劑盒(Elabscience Biotechnology Co.,Ltd)；血液/細(xì)胞/組織基因組DNA提取試劑盒(離心柱型，北京天根生化科技有限公司)。

1.1.2 研究對象 選取2014年2～3月期間于武漢協(xié)和醫(yī)院體檢中心進(jìn)行體檢的182例健康受試者作為研究對象，男女各半。年齡23～85歲，平均(44.7±12.1)歲，性別間年齡分布無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.33)。所有研究對象均為漢族，無血緣關(guān)系；無心、肝、腎、消化道、神經(jīng)系統(tǒng)等病史，無腫瘤病史；體格檢查、ECG、胸片、B超及實(shí)驗(yàn)室檢查均未見臨床意義的異常。該研究項(xiàng)目通過華中科技大學(xué)醫(yī)學(xué)倫理委員會的審批。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)本采集與處理 采集健康受試者靜脈血3 ml，經(jīng)EDTA抗凝，于3 000 r/min離心10 min，取離心后的上層血漿置于-70℃以下冰箱中保存用于Rac1-GTP結(jié)合蛋白水平的測定。再將分離后的白細(xì)胞層采用DNA提取試劑盒進(jìn)行基因組DNA提取，按照試劑盒的說明書操作。提取后的DNA經(jīng)微量紫外分光光度儀進(jìn)行濃度與純度的測定，濃度均在1～20 ng/μl之間，OD260/OD280值均在1.6～2.0之間，純度滿足要求。將測定合格后的DNA置于-70℃以下冰箱中保存用于基因型分析。

1.2.2 基因型分析[11]采用實(shí)時熒光TaqMan-MGB探針等位基因分型技術(shù)對課題組前期篩選出的4個tag-SNPs(rs702482、rs10951982、rs702483、rs6954996)進(jìn)行基因分型檢測。10 μl的PCR反應(yīng)體系包括：5 μl TaqMan? Genotyping Master Mix，1.0 μl TaqMan? SNP Genotyping Assay Mix，1.0 μl DNA樣本，3 μl 純化水。PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性4 min，激活A(yù)mpli Taq酶；然后94 ℃變性30 s，60℃退火1 min，72℃延伸30 s，共45個循環(huán)，72℃最終延伸2 min。反應(yīng)結(jié)束由ABI Prism? 7900HT實(shí)時熒光PCR等位基因辨別系統(tǒng)(SDS v2.3 Allelic Discrimination Software)確定各DNA樣本的基因分型結(jié)果。對4個tag-SNPs位點(diǎn)的各基因分型PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行DNA測序驗(yàn)證。

1.2.3 Rac1-GTP結(jié)合蛋白水平測定 人血漿中Rac1-GTP結(jié)合蛋白表達(dá)水平的測定采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測，選用人Rac1-GTP ELISA試劑盒。嚴(yán)格按照試劑盒使用說明書方法對稀釋后的標(biāo)準(zhǔn)品及樣品進(jìn)行加樣、溫育、洗滌、加酶、顯色、加終止液。終止反應(yīng)后15 min內(nèi)于酶標(biāo)儀依序測定各孔的450 nm波長處的吸光度。人血漿樣本中Rac1-GTP結(jié)合蛋白表達(dá)水平的結(jié)果由標(biāo)準(zhǔn)曲線讀取。

2 結(jié)果

2.1RAC1基因分型 實(shí)時熒光TaqMan-MGB探針等位基因分型測定結(jié)果與測序結(jié)果完全一致，各tag-SNPs位點(diǎn)的基因分型測序驗(yàn)證結(jié)果，見圖1。4個tag-SNPs位點(diǎn)基因型的分布，經(jīng)χ2檢驗(yàn)均符合Hardy-weinberg遺傳平衡，性別間分布無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，見表1。

表1 各tag-SNPs位點(diǎn)的基因型分布

Tab.1 Genotypic distributions of 4 tag-SNPs

SNPsGenotypeTotal[n(%)]Male[n(%)]Female[n(%)]P1)P2)rs702482AA53(291)26(286)27(297)019061AT82(451)44(484)38(418)TT47(258)21(231)26(286)rs10951982GG118(648)60(659)58(637)026085GA54(297)27(297)27(297)AA10(55)4(44)6(66)rs702483AA134(736)66(725)68(747)072079AG45(247)24(264)21(231)GG3(16)1(11)2(22)rs6954996GG133(731)67(736)66(725)093073GA45(247)23(253)22(242)AA4(22)1(11)3(33)

Note：1)Hardy-Weinberg equilibrium test;2)Comparison between male and female subjects.

圖1 各tag-SNPs位點(diǎn)基因分型測序圖Fig.1 Representative figures of direct sequencing for four tag-SNPs

2.2 Rac1-GTP結(jié)合蛋白活性分布 182例健康受試者的血漿樣本經(jīng)ELISA法測定，Rac1-GTP結(jié)合蛋白表達(dá)水平為(222.30±108.85)ng/L，通過Kolmogorov-Smirnov正態(tài)性檢驗(yàn)，Rac1-GTP結(jié)合蛋白表達(dá)水平呈正偏態(tài)分布(偏度=1.921，P<0.05)，見圖2A；將數(shù)據(jù)進(jìn)行對數(shù)轉(zhuǎn)化后，符合正態(tài)分布(P=0.23)，見圖2B。

將數(shù)據(jù)經(jīng)對數(shù)轉(zhuǎn)化后進(jìn)行單因素方差分析，考察年齡和性別因素是否會影響Rac1-GTP蛋白的表達(dá)。Rac1-GTP蛋白在男、女性別間的表達(dá)分別為(199.83±88.75) ng/L和(244.76±122.20) ng/L，女性中Rac1-GTP蛋白的表達(dá)高于男性；性別間存在顯著性差異(P<0.05)。將受試者按年齡分為青年組(18～40歲)、中年組(41～60歲)和老年組(≥61歲)隨著年齡的增加Rac1-GTP結(jié)合蛋白的表達(dá)水平有降低的趨勢，但經(jīng)對數(shù)轉(zhuǎn)化后的方差分析顯示在三個年齡組間表達(dá)無顯著性差異(P>0.05)，見表2。

圖2 Rac1-GTP表達(dá)水平分布圖Fig.2 Distribution of Rac1-GTP expression levelsNote:A.Data without log-transform;B.Data with log-transform.

表2 不同性別、年齡組間Rac1-GTP蛋白表達(dá)水平

Tab.2 Rac1-GTP expression levels in different gender and age groups

GroupnRac1?GTPlevel(ng/L)P1)Gender0003Male9119983±8875Female9124476±12220Age21-407023207±10268040641-609521770±11672≥611720772±88130

Note：1)Analysis of variance with log-transformed data.

表3 4個tag-SNPs不同基因型間Rac1-GTP蛋白表達(dá)水平

Tab.3 Rac1-GTP expression levels in different genotypes of four tag-SNPs

SNPsGenotypeRac1?GTPlevel(ng/L)P1)rs702482AA2650±147200037AT2114±8560TT1931±7774rs10951982GG2409±120700023GA1930±7319AA1611±5917rs702483AA2260±115906600AG2149±8806GG1690±3822rs6954996GG2299±115501300GA1974±8561AA2517±8857

Note：1)Analysis of variance with log-transformed data.

圖3 RAC1基因型與Rac1-GTP表達(dá)水平相關(guān)性Fig.3 Association analysis of RAC1 genotypes with Rac1-GTP expression levelsNote: *.P<0.05；**.P<0.01；ns.P>0.05.

2.3RAC1基因型與Rac1-GTP結(jié)合蛋白活性的相關(guān)性RAC1基因4個tag-SNPs不同基因型對應(yīng)的Rac1-GTP蛋白表達(dá)水平及比較，如表3和圖3所示。由結(jié)果可知：Rac1-GTP蛋白表達(dá)水平在位點(diǎn)rs702482和rs10951982基因型間存在顯著性差異(P<0.05)，在位點(diǎn)rs702483和rs6954996基因型間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。

3 討論

RAC1是細(xì)胞內(nèi)重要的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子，具有多種生物學(xué)功能，如調(diào)整細(xì)胞骨架與遷移、抑制細(xì)胞凋亡、調(diào)控細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子等；廣泛地分布于全身各組織中[1-4]。

因具有Rho-GTPase高度親和結(jié)合區(qū)，Rac1蛋白在體內(nèi)以具有活性的GTP結(jié)合形式和無活性的GDP結(jié)合形式之間進(jìn)行轉(zhuǎn)換[4]，而生物功能的發(fā)揮與GTP結(jié)合時激活密切相關(guān)。Rac1由RAC1基因編碼，其蛋白表達(dá)水平可因RAC1基因堿基的突變而發(fā)生改變。SNP是最普遍的一種基因突變形式，與蛋白個體化表達(dá)差異密切相關(guān)。目前關(guān)于RAC1基因多態(tài)性對Rac1蛋白表達(dá)的影響尚未見報(bào)道，而已報(bào)道的文獻(xiàn)主要與疾病相關(guān)性及藥物療效差異有關(guān)。如已有研究發(fā)現(xiàn)Rac1蛋白在結(jié)腸癌、乳腺癌、胃癌、肺癌等患者中存在高表達(dá)現(xiàn)象[12,13]；RAC1基因的部分SNP位點(diǎn)對某些疾病呈現(xiàn)易感性，如黑色素瘤、炎癥性腸疾病、高血壓等[8,14,15]。此外，嘌呤類免疫抑制藥因通過抑制RAC1的下游靶基因表達(dá)和阻斷Rac1活性，發(fā)揮免疫抑制作用，進(jìn)而RAC1基因和Rac1蛋白對嘌呤類免疫抑制藥的療效及不良反應(yīng)的差異有影響[9]。本研究以健康志愿者為研究對象，選擇測定Rac1-GTP活性蛋白的表達(dá)水平；以課題組前期研究基礎(chǔ)篩選出的4個tag-SNPs作為RAC1基因多態(tài)性的位點(diǎn)，考察RAC1基因多態(tài)性對Rac1-GTP蛋白表達(dá)的影響，希望能找出與Rac1-GTP蛋白相關(guān)的基因多態(tài)性位點(diǎn)，進(jìn)一步為揭示疾病和藥物效應(yīng)相關(guān)性的分子機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

本研究入選182名健康受試者，按照年齡匹配，男女各半。所篩選的4個SNP位點(diǎn)的基因型頻率分布均符合Hardy-Weinberg遺傳平衡，表明選擇的人群具有代表性；并且無性別間的分布差異(P>0.05)。4個SNP位點(diǎn)的基因型頻率與前期研究結(jié)果及HAPMAP數(shù)據(jù)庫中亞洲人群的報(bào)道相接近，但是與非洲和歐洲人群的報(bào)道有較大差異。本研究所報(bào)道的中國健康人群攜帶rs702482位點(diǎn)AA基因型的頻率(29.1%)遠(yuǎn)低于歐洲人群(96.7%)，而攜帶rs702483位點(diǎn)AA基因型的頻率(73.6%)遠(yuǎn)高于歐洲人群 (26.4%)。最小等位基因頻率rs702482/T (48.4%)和rs10951982/A (20.3%)分別遠(yuǎn)高于歐洲(1.7%)和非洲人群(2.5%)，rs702483/G (14.0%)和rs6954996/A (14.6%)分別明顯低于歐洲(49.1%)和非洲人群(23.3%)。提示RAC1基因上的這4個SNP位點(diǎn)的多態(tài)性存在地域或種族的差異。

完成RAC1基因上4個SNP位點(diǎn)基因分型測定后，進(jìn)一步考察了RAC1基因編碼的Rac1-GTP蛋白在182名健康受試者血漿中的表達(dá)水平。Rac1-GTP蛋白表達(dá)水平在中國健康人群中存在男低女高的趨勢(P<0.05)，4個SNP位點(diǎn)的基因型分布未見明顯差異(P>0.05)。提示可能存在其他位點(diǎn)的性別分布差異，進(jìn)而影響Rac1-GTP蛋白表達(dá)性別差異；亦或是男女性別的生理因素差異造成的。因已有大量文獻(xiàn)報(bào)道Rac1蛋白的表達(dá)與諸多疾病相關(guān)，進(jìn)而推測Rac1-GTP蛋白表達(dá)性別差異是否會造成相關(guān)疾病發(fā)病率的性別差異，有待大樣本的考察和深入的研究。雖然未觀察到Rac1-GTP蛋白的表達(dá)水平在年齡分組間的差異(P>0.05)，但是依舊呈現(xiàn)出了隨著年齡段的增加Rac1-GTP蛋白的表達(dá)水平降低的趨勢，可能是由于各年齡組樣本分布不均，老年組樣本量較少，未能滿足顯著性差異的樣本量統(tǒng)計(jì)，需要后期大樣本的進(jìn)一步證實(shí)。因?yàn)镽ac1-GTP蛋白表達(dá)水平的差異，使用嘌呤類免疫抑制的患者對于療效和不良反應(yīng)需要關(guān)注性別和年齡因素。

通過分析4個SNP位點(diǎn)的基因型與Rac1-GTP蛋白表達(dá)水平的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)rs702482位點(diǎn)攜帶AA基因型人群的Rac1-GTP蛋白表達(dá)水平高于AT和TT基因型(P<0.05)；rs10951982位點(diǎn)攜帶GG基因型人群的Rac1-GTP蛋白表達(dá)水平明顯高于GA和AA基因型。提示SNP位點(diǎn)rs702482和rs10951982的基因多態(tài)性對Rac1-GTP蛋白表達(dá)水平存在影響。

本研究僅分析了Rac1活性結(jié)合蛋白Rac1-GTP表達(dá)水平在健康人群中的分布特點(diǎn)，并發(fā)現(xiàn)了影響Rac1-GTP表達(dá)水平的RAC1基因多態(tài)性位點(diǎn)。已有研究表明Rac1在眾多腫瘤的發(fā)生、發(fā)展進(jìn)程中起著重要作用。Rac1-GTP在健康人群與腫瘤患者間的表達(dá)水平是否存在差異，差異是否會與RAC1基因多態(tài)性相關(guān)，需要開展大樣本的病例對照研究進(jìn)一步確定。課題組后期將擴(kuò)大樣本量并篩選納入腫瘤病例患者進(jìn)行對照研究，進(jìn)一步的綜合分析RAC1基因多態(tài)性與mRNA和Rac1蛋白表達(dá)的相關(guān)性，探究調(diào)控RAC1基因表達(dá)的機(jī)制。

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[收稿2016-03-31 修回2016-05-06]

(編輯 許四平)

Influence of RAC1 gene polymorphisms on Rac1-GTP expression levels

LIU Ya-Ni,ZHOU Jia-Li,YANG Chun-Xiao,LUO Xiao-Mei,YANG Ting-Yu,ZHANG Yu,SHI Shao-Jun,HUNAG Yi-Fei.

Department of Pharmacy,Affiliated Union Hospital,Tongji Medical College,Huazhong University of Science and Technology,Wuhan 430022,China

Objective:To study the association ofRAC1 gene polymorphisms with protein expression levels of Rac1-GTP.Methods:A total of 182 healthy Hans population in Hubei were recruited.The 4 tag-SNPs inRAC1 gene were genotyped by Real time TaqMan-MGB genotyping assay.And the Rac1-GTP protein levels in plasma samples from all participants were determined by enzyme linked immunosorbent assays (ELISA).The distribution characteristics of Rac1-GTP expression levels were also analyzed.Furthermore,the expression levels of Rac1-GTP were compared among different genotypes of the 4 tag-SNPs inRAC1 gene.Results:The distribution of Rac1-GTP expression levels was positive skewed in healthy Chinese Hans population.The expression levels were significantly higher in females than in males (P<0.05),and appeared in decreased trend with age,but without significant differences (P>0.05).Different expression levels of Rac1-GTP were observed in different genotypes for rs702482 and rs10951982 (P<0.05).However,no significant difference was found for rs702483 and rs6954996 (P>0.05).Conclusion:RAC1 genetic polymorphisms can potentially affect the expression levels of Rac1-GTP protein in healthy Chinese Hans population.

RAC1;Gene polymorphisms;Rac1-GTP;Protein expression levels;Healthy Chinese Hans population

10.3969/j.issn.1000-484X.2016.12.001

①本文為國家自然科學(xué)基金(No.81273591、No.81503161)、湖北省自然科學(xué)基金(No.2009CD-B380)和中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)資金(No.2014-YGYL003)資助項(xiàng)目。

劉亞妮(1980年-)，女，碩士，副主任藥師，主要從事遺傳藥理與藥代動力學(xué)相關(guān)研究，E-mail:yani_liu@hotmail.com。

R394

A

1000-484X(2016)12-1729-05

②通訊作者，E-mail:yf_huang2012@163.com。