多系統(tǒng)萎縮患者血清YKL-40和CD40水平變化及相關性因素研究

陳建文 周靖媛 張凱華 高松 趙莉 董春波

多系統(tǒng)萎縮患者血清YKL-40和CD40水平變化及相關性因素研究

陳建文 周靖媛 張凱華 高松 趙莉 董春波

目的 探討多系統(tǒng)萎縮(MSA)患者血清幾丁質酶3樣蛋白1(YKL-40)、CD40水平的變化，以及其與發(fā)病年齡、病程、疾病嚴重程度的相關性。 方法 病例組為2013-03-01—2014-11-30期間大連醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院神經內科的住院MSA患者30例，其中很可能MSA24例，可能MSA6例，均符合2008年修訂Gilman診斷標準；對照組為同期年齡和性別相匹配的30例健康體檢者。利用酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)檢測血清YKL-40與CD40水平，并分析兩者與MSA患者性別、年齡、發(fā)病年齡、病程和疾病嚴重程度〔以統(tǒng)一多系統(tǒng)萎縮評估量表(UMSARS)Ⅱ評分進行評估〕的相關性。 結果 MSA患者血清YKL-40水平〔38.32(11.74)ng/mL〕較對照組〔47.2(13.88 ng/mL〕降低(t=238.00，P=0.002)；對照組不同性別間〔男(36.23±9.74) ng/mL，女(36.50 ±10.86)ng/mL，t=0.519，P=0.477)〕及病例組不同分型間〔MSA-C型：40.67(13.09)ng/mL，MSA-P型：38.24(9.90)ng/mL，U=104.00，P=0.739〕比較血清YKL-40水平差異均無統(tǒng)計學意義。MSA患者血清中CD40水平〔120.39(39.47)pg/mL〕較對照組〔116.12(35.85) pg/mL〕差異無統(tǒng)計學意義(t=439.00，P=0.871)。對照組血清YKL-40水平與年齡無明顯相關性(P>0.05)，病例組血清YKL-40水平與患者發(fā)病年齡、病程和UMSARSⅡ評分均無相關性(均P>0.05)；ROC曲線分析顯示血清YKL-40水平對MSA無明確診斷價值(AUC=0.264，P=0.002)。 結論 MSA患者血清YKL-40水平較健康人顯著降低。MSA患者YKL-40水平與發(fā)病年齡、病程和UMSARSⅡ評分無相關性。

多系統(tǒng)萎縮；血清YKL-40；血清CD40；生物標記物

多系統(tǒng)萎縮(multiple system atrophy, MSA)是一種病因不明，以帕金森癥狀、小腦性共濟失調和自主神經功能紊亂為主要表現(xiàn)的神經系統(tǒng)變性疾病，其病理學標記是少突膠質細胞內含有大量嗜銀性纖維絲的少突膠質細胞包涵體(glial cytoplasmic inclusions，GCIs)形成，其主要成分是錯誤折疊、高度磷酸化及纖維狀的α-突觸核蛋白(α-synuclein, α-syn)。研究顯示，α-syn異常沉積與NF-κB(nuclear factor-κB)信號轉導體系的調控密切相關[1]。細胞因子幾丁質酶3樣蛋白1(chitinase 3-Like-1，YKL-40)和CD40的表達與NF-κB反應體系的激活密切相關。然而，MSA的致病過程中是否存在YKL-40和CD40表達的變化目前仍不清楚，本研究旨在探討MSA患者和健康人之間血清YKL-40、CD40水平的差異，以及其與MSA發(fā)病年齡、病程、疾病嚴重程度的相關性，以期尋求MSA的生物標記物，為深入研究其發(fā)病機制提供線索。

1 對象和方法

1.1 觀察對象 病例組：2013-03-01—2014-11-30期間作者醫(yī)院神經內科MSA住院患者30例，男21例、女9例，年齡為44～78歲，平均年齡為(62.03±9.93)歲，均符合2008年修訂的Gilman診斷標準[2]。其中很可能MSA患者24例，可能MSA患者6例。很可能MSA指自主神經功能障礙(如尿失禁、直立位低血壓)，外加多巴胺反應差的帕金森癥狀或小腦性共濟失調?？赡躆SA指帕金森癥狀或小腦性共濟失調，外加可疑的自主神經功能障礙(如無法解釋的尿頻、尿急、尿不盡、男性勃起功能障礙，明顯但未達到很可能MSA診斷標準的直立位低血壓)，并伴錐體束征、喘鳴等其他特征之一。30例患者中，首發(fā)癥狀為頭暈5例，言語不清2例，走路不穩(wěn)4例，動作笨拙7例，肢體震顫2例，性功能減退5例，尿便障礙4例，認知功能障礙1例；臨床亞型是以患者接受臨床評估時的癥狀及體征確定，其中以帕金森樣癥狀為主(MSA-P型)14例，以小腦性共濟失調為主(MSA-C型)16例。發(fā)病年齡43～76歲，平均(59.43±10.04)歲，病程為3～96個月，中位數(shù)(四分位數(shù)間距)為24.00(31.50)個月。

對照組：來自同期本院體檢中心的健康體檢者30名，男17名、女13名，年齡40～84歲，平均年齡為(65.23±11.13)歲。兩組在性別、年齡上相匹配(P性別=0.284，P年齡=0.497)。遵循知情同意原則，入組人員均被告知研究目的、內容及參與研究可能帶來的風險，并簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 疾病嚴重程度評估：采用統(tǒng)一多系統(tǒng)萎縮評估量表Ⅱ(unified multiple system atrophy rating scaleⅡ，UMSARS Ⅱ)評分評估，量表測試由兩名固定的神經內科醫(yī)師執(zhí)行。UMSARS Ⅱ由面部表情、語言、眼動異常、靜止性震顫、動作性震顫、張力增高、快速輪替、手指拍動、下肢靈活性、跟膝脛試驗、從坐位站起、姿勢、身體搖晃和步態(tài)14項組成，綜合評估了錐體外系受損和小腦受損導致的運動功能障礙，具有很好的評分者內信度[3]。UMSARS Ⅱ量表得分越高表示運動功能損傷的程度越重。

1.2.2 血清YKL-40與CD40水平檢測：采集入組人員晨空腹外周靜脈血3 mL于分離膠促凝管中，4000r/min離心5 min后提取血清分裝至EP 管中。血清樣本存放至-80℃冰箱內待用，避免反復凍融。采用雙抗體夾心法酶聯(lián)免疫吸附試驗〔試劑盒由美國R&D公司(R&D systems, Minneapolis，MN)生產〕，嚴格按照人YKL-40分子和人CD40分子ELISA檢測試劑盒說明書中標明的時間、加液量及操作步驟進行。運用酶標儀測定450 nm波長處各孔的吸光度〔D(λ)〕值，繪制標準曲線，按曲線方程計算各樣本濃度。本研究中，YKL-40的標準曲線方程為樣本水平=0.029D(λ)值+0.063，相對系數(shù)R2=0.997；CD40的標準曲線方程為樣本水平=0.007D(λ)值+0.037，R2=0.999。比較兩組間、對照組不同性別間、病例組不同分型患者間的水平，對差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)者，進一步行相關分析。

1.2.3 相關性分析：血清YKL-40與CD40水平兩組間比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)者，進一步與發(fā)表年齡、病程及UMSARS Ⅱ評分行相關性分析。

1.3 統(tǒng)計學處理 采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件包進行分析。符合正態(tài)分布的計量資料以均數(shù)±標準差表示，兩組間比較采用t檢驗；非正態(tài)分布的計量資料以中位數(shù)(四分位數(shù)間距)表示，兩組間比較采用Mann-WhitneyU檢驗；計數(shù)資料組間比較采用Pearsonχ2檢驗；對照組血清YKL-40水平與年齡的相關性分析采用Pearson相關分析；病例組血清YKL-40水平與發(fā)病年齡、病程、UMSARS II評分的相關性分析采用Spearman相關分析；血清YKL-40 水平對MSA的診斷價值評估采用接受者操作特性曲線(ROC曲線)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 病例組與對照組血清YKL-40、CD40水平的比較 對照組男、女間血清YKL-40水平比較差異無統(tǒng)計學意義〔(36.23±9.74)ng/mL vs.(36.50±10.86)ng/mL；t=0.519，P=0.477〕。病例組MSA-C型血清YKL-40水平中位數(shù)(四分位數(shù)間距)為40.67(13.09)ng/mL，MSA-P型為38.24(9.90)ng/mL，兩者間比較差異無統(tǒng)計學意義(U=104.00，P=0.739)。與對照組比較，病例組血清YKL-40水平降低(P=0.002)，而兩組間CD40水平比較差異無統(tǒng)計學意義(P=0.871)。結果見表1。

表1 兩組血清YKL-40和CD40水平比較〔n=30，Md(QR)〕

組別YKL?40(ng/mL)CD40(pg/mL)病例組3832(1174)12039(3947)對照組4721(1388)11612(3585)t值2380043900P值00020871

2.2 血清YKL-40水平與各因素的相關性分析 對照組血清YKL-40水平與年齡無明顯相關性(r=-0.065，P=0.731)；病例組UMSARS Ⅱ評分為12～36分，平均(24.20±6.43)分，病例組血清YKL-40水平與MSA發(fā)病年齡(r=0.111，P=0.560)、病程(r=-0.240，P=0.201)、UMSARS Ⅱ評分(r=-0.248，P=0.186)均無明顯相關性。

2.3 血清YKL-40對MSA的診斷價值評估 ROC曲線下的面積(AUC)為0.264(P=0.002，圖1)，AUC<0.5表明血清YKL-40水平對MSA無明確診斷價值。

圖1 MSA患者血清YKL-40診斷的ROC曲線

3 討論

目前，MSA的病因及致病過程仍不明確，缺乏與疾病進程密切相關的生物標記物。本研究觀察MSA患者的血清YKL-40、CD40水平，旨在尋求MSA的潛在生物標記物。

在MSA疾病早期，少突膠質細胞中出現(xiàn)p25α蛋白的聚集，這是一種與髓鞘形成相關的促微管聚合蛋白，是少突膠質細胞特有的磷酸化蛋白。它的聚集促成了α-syn的異常沉積[4]，兩者的共同表達可促進轉錄因子(IκBα)的表達，進一步誘導NF-κB的表達。NF-κB/Rel蛋白家族是傳遞應激信號的體系，胞質IκBα抑制蛋白可對其進行負調節(jié)[5]。2014年Kragh等[1]的研究顯示，轉錄因子IκBα的沉默可顯著增強p65亞基的核轉運以及NF-κB系統(tǒng)激活，進而抑制了α-syn和p25α蛋白的共表達，從而實現(xiàn)對少突膠質細胞的保護作用。

YKL-40是糖基水解酶18家族的一員[6]，與星形膠質細胞和小膠質細胞的遷移、反應性神經膠質細胞增多有關，是神經膠質細胞激活的標記物[7]。炎性因子TNF-α和IL-1β的分泌，可激活NF-κB信號轉導體系，進而誘導YKL-40的表達[8-9]。YKL-40表達上調可出現(xiàn)于許多神經系統(tǒng)疾病中，如多發(fā)性硬化、亨廷頓舞蹈病、阿爾茨海默病等[7]，其中，以惡性膠質瘤最受關注[10]。Recklies等發(fā)現(xiàn)軟骨細胞中，炎性細胞因子TNF-α和IL-1β可通過NF-κB信號轉導體系的作用誘導YKL-40的轉錄和翻譯[ 9]。此外，YKL-40也可調控NF-κB體系的功能，骨骼肌細胞中，YKL-40通過抑制NF-κB的激活進而阻斷TNF-α引發(fā)的炎性反應[11]。Olsson等[12]的研究顯示腦脊液(CSF)中YKL-40的表達在α-突觸核蛋白病(如帕金森病、MSA)中明顯低于在tau蛋白病(如皮質基底節(jié)變性、進行性核上性麻痹)中的表達，推測可能因為α-突觸核蛋白病的神經膠質細胞反應活性降低。

本研究中發(fā)現(xiàn)雖然MSA患者血清YKL-40水平較健康人降低，卻與MSA患者的發(fā)病年齡、病程及病情嚴重程度無相關性，這可能由于YKL-40的廣泛組織源性，血清YKL-40多來自外周單核細胞/巨噬細胞，不能準確代表中樞神經系統(tǒng)的YKL-40表達；也可能是血清YKL-40的改變并不能反映MSA的疾病進展。然而，既往研究顯示CSF中YKL-40水平比血清中高7倍[12]，作為神經細胞生存的內環(huán)境，可能以CSF為載體的研究更具有前景。此外，本研究中ROC曲線下的面積<0.5，也提示血清YKL-40對MSA的診斷沒有價值。綜上可見，血清YKL-40并不能成為MSA的生物標記物。

CD40是腫瘤壞死因子受體超家族的一員，相對分子質量約45 000～50 000，與配體CD40L(又名CD154)相互作用在細胞免疫和體液免疫中發(fā)揮著重要作用，其異常表達于多發(fā)性硬化、阿爾茨海默病及腦血管疾病等疾病[13]。CD40在巨噬細胞或小膠質細胞中的表達與NF-κB反應體系的激活密切相關[13-14]。在小膠質細胞中，細胞因子IFN-γ誘導TNF-α表達，進一步激活NF-κB反應體系，使NF-κB轉錄因子核易位并結合于CD40啟動子上承載的3個NF-κB結合位點，CD40得以表達[13-14]。然而，這一炎性反應過程是否涉及到MSA的疾病進程仍不清楚，尚需進一步研究。

目前，尚無關于CD40表達與MSA相關性的研究見諸報道。本研究未發(fā)現(xiàn)在MSA患者和健康人之間血清CD40表達存在差異，以后可以進一步探究CSF甚至特定部位腦組織(如殼核、腦橋、小腦等)的CD40表達與MSA發(fā)生是否相關。

本研究發(fā)現(xiàn)，血清YKL-40、CD40水平均對MSA沒有診斷價值，兩個指標在MSA病理進程中的變化與作用仍需多部位(如CSF、特定腦區(qū))、大樣本臨床研究以及涉及信號轉導通路的探索明確。

[1]Kragh CL, Gysbers AM, Rockenstein E, et al. Prodegenerative IkappaBalpha expression in oligodendroglial alpha-synuclein models of multiple system atrophy[J]. Neurobiol Dis, 2014, 63:171-183.

[2]Gilman S, Wenning G K, Low P A, et al. Second consensus statement on the diagnosis of multiple system atrophy[J]. Neurology, 2008, 71(9): 670-676.

[3]Krismer F, Seppi K, Tison F, et al. The Unified Multiple System Atrophy Rating Scale: intrarater reliability[J]. Mov Disord, 2012, 27(13): 1683-1685.

[4]Lindersson E, Lundvig D, Petersen C, et al. p25alpha Stimulates alpha-synuclein aggregation and is co-localized with aggregated alpha-synuclein in alpha-synucleinopathies[J]. J Biol Chem, 2005, 280(7): 5703-5715.

[5]Papa S, Zazzeroni F, Pham CG, et al. Linking JNK signaling to NF-kappaB: a key to survival[J]. J Cell Sci, 2004, 117(Pt 22): 5197-5208.

[6]Shao R, Francescone R, Ngernyuang N, et al. Anti-YKL-40 antibody and ionizing irradiation synergistically inhibit tumor vascularization and malignancy in glioblastoma[J]. Carcinogenesis, 2014, 35(2): 373-382.

[7]Vinther-Jensen T, Budtz-Jorgensen E, Simonsen A H, et al. YKL-40 in cerebrospinal fluid in Huntington's disease - A role in pathology or a nonspecific response to inflammation?[J]. Parkinsonism Relat Disord, 2014, 20(11): 1301-1303.

[8]Bhat KP, Pelloski CE, Zhang Y, et al. Selective repression of YKL-40 by NF-kappaB in glioma cell lines involves recruitment of histone deacetylase-1 and -2[J]. FEBS Lett, 2008, 582(21-22): 3193-3200.

[9]Recklies AD, Ling H, White C, et al. Inflammatory cytokines induce production of CHI3L1 by articular chondrocytes[J]. J Biol Chem, 2005, 280(50): 41213-41221.

[10]Francescone RA, Scully S, Faibish M, et al. Role of YKL-40 in the angiogenesis, radioresistance, and progression of glioblastoma[J]. J Biol Chem, 2011, 286(17): 15332-15343.

[11]Gorgens SW, Eckardt K, Elsen M, et al. Chitinase-3-like protein 1 protects skeletal muscle from TNFalpha-induced inflammation and insulin resistance[J]. Biochem J, 2014, 459(3): 479-488.

[12]Olsson B, Constantinescu R, Holmberg B, et al. The glial marker YKL-40 is decreased in synucleinopathies[J]. Mov Disord, 2013, 28(13): 1882-1885.

[13]Benveniste EN, Nguyen VT, Wesemann DR. Molecular regulation of CD40 gene expression in macrophages and microglia[J]. Brain Behav Immun, 2004, 18(1): 7-12.

[14]Goel C, Kalra N, Dwarakanath B S, et al. Per a 10 protease activity modulates CD40 expression on dendritic cell surface by NF-kappaB pathway[J]. Clin Exp Immunol, 2015,180(2):341-351.

(本文編輯：鄒晨雙)

Research on serum YKL-40，CD40 and relative factors in patients with multiple system atrophy

CHENJianwen,ZHOUJingyuan,ZHANGKaihua,GAOSong,ZHAOLi,DONGChunbo*.

*DepartmentofNeurology,theFirstAffiliatedHospitalofDalianMedicalUniversity,DalianLiaoning116011,China

Corresponding author: DONG Chunbo, Email：dcb101@sina.com

Objective To detect the difference of serum YKL-40 and CD40 between multiple system atrophy (MSA) patients and healthy people and the correlation of serum YKL-40 and CD40 with onset age, disease duration and severity in MSA patients.Methods According to the 2008 diagnostic criteria of MSA revised by Gilman et al, 30 MSA inpatients were diagnosed from MAR.1, 2013 to NOV.30, 2014 and included in the study. And 30 healthy age- and gender- matched subjects were enrolled as healthy controls. 24 cases were diagnosed as probable MSA and 6 were possible MSA. With the Unified Multiple System Atrophy Rating Scale (UMSARS) Part Ⅱ, we evaluated the clinical status of each MSA patient. The concentration of serum YKL-40 and CD40 were detected by enzyme linked immunosorbent assay(ELISA). The levels of serum YKL-40 and CD40 were detected in MSA patients and healthy controls, and their relationship with gender, age, onset age, duration and UMSARS Ⅱ scores of MSA patients were analyzed. Results Serum levels of YKL-40 of the MSA patients were significantly lower [38.32(11.74) ng/mL] than those of the healthy controls [(47.21(13.88)ng/mL,t=238.00,P=0.002]. However, no significant correlation was observed between serum YKL-40 level and onset age (r=0.111,P=0.560), duration (r=-0.240,P=0.201) or UMSARS Ⅱ score (r=-0.248,P=0.186) in MSA patients. Receiver operating characteristic (ROC) curve analysis indicated that serum YKL-40 level lack the diagnostic value for MSA (AUC=0.264,P=0.002). There was no significant difference in serum CD40 concentration between MSA patients [120.39 (39.47) pg/mL] and healthy controls [116.12 (35.85) pg/mL,t=439.00,P=0.871]. There were no significant differences in serum YKL-40 levels between male and female in the control group [(36.23±9.74) ng/mL，(36.50 ±10.86)ng/mL，t=0.519，P=0.477)], and between MSA-C type and MSA-P [(40.67(13.09)ng/mL，38.24(9.90)ng/mL，U=104.00，P=0.739)] in the MSA group. Conclusions Serum YKL-40 concentration is significantly lower in MSA patients than that in healthy controls. There is a speculation that YKL-40 expression is changed under the condition of MSA. There is no correlation between YKL-40 level and onset age, duration, or UMSARSⅡ score.

multiple system atrophy；YKL-40；CD40；biomarker

10.3969/j.issn.1006-2963.2016.06.001

116011,大連醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院：神經內科(陳建文、周靖媛、張凱華、趙莉、董春波)，藥局(高松)

董春波，Email：dcb101@sina.com

R742

A

1006-2963(2016)06-0385-04

2015-04-17)